一種溫度適性廣的中性脂肪酶lipg及其基因和應用的製作方法

2023-09-19 05:37:10

專利名稱：一種溫度適性廣的中性脂肪酶lipg及其基因和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種溫度適性廣的中性脂肪酶LIPG及其基因和應用。
背景技術：
脂肪在畜禽體內的作用主要是氧化供能，它含有的能量是碳水化合物的2. 25倍，可滿足動物體對較高能量濃度的要求。脂肪是脂溶性維生素和某些激素的溶劑，促進對這些物質的吸收和利用，同時為畜禽提供必需的不飽和脂肪酸，保證畜禽的健康生長；添加脂肪還可減少飼料加工過程中的粉塵，改善飼料外觀，在高溫條件下，還有利於提高能量攝入量，降低畜禽的體熱增耗，減緩熱應激；此外，添加脂肪可有效地提高飼料的適口性。因此，在豬、雞和奶牛飼料中添加脂肪是比較普遍的作法。脂肪酶(lipase),也稱為三脂醯甘油水解酶(triacylglycerolhydrolase, EC
3.11. 3)，能夠分解生物產生的各種天然的油和脂肪，自然界中廣泛存在。脂肪酶是脂肪代謝最基本的酶，若缺乏將會危及機體健康。單胃動物自身能夠分泌內源性消化酶，包括澱粉酶、蛋白酶、脂肪酶等。但幼禽、幼畜消化機能尚未發育健全，內源性消化酶分泌量不足。在現代養豬生產中，早期斷奶甚至超早期斷奶在養豬生產中普遍實施，但早期斷奶後，幼畜消化酶分泌產生不良影響，消化酶分泌急劇減少，斷奶2周後才逐漸恢復並增加。斷奶後2周內消化酶分泌不足是斷奶仔豬生長阻滯的主要因素之一；雛雞大多數消化酶在2周齡左右才發育到高峰，因此，消化酶分泌不足也是雛雞對飼料利用的主要限制因素之一。在幼禽、幼畜日糧中添加外源性澱粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，能補充體內內源酶的不足，並能減輕斷奶仔豬的斷奶應激，提高動物的生產性能。有研究表明，外源性脂肪酶可提高飼料中的脂肪消化率，可提飼料的表觀代謝能值和飼料轉化率。脂肪酶應用在不同領域中的選擇性是基於它的底物特異性、位置特異性、定向性、溫度和PH特性等。和大部分飼養酶製劑一樣，應用在飼料行業的脂肪酶需要具備一些特殊的性質。真正適合在飼料中使用的脂肪酶，必須具有好的熱穩定性而同時在常溫下具有高活性；最適PH在酸性同時在整個酸性和中性的pH範圍內又能維持較高的活性；對動物胃、胰蛋白酶和別的蛋白酶都具有較好的抗性等綜合性質。對於淡水養殖的主要魚類-鯉科魚類來說，因為它們沒有胃，只有pH值呈中性(pH6. 5 8.0)的腸道，因而與其他畜禽飼料添加的脂肪酶相比，在魚類飼料中添加的脂肪酶必需使用在中性PH值條件下。另外由於水產養殖環境得水體溫度一般在0-30°C之間，投放到養殖池塘的脂肪酶需要在低溫具有較高的活性。而到目前為至，幾乎沒有在低溫及中性的環境下具有高酶活性脂肪酶的報導。因此，開發溫度適應性廣的中性脂肪酶具有較好的科學理論價值，也具有較大的應用潛力和產業價值。

發明內容
本發明的目的是提供一種能高效應用於淡水魚類的溫度適性廣的高溫中性脂肪酶。本發明的再一目的是提供編碼上述溫度適性廣的中性脂肪酶的基因。本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。本發明的另一目的是提供一種製備上述溫度適性廣的中性脂肪酶的基因工程方法。本發明的另一目的提供上述溫度適性廣的高溫中性脂肪酶的應用。本發明提供了一種溫度適性廣的高溫中性脂肪酶LIPG，其胺基酸序列如SEQ IDN0. I 所示。MRRGIVSTIT IVSVLAGILff LGGFAMGIQD QFFSAAMPPA GTTKYTKEKKADNREIYIVA 60LGDSLTRGTG DESGKGYIGY MVDSLRKKTT KPIRVTNLAI KGQRSDGLLKQLGQAEIKRQ 120LKMADIIVMT IGGNDLFQGG EALKLAPKQI EQAKNAYLHN LDRIFQTIRSVNKDA WFYI 180GLYNPFSDLG DAKKTSAIVR QffNFASAETA ARYPNIIAVP IFDLFELHVNDYLYSDHFHP 240NKEGYKRIGE RVASLITffTE EDKQ264本發明提供了編碼上述溫度適性廣的高溫中性脂肪酶的基因LipG。具體地，該基因的基因組序列如SEQ ID NO. 2所不。atgagacgcg gtattgtaag caccatcacg attgtatccg tgctggcggg aatattatgg 60cttggcggtt ttgccatggg cattcaagat caattttttt ccgccgcgat gccgccagca 120ggcacgacga aatatacaaa agagaaaaaa gcggacaacc gtgaaattta cattgtcgct 180cttggcgact cgctgacaag gggaacggga gacgaaagcg gaaaagggta tattggctat 240atggtcgatt ctctccgtaa aaaaacaacg aaaccgattc gtgtaacaaa cttggctatt 300aaaggacagc gatctgacgg actccttaag caattaggac aagctgagat aaagaggcag 360ctaaaaatgg ctgacatcat cgtgatgacg atcggcggga atgatttgtt tcaaggcgga 420gaagcgctaa agcttgcgcc aaagcaaatc gagcaggcaa aaaacgcgta tttacacaac 480ttagaccgta tttttcaaac gattcgcagc gtcaataaag atgcagttgt tttttacatc 540gggctttaca atccgtttag cgacctcggt gacgcaaaga agacatccgc gatcgtaagg 600cagtggaatt ttgcttcggc agaaacggca gctcgctatc caaatatcat tgctgtgccg 660atattcgatt tgtttgagct tcatgtgaat gattatttgt acagcgacca tttccatccg 720aataaggaag gctataaacg cattggcgaa cgtgtcgctt ctttaattac gtggacggag 780gaggacaaac aatga795本發明還提供了包含上述溫度適性廣的高溫中性脂肪酶的基因LipG的重組載體，優選為 pET-28a-LipG。本發明還提供了包含上述溫度適性廣的高溫中性脂肪酶的基因LipG重組菌株，優選所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌。本發明還提供了一種製備溫度適性廣的高溫中性脂肪酶LIPG的方法，包括以下步驟I)用上述的重組載體轉化宿主細胞，得到重組菌株；2)培養重組菌株，誘導重組脂肪酶表達；以及3)純化所表達的脂肪酶LIPG。本發明還提供了上述脂肪酶LIPG的應用。本發明獲得一種溫度適性廣的高溫中性脂肪酶，pH6. 5 8. 5的範圍內均具有高的酶活性，其在25V 80°C的範圍內均具有高的酶活性，最適溫度為70°C，並且在30°C時仍然具有約60%的脂肪酶活性；同時該脂肪酶還具有極好的熱穩定性，90°C處理半小時仍然具有70%的酶活性剩餘，因此其可以有效地抵禦飼料制粒的高溫。這些性質使其適用於淡水魚類飼料中。同時該脂肪酶又具有非常寬廣的溫度適應性，在25°C 80°C的範圍內均具有高的酶活性。儘管最適溫度是65°C，但該脂肪酶在30°C時仍然具有約60%的脂肪酶活 性。


圖I、重組脂肪酶的純化。圖2、重組脂肪酶的最適pH。圖3、重組脂肪酶的pH穩定性。圖4、重組脂肪酶的最適溫度。圖5、重組脂肪酶的熱穩定性。
具體實施例方式實驗條件I、菌株及載體Geobacillus sp. B2分離於浙江嘉興人工魚塘底泥樣品。大腸桿菌 Escherichia coli BL21 (DE3)、表達載體 pET_28a(+)(購自 Novagen 公司)。2、酶類及其他生化試劑內切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自NEB公司。IPTG、對-棕櫚酸硝基苯酯(PNPP)等底物購自Sigma公司，其它都為國產試劑。3.培養基嗜熱地芽孢桿菌及大腸桿菌培養基為LB (I%蛋白腖、0.5%酵母提取物、1% NaCl，pH 7. 0)。本發明中所用到重組遺傳學技術均為本領域中的常規技術。在以下實施例中未作詳細介紹的技術，均按照以下實驗手冊或文獻中的相關章節或部分來進行，包括=Samtoook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 3 版 2001);和 CurrentProtocolsin Molecular Biology (Ausubel 等人編，1994)。實施例I、嗜熱地芽孢桿菌脂肪酶編碼基因LipG的克隆及表達嗜熱地芽孢桿菌(Geobacillus sp. B2)來源於浙江嘉興人工魚塘底泥樣品。以Geobacillus sp. B2菌株基因組DNA為模板,利用設計的脂肪酶兩端的引物,Lipase-f ATGAGACGCGGTATTGTAAGCAC ；Lipase-r TCATTGTTTGTCCTCCTCCGTC,進行 PCR 擴增，經測序分析後，最終得到一個完整的脂肪酶基因，LipG。該脂肪酶基因以ATG為起始密碼子，由795個鹼基組成，編碼264個胺基酸和一個終止密碼子TGA。
根據基因的序列設計擴增植酸酶基因成熟蛋白序列的表達引物LipG-mF和LipG-mR(5' -CGGAATTCATGAGACGCGGTATTGTAAGCAC-3' ,5' -ATTTGCGGCCGCTCATTGTTTGTCCTCCTCCGTC-3')，並在引物LipGiF的末端引入酶切位點EcoRI，在引物LipGiR的末端引入Notl，以Geobacillus sp. B2菌株基因組DNA為模板，進行脂肪酶基因的PCR擴增。PCR反應循環條件為94°C5min ；94°C 30s,55°C 30s,72°C lmin，30 個循環；72°C 5min。膠回收 PCR產物並用EcoRI和NotI雙酶切，然後與大腸桿菌表達載體pET28a(+)連接，構建表達載體pET28a-LipG，利用電 轉化方法轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得重組菌株pET28a_LipG/DE3。取含有重組質粒的BL21 (DE3)菌株和含有pET_28a(+)空質粒的BL21 (DE3)菌株(作對照)，分別接種於3mL LB (加有100 u g/mL的氨苄青黴素)培養液中，37°C條件下快速振蕩培養過夜；按照1/100體積接種過夜培養液於含有IOOu g/mL氨苄青黴素的20mLLB培養液中(IOOmL三角瓶)，快速振蕩培養約2h (OD600達到0. 6)，加入終濃度為ImM的誘導劑IPTG，振蕩培養8h，使其表達目的蛋白。取培養液，10，OOOrpm離心5min，收集菌體沉澱。採用超聲波破碎菌體，對破碎的菌體進行脂肪酶活性的測定和SDS-PAGE電泳的方法驗證脂肪酶基因LipG在大腸桿菌中的表達。實施例2、脂肪酶的活性分析方法測定原理脂肪酶在一定溫度和pH條件下，水解底物pNPP，生成黃顏色的pNP。在一定濃度範圍內，生成PNP的量和反應液的410nm處吸光值呈線性關係。據此可以通過測定反應液的410nm吸光值計算脂肪酶活力。 測定步驟底物溶液A 90mg對-棕櫚酸硝基苯酯(pNPP)溶於30mL異丙醇；緩衝溶液B 50mmol/LTris-cl (pH8. 0)。取2個試管，分別是對照管和樣品管。將兩試管中各加入溶液B 1.8mL及0. Iml底物溶液A，37°C水浴保溫5min，然後在對照管中加入已滅活的酶液0. lmL，樣品管中加入酶液0. lmL，立即混勻計時，在水浴中準確反應IOmin後加入0. 5mL10%三氯乙酸溶液終止反應，再加入0.5mL 10% Na2CO3溶液顯色。410nm分光光度計下測定酶催化產生的對-硝基酚的吸收值。脂肪酶I個酶活單位定義在pH 7. 5，37°C條件下，以每分鐘釋放I U mo I對硝基酹(p-nitrophenol)所需的酶量為I個酶活力單位(U)。實施例3重組植酸酶的純化獲得的陽性克隆按常規的方法進行搖瓶培養，經IPTG誘導後，收集菌體細胞，並採用超聲波破碎細胞。細胞破碎液上清，經離心處理後，用鎳柱親和層析的方法，對目標蛋白進行純化。根據NEB的裝柱說明書將ImL的NTA柱質加到空柱子中，並準備如下pH 7. 6緩衝液l)NTA-0,20mmol/L Tris-HCl ；0. 5mol/L NaCl ；10% (w/v)甘油；2)NTA-20,20ramol/L Tris-HCl ；20mmol/L 咪唑；0. 5mol/L NaCl ；10% (w/v)甘油；3)NTA-40,20ramol/L Tris-HCl ；40mmol/L 咪唑;0. 5mol/L NaCl ；10% (w/v)甘油；4)NTA-60,20ramol/L Tris-HCl ；60mmol/L 咪唑；0. 5mol/L NaCl ；10% (w/v)甘油；5)NTA-80,20ramol/L Tris-HCl ；80mmol/L 咪唑；0. 5mol/L NaCl ；10% (w/v)甘油；6)NTA-100,20mmol/L Tris-HCl ；100mmol/L 咪唑；0. 5mol/L NaCl ；10% (w/v)甘油；7)NTA-200,20mmol/L Tris-HCl ；200mmol/L 咪唑；0. 5mol/L NaCl ；10% (w/v)甘油。具體純化步驟是
I)粗酶液溶於用NTA-O溶液中用於鎳柱純化；2)菌體部分經過離心後加入NTA-O溶液重懸，12，OOOrpm離心IOmin去上清，然後用5mL NTA-O重懸細胞(約200mL培養物所得到的細胞)。超聲破碎條件為冰浴中破碎，破碎3sec停止4sec每組80次。13，OOOrpm離心15min。仔細吸取上清液作為上柱樣品；3)柱子用10_20mL水平衡，每次加5mL待流淨後再加；4)再用15-20mL NTA-O平衡，加樣品5mL並開始收集穿透峰；5) 20-25mL NTA-O 洗脫去雜蛋白，然後依次加入 NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-80、NTA-100、NTA-200、NTA-300每種緩衝液5mL洗脫並收集洗脫液；然後對收集管中的溶液測酶活及蛋白電泳分析。如圖I所示，顯示得到了電泳純脂肪酶。 實施例4脂肪酶酶學性質的研究最適反應pH值及pH穩定性的測定以純化的重組脂肪酶LipG為材料，在不同的pH的緩衝體系中進行脂肪酶活性的測定。底物PNPP用一系列不同pH值的緩衝液(pH5. 0-6. 5，乙酸緩衝液；pH 6. 5-7. 5，PBS緩衝液;PH 7. 5-8. 5，Tris-HCl緩衝液；pH 8. 5-10. OGly-NaOH)配製，37°C下在這些不同的緩衝體系中進行酶促反應，測定酶活性。結果表明，該酶的最適PH為7. 5，在pH 6. 5-8. 5範圍內，具有明顯的脂肪酶活性。pH在5. 0以下及10以上，檢測不到脂肪酶活性，說明該酶在中性偏鹼條件下具有脂肪酶活性(圖2)。將純化的重組脂肪酶LipG在不同pH緩衝液，37°C處理Ih後，並在37°C，pH 7.5條件下測定剩餘的脂肪酶活性，來研究酶在不同PH條件下的穩定性。各pH值條件下的測定重複3次，取平均值。結果表明重組脂肪酶在pH 3-12時，都比較溫度，其中在鹼性條件下比在酸性條件下穩定。在PH12的緩衝液中處理I小時，酶活性基本不損失(圖3)。最適反應溫度及熱穩定性以純化的重組脂肪酶LipG為材料，在不同溫度下進行酶促反應後，測定其酶活性，得到其最適反應溫度。對LipG在20°C到80°C，每隔5°C測定其活性。每次測定重複3次，取平均值。結果表明，重組脂肪酶LipG的最適反應溫度是65°C，溫度在低於65°C時，隨著溫度升高酶活性逐步上升，高於65°C酶活力迅速下降，但到80°C時仍有最高活力的75%(圖 4)。熱穩定性是將酶液先在不同溫度下處理3小時，再進行酶活性測定以研究酶的溫度穩定性。在70°C、80°C和90°C下，分別處理酶液，處理時間為0. 5h、lh、l. 5h、2. Oh、2. 5h與3. 0h，處理後在37°C測定其剩餘的脂肪酶活力。結果表明，重組脂肪酶LipG具有非常好的熱穩定性，完全可以抵制在飼料加工時的高溫制粒的過程。在90°C處理半小時後，還有90%的活性剩餘；即使在90°C處理3小時，也還有約74%的脂肪酶活力剩餘(圖5)。
權利要求
1.一種溫度適性廣的高溫中性脂肪酶LIPG，其特徵在於，其胺基酸序列如SEQID NO. I所示。
2.一種溫度適性廣的高溫中性脂肪酶的基因LipG，其特徵在於，編碼權利要求I所述的脂肪酶。
3.如權利要求2所述的脂肪酶的基因LipG，其特徵在於，其鹼基序列如SEQIDN0.2所 示。
4.包含權利要求2所述脂肪酶的基因LipG的重組載體pET-28a-LipG。
5.包含權利要求2所述脂肪酶的基因LipG的重組菌株。
6.根據權利要求5所述的重組菌株，其特徵在於，所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌。
7.一種製備溫度適性廣的高溫中性脂肪酶LIPG的方法，包括以下步驟 1)用權利要求4所述的重組載體轉化宿主細胞，得到重組菌株； 2)培養重組菌株，誘導重組脂肪酶表達；以及 3)純化所表達的脂肪酶LIPG。
8.權利要求I所述的溫度適性廣的高溫中性脂肪酶LIPG的應用。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種溫度適性廣的中性脂肪酶LIPG及其基因和應用。本發明提供了一種溫度適應性廣的中性脂肪酶LIPG，及其胺基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明獲得中性脂肪酶，其在pH6.5～8.5的範圍內均具有高的酶活性，其在25℃～80℃的範圍內均具有高的酶活性，最適溫度為65℃，並且在30℃時仍然具有約60％的脂肪酶活性；同時該脂肪酶還具有極好的熱穩定性，90℃處理半小時仍然具有90％的酶活性剩餘，因此其可以有效地抵禦飼料制粒的高溫。這些性質使其適用於淡水魚類飼料中。
文檔編號C12N15/55GK102732490SQ201110081828
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月1日 優先權日2011年4月1日
發明者張菁, 詹志春 申請人:武漢新華揚生物股份有限公司