具有抑制Ⅰ型單純皰疹病毒複製功能的蛋白分子及其製備方法
2023-09-18 17:58:40 1
專利名稱：具有抑制Ⅰ型單純皰疹病毒複製功能的蛋白分子及其製備方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學技術領域，尤其是涉及一種由單純皰疹病毒結合細胞受體後特異誘導產生的蛋白分子。
一些實驗已經提示HSV感染不同細胞後會表現不同的感染過程和不同的感染結局，最為關鍵的原因就是HSV結合不同的細胞表面的受體後，所誘導的基因反應有一定的差異，而這些各異的基因反應產物對HSVI進入細胞後的感染過程有直接的影響。因此導致了病毒感染可能走向不同結局。
隨著分子病毒學研究的深入，對病毒進入細胞過程的各個環節均有了更進一步的認識。因此，可以明確，病毒與宿主細胞之間的相互作用—即感染過程—實際上開始於病毒顆粒與其位於細胞膜上的特異受體相結合之時。而病毒與相應受體的結合，事實上模擬了生理配體與相應受體的結合過程，這個結合過程可以和正常生理配體一樣使受體發生活化，並通過激酶反應過程激活信號傳導成分，使相應信號導入細胞內，此信號必然會誘導細胞產生一系列的基因反應，而此基因反應將可以產生多種具有基因調控活性的蛋白分子或者某些功能性產物，後者可能以細胞因子或其它形式表現，並對細胞的生物學活性及病毒的複製過程產生一定影響。由於病毒結合受體之後較短時間內即進入細胞，並以其增殖過程破壞細胞，所以，由病毒引起的最具有意義的細胞基因反應屬於早期基因反應，對細胞基因反應的研究表明，在細胞對外界信號刺激的反應過程中，早期基因反應具有啟動某些次級基因反應的功能，同時還具有向其它細胞傳遞特殊信號，例如與免疫系統相關的信號因子以及表現某些特定生理作用的功能。因此，可以認為，對病毒與細胞的相互作用研究能夠為病毒與細胞相互作用的研究中引入一種綜合的觀念，即由於病毒對受體的結合，使得細胞產生相應的早期基因反應，已和未經病毒結合的細胞內環境有所差異，而病毒所表現的病理感染結果，實際上是在這樣的特定細胞內環境作用下形成的。
對由病毒結合受體所導致的細胞早期基因反應的分析，是目前病毒與細胞相互作用研究領域中的空白點。但這個領域的研究在探索細胞對病毒感染產生的相應反應的機理，和病毒與細胞相互作用的各種可能的生物學意義及結果，以及由此確定的，進一步的病毒感染病理學結局研究，都具有很大的意義和潛力。雖然該領域內的國內外專家均已公認病毒結合受體的確會給細胞導入特定信號，但此信號所導致的基因反應--尤其是早期基因反應對病毒在該細胞或與該細胞相鄰的同種細胞中感染過程的各種影響，尚無具體的研究探索。
技術方案1.序列特徵編碼該蛋白分子基因全長為904bp，其具有完整的5′-非編碼區和3′-非編碼區，編碼區可編碼一個由121個胺基酸組成的蛋白質(命名為SR-15)，分子量為14.9KD，該蛋白結構上表現為N端具有一個RS重複區域，在中部具有一個PPLP結構域，並以含有16.5％的精氨酸和12.4％的絲氨酸為基本特徵。
2.SR-15基因序列表1GGCGCGCCCG GGACGGAACC TGGGGCGTCA GAACGAAAGG CAGCGGCGCC GCGCTTCCCACCGCGCGGGC CCTGCCTTGG ACCCCGCAGT CTTGCTTTCC GTCGCCGCGG CGCGAAGGGT61GCCGGCCAGC CTCCCGCGCA GCGCCCCGGC CGGAAGCCTC CTCGCCGCCG CTTCCTCTCGCGGCCGGTCG GAGGGCGCGT CGCGGGGCCG GCCTTCGGAG GAGCGGCGGC GAAGGAGAGC121AGAAGGCGCG GGGCGGGCTG TCCGGCCCGC AGGGCGGTCG AGCCCGCGGC GCCATGGCTCTCTTCCGCGC CCCGCCCGAC AGGCCGGGCG TCCCGCCAGC TCGGGCGCCG CGGTACCGAG181ACGTCGGCTC CCGCAAGCGC TCGAGGAGTC GCAGCCGGTC CCGGGGACGG GGGTCGGAAATGCAGCCGAG GGCGTTCGCG AGCTCCTCAG CGTCGGCCAG GGCCCCTGCC CCCAGCCTTT241AGAGAAAGAA GAAGAGCAGG AAAGACACCT CGAGGAACTG CTCGGCCTCC ACATCCCAAGTCTCTTTCTT CTTCTCGTCC TTTCTGTGGA GCTCCTTGAC GAGCCGGAGG TGTAGGGTTC301GTCGCAAGGC CAGCACGGTC CCTGGGGCGG AGGTTCTTCT AGCTCCTCTT CTTCCTCCTCCAGCGTTCCG GTCGTGCCAG GGACCCCGCC TCCAAGAAGA TCGAGGAGAA GAAGGAGGAG361GTCCTCCTCC TCTTCCTCCA GTGATGGCCG GAAGAAGCGG GGGAAGTACA AGGACAAGAGCAGGAGGAGG AGAAGGAGGT CACTACCGGC CTTCTTCGCC CCCTTCATGT TCCTGTTCTC421GAGGAAGAAG AAGAAGAAGA GGAAGAACTG AAGAAGAAGG GCAAGGAGAA GGCGGAAGCACTCCTTCTTC TTCTTCTTCT CCTTCTTGAC TTCTTCTTCC CGTTCCTCTT CCGCCTTCGT481CAGCAGAACA TCATCCGCAA GGTGGTGGAC CCTTAGACGG GGCGCACCAG GCTTATTAAGGTCGTCTTGT AGTAGGCGTT CCACCACCTG GGAATCTGCC CCGCGTGGTC CGAATAATTC541GGAGATGGCG AGGTCCTAGA GGAAATCGTA ACCAAAGAAC GACCCAGAGA GATCAACAAGCCTCTACCGC TCCAGGATCT CCTTTAGCAT TGGTTTCTTG CTGGGTCTCT CTAGTTGTTC601CAACCCACCC GAGGGGACTG CCTGGCCTTC CAGATGCGAA CTGGGTTGCT TCCCTGAGGGGTTGGGTGGG CTCCCCTGAC GGACCGGAAG GTCTACGCTT GACCCAACGA AGGGACTCCC661CCCCCGCTGG CCAAGGCCTG TGGACGACGC TTGCGGCCCA GCCTGGGCAG GTTTCAGGGTGGGGGCGACC GGTTCCGGAC ACCTGCTGCG AACGCCGGGT CGGACCCGTC CAAAGTCCCA721GCCAGTGGGA AGCCTGATGG GTGTTGGTGG CCTTTCCCCG GTGGATTGGT CTCTGGCCCA
CGGTCACCCT TCGGACTACC CACAACCACC GGAAAGGGGc CACCTAACCA GAGACCGGGT781GCCCAGTCTC TTCTAAGGGG CAGGGGGTGG AGGTTGGGGT CACCGGCCTG CTTGGCACCCCGGGTCAGAG AAGATTCCCC GTCCCCCACC TCCAACCCCA GTGGCCGGAC GAACCGTGGG841CCATCTGAAA GAGCAGCACT TCTCAGCTAT TAAAGGCCCC CTGGATAGAA AAAAAAAAAAGGTAGACTTT CTCGTCGTGA AGAGTCGATA ATTTCCGGGG GACCTATCTT TTTTTTTTTT901AAGATTCT3.SR-15蛋白分子的胺基酸序列表1 MAHVGSRKRS RSRSRSRGRG SEKRKKKSRK DTSRNCSAST SQGRKASTVP GAEVLLAPLL61 PPRPPpLPPV MAGRSGGSTR TRGGRRRRRG RTEEEGQGEG GSTAEHHPQG GGPLDGAHQA121 Y
本發明提供了具有抑制I型單純皰疹病毒複製功能的蛋白分子的製備方法，該法包括以下步驟1、SR-15cDNA的克隆與鑑定-構建HSVI刺激1小時後的KMB-17細胞的cDNA文庫；-對經HSVI刺激1小時後的KMB-17細胞進行mRNA差異顯示分析；-製備特異的EST差異片段的α-32P-dATP標記探針，對HSVI刺激1小時後的KMB-17細胞的cDNA文庫進行雜交篩，獲得SR-15cDNA，並測序鑑定；-利用200bp上述基因的片段製備探針對HSVI刺激1小時後的KMB-17細胞及細胞對照進行Northern雜交分析，以探討該基因的表達與HSVI結合的關係。
2.SR-15編碼蛋白的表達純化及抗體製備-將SR-15cDNA中的編碼區序列147bp-536bp，共363nt克隆入pGEX-5T表達載體中進行融合表達；-對融合表達產物進行親和層析，製備SR-15純化蛋白，並定量至5μg/ml；-以上述蛋白對小鼠進行肌肉及靜脈注射免疫，5周後製備抗血清，即為抗SR-15蛋白抗體本發明具有以下有益效果1.從病毒與細胞受體結合的角度，探索這種結合所誘導產生的細胞早期基因反應產物與病毒之間的相互作用。由此，為病毒與宿主細胞的相互作用關係提供新的探索途徑，並通過對HSVI與人成纖維細膜上的相應受體結合所誘導的細胞產物SR-15蛋白的功能分折，為HSVI感染機理和病理學機理提供直接的資料。通過對HSVI等病毒與相應受體結合後細胞早期基因反應差異的初步研究，並克隆到的一個新蛋白分子一SR-15。完成SR-15蛋白對細胞內前RNA剪切過程直接或間接影響的探索分析；以及該蛋白對HSVI複製過程中前RNA剪切過程影響分析。SR-15蛋白作為HSVI誘導人成纖維細胞表達的特異產物對細胞和/或病毒的功能意義分析，並以此為線索，進一步探索HSVI與人成纖維細胞相互作用的可能模式。從而為深入了解HSVI與細胞之間相互作用所形成的特定病理學結果的分子機理，尤其是HSVI感染細胞分子病理學機理提供直接的依據；SR-15蛋白為開發新型抗病毒生物活性因子提供了的可能性，同時也為相應的應用研究提供了基礎。
2.本發明的研究工作、已克隆及即將克隆到的與病毒感染過程特異相關的新基因，還包括這些基因產物功能的特定生理學病理學意義，均在病毒與細胞相互作用的研究領域中具有開闢新方向的意義，並從新的角度為病毒與細胞相互作用的研究提供思路和概念，以及更為廣闊的研究空間和資料。
3.本發明提示HSVI與其它病毒如脊灰病毒A型肝炎病毒對同一細胞(人成纖維細胞)的早期感染時(吸附細胞後1小時)，誘導了具有明顯差異的基因反應，而HSVI對不同細胞的早期感染過程中，(吸附後1小時)亦能誘導具有明顯差異的基因反應，在這些差異的基因反應中，有50％屬於作為細胞調控因子的原癌基因產物，另外一些都是具有未知功能的新基因。
4.具有RS重複區域是SR蛋白家族的特徵，該蛋白家族是細胞內前mRNA剪切過程中的重要組分，但其結構中的RS重複域位於分子的C-末端，並具有特徵性的RNA識別區域(RRM)；PPLP區域是一與Src類蛋白結合的特徵結構。在對SR-15蛋白分子序列與部分SR蛋白的同源性分析比較提示，該蛋白在某些特徵部位具有與SR家族相似的結構，但整體同源性小於10％。利用該蛋白的原核表達產物所製備的特異抗體，經免疫螢光分析證實該蛋白分布於細胞質中，Northern亦證實了其是由HSVI結合細胞受體後所特異誘導。本發明的研究結果證實，該蛋白質可能在兩個方面具有值得進一步探索的潛在意義。其一，該蛋白作為一種由HSVI結合受體後特異誘導的早期基因產物，以其結構特性，可能參與了細胞或者病毒mRNA的剪切過程，但對細胞而言，該過程發生於核內，因此要探索這一點，必須先明確其是否及如何進入核內。另外，由於該蛋白分子表現了一種明顯與核酸分子結合的結構特點，同時又具有與Src蛋白類結合的活性域(PLPP)。進一步的研究表明，SR-15蛋白在正常生理條件下並不表達，僅在細胞受到HSVI刺激時產生，僅出現於G1/S期間，這意昧著受病毒感染的細胞很可能通過此蛋白分子對病毒有一定調節細胞前mRNA剪切的作用，並以此機理阻滯HSVI前mRNA剪接而影響病毒的增殖。對本發明所克隆到的新的SR-15蛋白分子在HSVI感染細胞內對細胞生理功能和病毒複製過程的潛在作用影響進行全面的分析，為深入了解HSVI與細胞之間相互作用所形成的特定病理學結果的分子機理，尤其是細胞分子病理學機理提供直接的依據，提供了開發新型抗病毒生物活性因子的可能性，同時也為相應的應用研究提供了基礎。
5.SR-15蛋白分子的抗病毒應用意義由於該蛋白的表達與HSVI結合細胞受體有直接的關係，因此在了解該蛋白對細胞的功能之時，將著重了解其對HSVI感染過程中的某些組分的影響。
A.在上述基礎上，對不同時相KMB-17細胞的HSVI感染情況的分析，即以同樣方法感染G1/S、G1、S、G2期的KMB-17、Hela細胞，進行病毒滴度測定，檢測可以感染HSVI的各類細胞，以及不同病毒(如polio)在結合其受體時是否亦有同樣蛋白分子表達。如果這一現象為HSVI感染多種細胞所共有，則可以進一步探討其對HSVI感染影響的共性。若此現象僅為人成纖維細胞所特有，則將該蛋白的基因導入HSVI易感細胞，再從HSVI感染過程的生物學特性，如感染動力學；感染過程中的mRNA剪切效率變化和感染複製過程中的病理學機理等方面確定SR-15的功能意義。
B.研究Gl/S期HSVI的複製抑制與早期基因的特異性產物的相關性，將帶有SR-15基因的真核表達載體轉染進入某些細胞，如Hela，Hep-2等；檢查該基因表達產物對病毒感染的影響，進一步探索SR-15蛋白的功能意義。將SR-15cDNA編碼區序列147bp-536bp，共363nt克隆入真核表達載體pcDNA3中轉染入Hela細胞後，通過Western blot檢測蛋白表達，一天後以HSVI感染，並檢測病毒滴度。
C.體外剪切抑制試驗，使用T7聚合酶和32P-UTP在重組質粒pHSVP中合成標記的HSVI RL2基因的前體mRNA片段，通過HSVI基因轉錄過程中的某些基因的體外剪接過程，如即刻早期基因前體mRNA的體外剪切抑制試驗研究細胞G1/S期內SR-15蛋白分子剪切調節活性與HSVI的複製抑制關係。
試驗例2圖2是SR-15在pGEX-5T中的表達。如附圖2所示，克隆入pGEX-5T表達載體中的SR-15蛋白得到了較好的融合表達，對融合表達產物進行親和層析。圖中1.SR-15在pGEX-5T中的表達；2.對照；3.蛋白Marker。
試驗例3SR-15蛋白的結構特徵與功能特徵試驗研究。SR-15蛋白該蛋白結構上表現為N端具有一個RS重複區域，在中部具有一個PPLP結構域，並以較多的精氨酸和絲氨酸為基本特徵。資料表明，具有RS重複區域是SR蛋白家族的特徵，該蛋白家族是細胞內前mRNA剪切過程中的重要組分，但其結構中的RS重複域位於分子的C-末端，並具有特徵性的RNA識別區域(RRM)；PPLP區域是一與Src類蛋白結合的特徵結構(見
圖1)。35S和32P免疫沉澱結果顯示了SR-15蛋白在HSVI刺激細胞後表達並發生了磷酸化，提示SR-15蛋白作為中介因子介導了病毒感染與細胞周期的關係。其結果見圖3。圖3是HSVI結合KMB-17後SR-15蛋白的免疫沉澱；在圖3中AHSVI結合KMB-17後32P-phosphate and SR-15 labeled by35S-methioine標記的SR-15蛋白的免疫沉澱，1.35S-methioine標記細胞對照；2.Cells in32P-phosphate標記細胞對照；3.HSVI刺激後35S-methioine標記細胞；4.HSVI刺激後32P-phosphate標記細胞。BHSVI結合KMB-17後G1/S，G1，S and G2各時相及細胞對照的32P-phosphate標記的SR-15蛋白的免疫沉澱；1，2，3，4，HSVI結合細胞後G1/S，G1，S and G2時相。5，6，7，8，細胞對照的G1/S，G1，S and G2時相。
試驗例4圖4是SR-15與人β-蛋白外顯子1和外顯子2、剪接位點及snRNA的sm結合位點的結合分析。如附圖4所示，SR-15與人β-珠蛋白外顯子1和2、剪接位點及snRN的sm結合位點的結合分析1.剪切位點；2.sm-結合位點；3.外顯子1；4.外顯子2。對SR-15蛋白mRNA剪切過程相關的特異序列相結合的特異性的試驗結果，表明蛋白內部含有DNA或RNA結合特異性區域-RRR，KKRR，推測該蛋白可能通過與HSVI的基因DNA或mRNA的相互作用影響病毒的複製，同時鑑於SR類蛋白家族與前體mRNA剪切的相關性，表明SR-15蛋白是HSVI前體mRNA的抑制因子。人β-珠蛋白基因外顯子1和外顯子2及剪接位點的SR蛋白結合位點的結合試驗蛋白結果為這一推論提供了證實。
試驗例5圖5是HSVI結合後不同相收穫病毒的滴度結果，圖5中HSVI/KMB-17HSVI感染KMB-17細胞後病毒滴度；HSVI/HelaHSVI感染Hela細胞後病毒滴度；PV/KMB-17Polio病毒Sabin株感染KMB-17細胞後病毒滴度。圖5中的結果表明，顯示在KMB-17細胞G1/S期的滴度明顯低於其它時相約4個log，而Hela細胞中未發現明顯差異；使用PV感染KMB-17細胞也未發現差異。提示病毒刺激與細胞的特異相關性。
試驗例6圖6顯示了pcDNA-S15轉染Hela細胞後對HSVI的複製抑制作用。圖中結果表明SR-15基因轉染結果顯示了Hela細胞內HSVI滴度比未轉染SR-15基因的細胞病毒滴度少約2個log，提示SR-15蛋白的確抑制了病毒的複製。
試驗例7體外抑制試驗表明在HSVI感染的G1/S期KMB-17細胞和Hela細胞的裂解液存在的情況下，SR-15蛋白可以明顯抑制HSVI RL2基因的前體mR的剪切。圖7是體外SR-15蛋白抑制HSVI RL2基因的前體mRNA的剪切，圖7中1.HSVI感染Hela細胞後1小時後的細胞裂解液與含有剪切位點的HSVIRL2基因的mRNA片段共同孵育；2.HSVI感染Hela細胞後1小時後的細胞裂解液和純化的SR-15蛋白與含有剪切位點的HSVI RL2基因的mRNA片段共同孵育；3.HSVI感染KMB-17細胞後1小時後的細胞裂解液和純化的SR-15蛋白與含有剪切位點的HSVI RL2基因的mRNA片段共同孵育從圖7可以看到SR-15蛋白存在是未能剪切的876nt的樣品，以及沒有SR-15蛋白時經過剪切的365nt和511nt的樣品。
權利要求
1.一種具有抑制I型單純皰疹病毒複製功能的蛋白分子，該蛋白分子的基因特徵是①基因全長為904bp，其具有完整的5′-非編碼區和3′-非編碼區，編碼區可編碼一個由121個胺基酸組成的蛋白質(命名為SR-15)，分子量為14.9KD，該蛋白結構上表現為N端具有一個RS重複區域，在中部具有一個PPLP結構域，並以含有16.5％的精氨酸和12.4％的絲氨酸為基本特徵；②SR-15基因序列描述為1 GGCGCGCCCG GGACGGAACC TGGGGCGTCA GAACGAAAGG CAGCGGCGCC GCGCTTCCCACCGCGCGGGC CCTGCCTTGG ACCCCGCAGT CTTGCTTTCC GTCGCCGCGG CGCGAAGGGT61 GCCGGCCAGC CTCCCGCGCA GCGCCCCGGC CGGAAGCCTC CTCGCCGCCG CTTCCTCTCGCGGCCGGTCG GAGGGCGCGT CGCGGGGCCG GCCTTCGGAG GAGCGGCGGC GAAGGAGAGC121 AGAAGGCGCG GGGCGGGCTG TCCGGCCCGC AGGGCGGTCG AGCCCGCGGC GCCATGGCTCTCTTCCGCGC CCCGCCCGAC AGGCCGGGCG TCCCGCCAGC TCGGGCGCCG CGGTACCGAG181 ACGTCGGCTC CCGCAAGCGC TCGAGGAGTC GCAGCCGGTC CCGGGGACGG GGGTCGGAAATGCAGCCGAG GGCGTTCGCG AGCTCCTCAG CGTCGGCCAG GGCCCCTGCC CCCAGCCTTT241 AGAGAAAGAA GAAGAGCAGG AAAGACACCT CGAGGAACTG CTCGGCCTCC ACATCCCAAGTCTCTTTCTT CTTCTCGTCC TTTCTGTGGA GCTCCTTGAC GAGCCGGAGG TGTAGGGTTC301 GTCGCAAGGC CAGCACGGTC CCTGGGGCGG AGGTTCTTCT AGCTCCTCTT CTTCCTCCTCCAGCGTTCCG GTCGTGCCAG GGACCCCGCC TCCAAGAAGA TCGAGGAGAA GAAGGAGGAG361 GTCCTCCTCC TCTTCCTCCA GTGATGGCCG GAAGAAGCGG GGGAAGTACA AGGACAAGAGCAGGAGGAGG AGAAGGAGGT CACTACCGGC CTTCTTCGCC CCCTTCATGT TCCTGTTCTC421 GAGGAAGAAG AAGAAGAAGA GGAAGAACTG AAGAAGAAGG GCAAGGAGAA GGCGGAAGCACTCCTTCTTC TTCTTCTTCT CCTTCTTGAC TTCTTCTTCC CGTTCCTCTT CCGCCTTCGT481 CAGCAGAACA TCATCCGCAA GGTGGTGGAC CCTTAGACGG GGCGCACCAG GCTTATTAAGGTCGTCTTGT AGTAGGCGTT CCACCACCTG GGAATCTGCC CCGCGTGGTC CGAATAATTC541 GGAGATGGCG AGGTCCTAGA GGAAATCGTA ACCAAAGAAC GACCCAGAGA GATCAACAAGCCTCTACCGC TCCAGGATCT CCTTTAGCAT TGGTTTCTTG CTGGGTCTCT CTAGTTGTTC601 CAACCCACCC GAGGGGACTG CCTGGCCTTC CAGATGCGAA CTGGGTTGCT TCCCTGAGGGGTTGGGTGGG CTCCCCTGAC GGACCGGAAG GTCTACGCTT GACCCAACGA AGGGACTCCC661 CCCCCGCTGG CCAAGGCCTG TGGACGACGC TTGCGGCCCA GCCTGGGCAG GTTTCAGGGTGGGGGCGACC GGTTCCGGAC ACCTGCTGCG AACGCCGGGT CGGACCCGTC CAAAGTCCCA721 GCCAGTGGGA AGCCTGATGG GTGTTGGTGG CCTTTCCCCG GTGGATTGGT CTCTGGCCCACGGTCACCCT TCGGACTACC CACAACCACC GGAAAGGGGC CACCTAACCA GAGACCGGGT781 GCCCAGTCTC TTCTAAGGGG CAGGGGGTGG AGGTTGGGGT CACCGGCCTG CTTGGCACCCCGGGTCAGAG AAGATTCCCC GTCCCCCACC TCCAACCCCA GTGGCCGGAC GAACCGTGGG841 CCATCTGAAA GAGCAGCACT TCTCAGCTAT TAAAGGCCCC CTGGATAGAA AAAAAAAAAAGGTAGACTTT CTCGTCGTGA AGAGTCGATA ATTTCCGGGG GACCTATCTT TTTTTTTTTT901 AAGATTCT③SR-15蛋白分子的胺基酸序列表1 MAHVGSRKRS RSRSRSRGRG SEKRKKKSRK DTSRNCSAST SQGRKASTVP GAEVLLAPLL61 PPRPPPLPPV MAGRSGGSTR TRGGRRRRRG RTEEEGQGEG GSTAEHHPQG GGPLDGAHQA121 Y
2.一種權利要求1所述的具有抑制I型單純皰疹病毒複製功能的蛋白分子的製備方法，該法包括以下步驟①SR-15cDNA的克隆與鑑定-構建HSVI刺激1小時後的KMB-17細胞的cDNA文庫；-對經HSVI刺激1小時後的KMB-17細胞進行mRNA差異顯示分析；-製備特異的EST差異片段的α-32P-dATP標記探針，對HSVI刺激1小時後的KMB-17細胞的cDNA文庫進行雜交篩，獲得SR-15cDNA，並測序鑑定；-利用200bp上述基因的片段製備探針對HSVI刺激1小時後的KMB-17細胞及細胞對照進行Northern雜交分析，以探討該基因的表達與HSVI結合的關係。②SR-15編碼蛋白的表達純化及抗體製備-將SR-15cDNA中的編碼區序列147bp-536bp，共363nt克隆入pGEX-5T表達載體中進行融合表達；-對融合表達產物進行親和層析，製備SR-15純化蛋白，並定量至5μg/ml；-以上述蛋白對小鼠進行肌肉及靜脈注射免疫，5周後製備抗血清，即為抗SR-15蛋白的抗體。
3.一種權利要求1所述蛋白分子的用途，具體描述如下①SR-15基因轉染Hela細胞後所顯示的抗HSVI病毒感染的作用，將SR-15基因轉染Hela細胞後，細胞內HSVI滴度比未轉染SR-15基因的細胞病毒滴度少約2個log，表明SR-15蛋白抑制I型單純皰疹病毒的複製；②在HSVI感染的G1/S期的KMB-17細胞和Hela細胞的裂解液中，使用SR-15蛋白的樣品存在有876nt的KC2 mRNA分子，而無SR-15蛋白的樣品則出現經過剪切的365nt和511nt的分子，該體外抑制試驗證明SR-15蛋白可以明顯抑制HSVI RLL基因的前體mKNA的剪切。
全文摘要
具有抑制I型單純皰疹病毒複製功能的蛋白分子及其製備方法。涉及分子生物學技術領域。該蛋白分子基因全長為904bp,其具有完整的5』－非編碼區和3』－非編碼區,編碼區可編碼一個由121個胺基酸組成的蛋白質,分子量為14.9KD,該蛋白結構上表現為:N端具有一個RS重複區域,在中部具有一個PPLP結構域,並以含有16.5%的精氨酸和12.4%的絲氨酸為基本特徵。本發明從病毒與細胞受體結合的角度,對誘導產生的細胞早期基因反應產物與病毒之間的相互作用進行深入研究,為病毒與宿主細胞的相互作用關係提供新的探索途徑。並通過對HSVI與人成纖維細膜上的相應受體結合所誘導的細胞產物SR－15蛋白的功能分折,為HSVI感染和病理學機理提供了直接依據。
文檔編號A61P31/22GK1385440SQ02113350
公開日2002年12月18日 申請日期2002年2月6日 優先權日2002年2月6日
發明者李琦涵, 董承紅, 王麗春, 劉龍丁, 趙紅玲, 姜莉, 孫明, 王炯, 董少忠, 王晶晶, 趙樹棟, 胡方, 易紅昆 申請人:中國醫學科學院醫學生物學研究所