一種從淡水珍珠蚌肉中提取膠原蛋白的工藝方法
2023-09-19 05:44:20 1
一種從淡水珍珠蚌肉中提取膠原蛋白的工藝方法
【專利摘要】本發明公開了一種從淡水珍珠蚌肉中提取膠原蛋白的工藝方法，選取普通河流、湖泊中養殖的珍珠蚌為原料，去掉外殼、剪下斧足、冷幹、切碎，經Tris-HCl、NaOH處理，用醋酸浸泡，加入胃蛋白酶，在不同功率的超聲條件下提取48h，粗提取的膠原蛋白溶液用鹽析純化，冷幹，提取率高達35%。此工藝操作簡單，生產條件容易控制，安全可靠，生產效率高，成本低。提取的膠原蛋白用途廣，可用於化妝品行業、食品行業、皮革製造業、造紙業、製藥業、醫學等行業，具有很高的利用價值和經濟、社會效益。
【專利說明】ー種從淡水珍珠蚌肉中提取膠原蛋白的エ藝方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及從淡水雙貝殼類動物體中製取膠原蛋白的方法エ藝，尤其涉及從珍珠蛘斧足中提取膠原蛋白的エ藝方法。
技術背景
[0002]珍珠蛘是瓣鰓綱軟體動物，其外殼長可達200mm，外形呈角突卵圓形，兩殼膨脹，喜生活在淤泥底及水流緩慢、靜止的水域中，常在湖泊、河流、水庫、池塘內可見，肉可以吃，同常被用作禽類的天然餌料及飼料。
[0003]膠原蛋白是ー種生物性纖維類高分子蛋白，白色、不透明、無支鏈，在哺乳動物及水生動物的皮、骨、鱗片、軟骨、韌帶、肌腱等大量存在，大約有18-19種，根據其來源總共可分為四類膠原蛋白:I型、II型、III型、IV型。I型膠原是從皮膚和骨骼中提取得到的，II型膠原是從軟骨組織中分離得到的，III型膠原是從胚胎中分離得到的，IV型膠原是從細胞底膜中分離提取得到的。
[0004]膠原蛋白是ー種結構性蛋白，由三股右手螺旋的多肽鏈盤繞摺疊形成ー種右手螺旋結構，即由甘氨酸-脯氨酸-羥脯氨酸、甘氨酸-脯氨酸-Y、甘氨酸-X-Y這些3肽的重複片段摺疊形成。經過酸、鹼、酶的處理後這些三螺旋結構就會鬆開，分成三條肽鏈，從而利於膠原蛋白的提取。膠原蛋白具有一般蛋白質的化學性質，能發生氨基反應、羧基反應、呱基反應、甲硫基反應、羥基反應、顯色反應，與金屬離子及表面活性劑作用等。
[0005]膠原蛋白是ー種功能性蛋白質，具有高度抗張能力，在動物細胞中起結締組織的作用，在生物學功能方面，促進傷ロ癒合、止血、骨骼癒合，增強皮膚代謝等。當免疫蛋白與膠原蛋白結合時，可以顯著提高人體的免疫機能。目前膠原蛋白的主要來源為陸生動物，如豬、牛、羊等，但隨著膠原蛋白需求量的增加以及各種禽類疾病的爆發，人們對陸生動物膠原蛋白的使用安全問題產生了`懷疑，現有的膠原蛋白已不能滿足現代人對膠原蛋白產量及質量的要求，所以尋找新的膠原蛋白來源，成為當今社會膠原蛋白行業普遍關注的問題，而我國水產資源豐富，從水生動物體內提取膠原蛋白成為膠原蛋白的主要來源。河蛘在平常水域中經常可見，特別是珍珠蛘養殖量大，取珠後的珍珠蛘經常隨意丟棄或成為家禽的天然飼料，這樣不僅造成了環境汙染而且造成了極大的浪費，如果從蛘肉中提取膠原蛋白，不僅減少了環境汙染還可以提高珍珠蛘的利用價值，因此從珍珠蛘中提取膠原蛋白是值得探索和有意義的。
【發明內容】
[0006]本發明涉及ー種從淡水珍珠蛘中提取膠原蛋白的エ藝方法，充分利用了蛘肉，提高了珍珠蛘的附加值。
[0007]本發明是這樣來實現的，所述エ藝方法包括下述步驟:
ー種從淡水珍珠蛘肉中提取膠原蛋白的エ藝方法，所述エ藝方法包括以下步驟:
a、原材料製備:(I)將淡水珍珠蛘肉放在_80°C冰箱中冷凍24h ；(2)將冷凍後的蛘肉在冷凍乾燥箱中冷凍乾燥，直到去除表面水分為止；
b、原材料的預處理:(I)將冷幹後的蛘肉切碎，在50倍體積的預處理液中去除脂肪及內源性膠原蛋白，維持恆定溫度為4-8°C ；(2)用20mM Tris-HCl, pH 8.0的溶液浸泡24h,每8h更換一次浸泡液；(3)將Tris-HCl處理後的原料用0.1M NaOH浸泡24h，每8h更換一次浸泡液；(4)將經NaOH處理後的原材料經濾網過濾，然後用超純水充分洗滌過濾後的蛘肉，然後過濾，直到濾液呈中性或微鹼性為止，最後一次水洗後，用冷凍離心機離心，12000r/min, 20min, 4°C,去掉上清液,得到沉澱；
C、酶解-超聲波破碎:將預處理後的蛘肉溶解在0.5M的醋酸溶液中，按照胃蛋白酶與冷幹的蛘肉的質量比3:100的配比，加入胃蛋白酶，在室溫下，用超聲波處理此溶液，採用處理30min，暫停30min的方式，連續處理2d;
d、分離:將得到的超聲破碎液用冷凍離心機離心，得到上清液；
e、二次提取:將離心所得的沉澱再次用c步驟所述方法超聲破碎提取，離心，取得上清液，將沉澱去掉；
f、合併:將兩次離心所得上清液合併在一起；
g、提純:向上清液中加入2M的NaCl溶液，使上清液中NaCl的最終濃度為0.9M，並在4°C冰箱中靜置過夜；
h、二級分離:將上述溶液高速冷凍分離，所得沉澱即為初步純化的膠原蛋白沉澱；
1、透析:將得到的沉澱溶解於0.5M醋酸溶液中，在4°C下用去離子水透析3天。
[0008]j、離心:將透析後的溶液高速冷凍離心，12，000r/min，30 min,所得沉澱為最後純化的膠原蛋白。`
[0009]k、冷凍乾燥:將取得的純的膠原沉澱冷凍乾燥處理，在_80°C的冰箱中保存。
[0010]步驟c中所述的胃蛋白酶為豬胃蛋白酶，所述的超聲波的功率20W-52W，振幅20-40%o
[0011]本發明的技術效果是，本發明通過超聲-酶解技木，使肌肉細胞破碎，使膠原蛋白在相同的時間內充分溶解至醋酸溶液中，從而得到的膠原蛋白產量更高，溶解度更高，同時提高了膠原蛋白的生產效率，為膠原蛋白的エ業化生產提高了效益。【具體實施方式】
實施例1
從淡水珍珠蛘肉中提取膠原蛋白的エ藝方法，所述エ藝方法包括以下步驟:
a、原材料製備:(I)將淡水珍珠蛘肉放在_80°C冰箱中冷凍24h；(2)將冷凍後的蛘肉在冷凍乾燥箱中冷凍乾燥，直到去除表面水分為止；
b、原材料的預處理:(I)取3g冷幹的珍珠蛘肉，用剪刀剪成小片段，在50倍體積的預處理液中去除脂肪及內源性膠原蛋白，維持恆定溫度為4-8°C ;(2)用20mM Tris-HCl, pH
8.0的溶液浸泡24h，每8h更換一次浸泡液；(3)將Tris-HCl處理後的原料用0.1M NaOH浸泡24h，每8h更換一次浸泡液，溫度恆定在4-8°C ；
(4)將經NaOH處理後的原材料經濾網過濾，然後用超純水充分洗滌過濾後的蛘肉，然後過濾，直到濾液呈中性或微鹼性為止，最後一次水洗後，用冷凍離心機離心，12000r/min，20min, 4°C，去掉上清液，得到沉澱；
C、酶解-超聲波破碎:將預處理後的蛘肉溶解在0.5M的醋酸溶液中，體積質量比為50:1 (mL:g),用組織搗碎機充分絞碎,加入0.3g胃蛋白酶,在冰水浴條件下放在磁力攪拌器上攪拌，用超聲破碎儀提取，超聲功率為39W，振幅為30%，超聲間隔為30min，提取時間為2d。
[0012]d、分離:將經過超聲提取後的溶液用冷凍離心機離心分離，12000/min, 20min，4°C，取上清液，保留沉澱；
e、二次提取:將離心所得的沉澱再次按照c步驟和d步驟提取、離心，取得上清液，將沉澱去掉；
f、合併:將兩次離心所得上清液合併在一起；
g、提純:向上清液中加入2M的NaCl溶液，使上清液中NaCl的最終濃度為0.9M，並在4°C冰箱中靜置過夜；
h、二級分離:將上述溶液高速冷凍分離，所得沉澱即為初步純化的膠原蛋白沉澱；
1、透析:將得到的沉澱溶解於0.5M醋酸溶液中，在4°C下用去離子水透析3天；
j、離心:將透析後的溶液高速冷凍離心，12，000r/min，30 min,所得沉澱為最後純化的月父原蛋白；
k、冷凍乾燥:將取得的純的膠原沉澱冷凍乾燥處理，在-80°C的冰箱中保存；
1、冷幹稱重:將冷凍後的產品冷幹，稱重的最後得率為35.07%o
[0013]實施例2:
與實施例1基本相同，不同的是提取的超聲功率為45.5W,振幅為35%,最後I父原蛋白的得率是23.33%。
[0014]實施例3:
與實施例1基本相同，提取功率不同，超聲功率為52W，振幅為40%，膠原蛋白的得率為12.Tl。
[0015]實施例4:
與實施例1基本相同，提取功率不同，超聲功率有所降低，超聲功率為32.5W，振幅為25%，膠原蛋白的得率為14.84%。
[0016]實施例5:
與實施例1基本相同，超聲功率繼續降低，功率降為20W，振幅為20%，膠原蛋白的得率為 21%。
【權利要求】
1.ー種從淡水珍珠蛘肉中提取膠原蛋白的エ藝方法，其特點在於，所述エ藝方法包括以下步驟: a、原材料製備:(I)將淡水珍珠蛘肉放在_80°C冰箱中冷凍24h；(2)將冷凍後的蛘肉在冷凍乾燥箱中冷凍乾燥，直到去除表面水分為止； b、原材料的預處理:(I)將冷幹後的蛘肉切碎，在50倍體積的預處理液中去除脂肪及內源性膠原蛋白，維持恆定溫度為4-8°C ；(2)用20mM Tris-HCl, pH 8.0的溶液浸泡24h,每8h更換一次浸泡液；(3)將Tris-HCl處理後的原料用0.1M NaOH浸泡24h，每8h更換一次浸泡液；(4)將經NaOH處理後的原材料經濾網過濾，然後用超純水充分洗滌過濾後的蛘肉，然後過濾，直到濾液呈中性或微鹼性為止，最後一次水洗後，用冷凍離心機離心，12000r/min, 20min, 4°C,去掉上清液,得到沉澱； C、酶解-超聲波破碎:將預處理後的蛘肉溶解在0.5M的醋酸溶液中，按照胃蛋白酶與冷幹的蛘肉的質量比3:100的配比，加入胃蛋白酶，在室溫下，用超聲波處理此溶液，採用處理30min，暫停30min的方式，連續處理2d; d、分離:將得到的超聲破碎液用冷凍離心機離心，得到上清液； e、二次提取:將離心所得的沉澱再次用c步驟所述方法超聲破碎提取，離心，取得上清液，將沉澱去掉； f、合併:將兩次離心所得上清液合併在一起； g、提純:向上清液中加入2M的NaCl溶液，使上清液中NaCl的最終濃度為0.9M，並在4°C冰箱中靜置過夜； h、二級分離:將上述溶液高速冷凍分離，所得沉澱即為初步純化的膠原蛋白沉澱；` 1、透析:將得到的沉澱溶解於0.5M醋酸溶液中，在4°C下用去離子水透析3天； j、離心:將透析後的溶液高速冷凍離心，所得沉澱為最後純化的膠原蛋白； k、冷凍乾燥:將取得的純的膠原沉澱冷凍乾燥處理，在-80°C的冰箱中保存。
2.如權利要求1所述的ー種從淡水珍珠蛘肉中提取膠原蛋白的エ藝方法，其特徵在於，步驟c中所述的胃蛋白酶為豬胃蛋白酶。
3.如權利要求1所述的ー種從淡水珍珠蛘肉中提取膠原蛋白的エ藝方法，其特徵在於，步驟c中所述的超聲波的功率20W-52W，振幅20-40%。
【文檔編號】C07K1/14GK103554248SQ201310531420
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月1日 優先權日:2013年11月1日
【發明者】陳素華, 王曉明, 邱賢華, 熊貞晟, 畢芊芊 申請人:南昌航空大學