微陣列的檢測方法
2023-09-19 02:03:30
專利名稱：微陣列的檢測方法
技術領域：
本發明涉及使用微陣列檢測探針多核苷酸和靶多核苷酸的雜交的方法。
背景技術：
不僅明確多種多樣的生物的基因構造，而且在嘗試用基因組序列闡明其基因功能的同時，也在快速進行用於高效解析基因功能的技術開發。微陣列是在載玻片等載體上使 多數多核苷酸排列固定在每個規定的區域上的高密度陣列，其對於基因的鹼基序列的確定，以及基因的表達、變異、多態性等的同時解析非常有用。使用該微陣列的基因信息的解析對新藥研究，疾病的診斷或預防的研發等極其有用。在使用微陣列的檢測中，首先用放射性同位素或螢光色素標記後的靶多核苷酸與在載體表面高密度排列的探針多核苷酸雜交。此時，具有與探針多核苷酸互補的鹼基序列的靶多核苷酸與探針多核苷酸互補性地雜交，未雜交的多核苷酸通過清洗除去。在使用微陣列的雜交的檢測中，有時由於微陣列的性能退化或清洗不充分等而引起誤判。但是，判斷是否為誤判被委託於使用微陣列的用戶，這非常不可靠。在這樣的狀況下，不能用組合檢測器和反應裝置的自動裝置處理多個試樣。專利文獻I中記載有為了消除在點的亮度為檢測器的檢測下限以下的情況及為檢測上限以上的情況下產生的判定誤差，使用點化有改變濃度的探針DNA的微陣列，僅用具有特定範圍的亮度的點判定結果的方法。但是，在該方法中，不能判定每個微陣列的性能退化或清洗不充分等。在專利文獻2記載有使探針陣列共價結合標誌物質(7—力一物質)，基於該標誌物質的位置，迅速且正確地進行各探針的點的位置的鑑定的方法。但是，在該方法中，即使能夠判定每個探針陣列的性能退化或清洗不充分等，也不能判定在雜交或PCR上是否具有
缺陷等。現有技術文獻專利文獻I :專利第0880361號專利文獻2 :專利第4261661號
發明內容
發明要解決的問題本發明的問題是提供一種客觀地判定每個微陣列的性能退化或清洗不充分等及靶多核苷酸雜交不良的方法，以及點的定位方法。用於解決問題的手段本發明人發現具有分別添加多種探針多核苷酸的多個固定的檢測用點上，及一處以上的固定有兩種以上固定於檢測用點上的探針多核苷酸的基準點的微陣列，使其接觸螢光標記的靶多核苷酸並進行雜交反應，首先通過測定基準點的螢光，能夠定位檢測用點，同時能夠判定每個微陣列的可靠性以及雜交反應的可靠性，至此完成了本發明。
即，本發明包含以下方面。(I) 一種方法，其使用微陣列檢測探針多核苷酸和祀多核苷酸的雜交，包含I)使具有分別添加多種探針多核苷酸的多個固定的檢測用點，及一處以上的固定有兩種以上固定於檢測用點上的探針多核苷酸的基準點的微陣列與螢光標記的靶多核苷酸接觸的工序，2)通過清洗微陣列，除去未反應的靶多核苷酸的工序，3)測定基準點上的螢光，若滿足規定值則判斷為可測定的工序，及4)若判斷為可測定，則測定固定有探針多核苷酸的各檢測用點上的螢光的工序。(2)如⑴所述的方法，在基準點上固定有各類固定於檢測用點上的探針多核苷酸。(3)如(I)或(2)所述的方法，與微陣列接觸的靶多核苷酸必須包含與固定於基準點上的探針多核苷酸雜交的多核苷酸。(4)如⑴ (3)中任一方面所述的方法，在微陣列中，排列配置有檢測用點和基準點，基準點至少存在兩處，將連結任意兩處的基準點的線作為基準線，基於距基準點的距離和與基準線的角度檢測檢測用點的位置。(5)如⑷所述的方法，檢測用點和基準點配置成外周為四角形的格子形狀，在四角形的不同的頂點上存在基準點。(6)如⑴ (5)中任一方面所述的方法，在微陣列中，檢測用點和基準點排列配置成外周為正方形或長方形的格子狀，在其對角線上的頂點上存在兩處基準點，檢測穿過各基準點的兩條直線垂直相交的交點，檢測連結所述交點和各基準點的兩條結線的長度，由所述結線的長度和點數檢測結線上的各檢測用點位置。(7)如⑴ (6)中任一方面所述的方法，標誌多核苷酸(7—力一 1J ^ ^ >才千卜''〃)與固定於檢測用點上的探針多核苷酸中任意種和互補的多核苷酸具有95%以上的同源性。(8) 一種試劑盒，其用於檢測探針多核苷酸和靶多核苷酸的雜交，包含具有分別添加多種探針多核苷酸的多個固定的檢測用點，及一處以上的固定有兩種以上固定於檢測用點上的探針多核苷酸的基準點的微陣列，以及與固定於檢測用點上的探針多核苷酸中的任意種雜交的螢光標記的標誌多核苷酸。(9)如⑶所述的試劑盒，在基準點上固定有各類固定於檢測用點上的探針多核苷酸。本說明書是包含日本專利申請2010-000251號的說明書及/或附圖所述的內容，該申請是本申請的優先權的基礎。根據本發明，能夠判定每個微陣列的可靠性，使用具有可靠性的微陣列能夠實施測定。另外，能夠判定雜交反應的可靠性。因此，能夠抑制誤判。另外，通過與自動反應裝置等組合，能夠以高的可靠性自動實施微陣列的測定。另外，在試樣中不添加額外的試劑等就能夠檢測基準點這一點也是有利的。
圖I表示微陣列中的探針DNA (檢測用點)及探針DNA混合物(基準點)的點配置的一方式；圖2表示用於微陣列的螢光檢測的檢測器的一方式；圖3表不在微陣列中實施雜交反應後，測定滅光的圖像；圖4表示在微陣列中實施雜交反應後，測定螢光強度的結果；圖5表示微陣列中的探針DNA (檢測用點)及探針DNA混合物(基準點)的點配置的一方式；圖6表示使兩種微陣列(傳統方法及本發明)與源自試樣的靶DNA雜交測定螢光的結果；圖7表示將在從試樣中提取的核酸中不加入引物下進行PCR得到的PCR產物滴加在微陣列上得到的螢光圖像； 圖8表示微陣列中的探針DNA (檢測用點)及探針DNA混合物(基準點)的點配置的一方式。點I 17為檢測用點，點A為基準點；圖9表示使微陣列與源自試樣的靶DNA雜交測定螢光的結果。
具體實施例方式本發明涉及一種用微陣列檢測探針多核苷酸和靶多核苷酸的雜交的方法。在本發明中，多核苷酸包含寡核苷酸，包含含有DNA及RNA的核酸。DNA包含單鏈DNA及雙鏈DNA。另外，核酸中也包含修飾磷酸二酯部位的人工核酸、修飾呋喃部位的糖基鍵及羥基的人工核酸、修飾核酸鹼基部位的人工核酸、及利用糖、磷酸骨架以外的構造的人工核酸等，更具體而言，包含以硫原子取代磷酸部位的氧原子的硫代磷酸酯型、二硫代磷酸酯型、磷二醯胺型、甲基磷酸酯型或甲基硫代磷酸酯型的人工核酸；呋喃環上的取代基修飾型、增加一個碳糖環骨架的吡喃型、或多環式糖骨架型的人工核酸；嘧啶C-5位修飾鹼基型、嘌呤C-7位修飾鹼基型、或環擴大修飾鹼基型的人工核酸等。在本發明中，探針多核苷酸具有在該技術領域通用的含義，是指用於檢測目的基因的多核苷酸，即是指專門與對應於目的基因的多核苷酸或其片段雜交的多核苷酸。作為探針多核苷酸，通常使用變性的多核苷酸(例如，從雙鏈變性為單鏈的那些)，可使用合成寡核苷酸、cDNA及基因組DNA以及它們的片段等。探針多核苷酸通常具有3 5000個鹼基，優選具有10 1000個鹼基，進一步優選15 70個鹼基。固定於微陣列上的探針多核苷酸的濃度通常為0. 2iiM 50iiM的範圍。在本發明中，靶多核苷酸具有在該技術領域通用的含義，是指檢測對象即多核苷酸。靶有時稱為目標。通常，使用源自被檢試樣的多核苷酸及以其為基礎利用酶合成/擴增的多核苷酸，具體而言，使用變性的多核苷酸、mRNA、cDNA、aRNA、它們的片段、等。雜交(7、^ 7'' 'J夕' ^文)、雜交反應(7、^ 7'' 'J夕' ^文反応)或雜交(/、^ 7'' 'J夕'^七一'> 3 > )具有在該技術領域通用的含義，是指具有互補的序列的多核苷酸之間，例如，單鏈的DNA之間、單鏈的RNA之間、或單鏈的DNA和單鏈的RNA在適當的條件下形成雙鏈。在本發明中，雜交優選在嚴格的條件下實施。 在本發明中，使用螢光標記的靶多核苷酸。標記方法及標記的種類只要是能夠檢測探針多核苷酸和靶多核苷酸的雜交的物質就沒有特別限制，在該技術領域是公知的。例如，通過在合成或擴增靶多核苷酸時導入共價結合螢光標記的底物(主要是UTP)，能夠得到螢光標記的靶多核苷酸。作為螢光標記，可列舉Cy3以及Cy5等CyDye、FITC、RITC、若丹明、德克薩斯紅、TET、TAMRA, FAM、HEX、ROX等。在本發明中，作為微陣列，使用具有添加探針多核苷酸的多個固定的檢測用點及一處以上固定有兩種以上固定於檢測用點上的探針多核苷酸的基準點的微陣列，探針多核苷酸優選全部種類，基準點優選至少兩處，更優選2 4處，進一步優選兩處。固定於基準點上的探針多核苷酸的濃度合計通常為0. 2 y M 100 y M的範圍。固定於基準點上的探針多核苷酸的濃度優選為分別相同的濃度，合計為上述濃度。
在本發明中，固定於微陣列的檢測用點上的探針多核苷酸的種類為兩種以上，通常為256種以下，優選為64種以下。在本發明中，在基準點上，優選以相同的濃度使兩種以上固定於檢測用點上的探針多核苷酸固定，探針多核苷酸優選全部種類，因此，若探針多核苷酸的種類過多，則基準點上的每一種探針多核苷酸的濃度變低，基準點上的螢光變弱。在本發明中，通常與微陣列接觸的靶多核苷酸必須包含與固定於基準點上的探針多核苷酸雜交的多核苷酸。因此，若使微陣列接觸螢光標記的靶多核苷酸，則微陣列不會退化，只要正常進行核酸擴增反應等檢測步驟，就一定能在基準點上檢測信號。而且，通過判定在基準點上有無信號，能夠判定每個微陣列的可靠性，使用具有可靠性的微陣列能夠實施測定。另外，也能夠判定雜交反應的可靠性，能夠抑制誤判。另外，將基準點的位置作為基準，能夠自動確定檢測用點的位置，因此，通過與自動反應裝置等組合，能夠以高度的可靠性自動實施微陣列的測定。固定於檢測用點上的探針多核苷酸是指為了該微陣列檢測對象的目的而實質上使用的探針多核苷酸。「固定有各類固定於檢測用點上的探針多核苷酸全種類」是指固定有各類為了如上所述的微陣列檢測對象的目的而實質上使用的探針多核苷酸。因此，在微陣列上，固定有為了檢測對象而實質上未使用的多核苷酸，即使該多核苷酸不固定在基準點上，這樣的方式也包含於固定有全部種類的方式。靶多核苷酸必須包含與固定於微陣列的檢測用點上的多個探針多核苷酸中的任意種雜交的多核苷酸，以檢測與哪個檢測用點雜交，在鑑定靶多核苷酸的情況下，優選使用固定有各類固定於檢測用點上的探針多核苷酸的方式。換而言之，優選與微陣列接觸的靶多核苷酸必須包含與固定於檢測用點上的探針多核苷酸中的任意種雜交的多核苷酸的方式。原因是這樣的靶多核苷酸一定與固定於基準點上的探針多核苷酸中的任意種雜交，因此，微陣列不會退化，只要正常進行核酸擴增反應等檢測步驟，就一定能在基準點上檢測信號。而且，通過在基準點上有無信號，能夠判定每個微陣列的可靠性，使用具有可靠性的微陣列能夠實施測定。另外，也能判定雜交反應的可靠性，能夠抑制誤判。另外，將基準點的位置作為基準，能夠自動確定檢測用點的位置，因此，通過與自動反應裝置等組合，能夠以高度的可靠性自動實施微陣列的測定。作為這樣的方式，可列舉對於源自活體試樣的靶核苷酸，使用固定有必須包含於該活體試樣的核酸的探針多核苷酸的微陣列的情況。例如，源自必須包含於該活體試樣的基因的核酸，在該基因具有多個基因組型(多態性或變異)的情況下，各類與該所有的基因組型的核酸對應的探針多核苷酸分別固定於微陣列的檢測用點上。更具體而言，可列舉為了判定ABO血型，將所有的分別與ABO糖基轉移酶基因的多態性(Yamamoto et al. ,990, Nature345 (17) :229-233)對應的探針多核苷酸分別固定於微陣列的檢測用點上，使作為靶多核苷酸，源自從人的細胞、組織或血液等體液中提取的核酸的靶多核苷酸(例如，將該核酸設定為模板使ABO糖基轉移酶基因擴增得到的靶多核苷酸)與其接觸的情況等。另外可舉出由基因多態性的判定進行的藥物響應性檢查、藥效檢查等。本發明也包含靶多核苷酸不包含與固定於微陣列的檢測用點上的多個探針多核苷酸中的任意種雜交的多核苷酸的情況。在這樣的情況下，在基準點上也檢測不出信號。因此，首先檢測基準點的螢光，若不滿足規定值則能夠判斷為不可測定。例如，在通過鑑定人可能感染的病毒(例如，BK病毒)中的基因(例如，VPl基因)的多態性判定人的出身地等的情況下，考慮使用固定有各類與該病毒基因的多態性對應的探針多核苷酸的微陣列。若試樣感染了病毒，則在任一個檢測用點中檢測到螢光，同時在基準點上也檢測到螢光，因此，首先，在測定基準點的螢光滿足規定值的情況下，僅測定檢測用點的螢光即可。假設，在基準點上檢測不到螢光，則能夠判定為由於微陣列退化、或核酸擴增反應的不良、或試樣未感染該病毒等理由不可測定，因此，不需要測定檢測用點的螢光。因此，本發明也能用於蟎、黴菌的檢查，食品及環境下的微生物檢查，對人體的細菌、病毒感染的檢查等，還有調查測定對象有無的情況等。在本發明中，通過使上述微陣列與螢光標記的靶多核苷酸接觸實施雜交反應，通過清洗除去未反應的靶多核苷酸後，首先，測定基準點上的螢光。在本發明中，另外，除了螢光標記的靶多核苷酸外，也可以使與固定於檢測用點上的探針多核苷酸中的任意種雜交的螢光標記的標誌多核苷酸與微陣列接觸。該標誌多核苷酸通常是指在嚴格的條件下與固定於檢測用點上的探針多核苷酸中的任意種雜交的螢光標記的標誌多核苷酸。嚴格的條件是指形成特異性雜交體而不形成非特異性雜交體的條件，雖然可舉出低嚴格的條件及高嚴格的條件，但優選高嚴格的條件。低嚴格的條件為在雜交後的清洗中，例如以42°C、5XSSC、0. 1% SDS進行清洗的條件，優選為以50°C、5XSSC、0. 1% SDS進行清洗的條件。高嚴格的條件為在雜交後的清洗中，例如以65°C、0. I X SSC以及0. I % SDS進行清洗的條件。在如上所述的嚴格的條件下，由與同任意的探針多核苷酸互補的多核苷酸具有高的同源性(同源性為80%以上，優選90%以上，更優選95%以上，進一步優選98%以上)的鹼基序列構成的多核苷酸是能夠雜交的。如上所述，標誌多核苷酸以與固定於基準點上的任意的探針多核苷酸雜交的方式進行設計，且具有螢光標記，因此，即使靶多核苷酸不與探針雜交在基準點上也應該能檢測到螢光。未檢測到螢光或螢光的值較低是指在基準點上探針多核苷酸從微陣列上消失，即，檢測用點上的探針多核苷酸也同樣消失。或者，是指在雜交反應中具有缺陷。因此，測定基準點上的螢光，判定是否滿足規定值，從而，能夠判斷微陣列是否退化，換而言之，能夠判斷微陣列的可靠性。另外，能夠判定雜交反應的可靠性。雖然標誌多核苷酸的螢光標記沒有特別限制，但優選與靶多核苷酸的螢光標記相同的物質。通過使用相同的物質，使用相同的檢測器能夠整體測定雙方的螢光標記，能夠迅速且簡便地實施測定。在用於本發明的微陣列中，優選，探針多核苷酸的點(檢測用點)和基準點排列，優選配置成格子形狀。而且，優選至少存在兩處基準點，將連結任意兩處的基準點的線作為、基準線，基於距基準點的距離及與基準線的角度檢測各檢測用點的位置(點的中心)。更具體而言，由距基準點的距離及與基準線的角度(連結各檢測用點和基準點的線和基準線所成的角度)、以及期望的點間距等能夠確定各點的中心位置。另外，將檢測用點和基準點排列配置成外周為正方形或長方形的格子形狀，能夠使基準點存在於兩處其對角線上的相對的頂點上。在該情況下，檢測穿過各個基準點的兩條直線垂直相交的交點，檢測連結該交點和兩處的基準點的兩條結線。而且，算出結線的長度，通過以預先確定的個數(四角形的外周上的點數-I)分割該距離，求出結線上的各點間隔，能夠由該點間隔檢測各點位置。例如，假設使用點為4行X4列的微陣列。此時，結線上的點數為四點。若結線的長度為900 iim，則900+(4-1) = 300，點間隔為300 y m。使用上述微陣列，能夠將在結線上從基準點移動300 y m的位置設定為點的中心，另外，在結線上從該中心移動300 iim的位置為下一點的中心。構成基準線的兩處基準點優選存在於在微陣列上排列的點群中較遠的位置。檢 測用點和基準點配置成外周為四角形的格子形狀，優選基準點存在於四角形的不同的頂點上。作為用於測定檢測用點和基準點上的螢光的檢測器，使用例如雷射螢光顯微鏡、冷卻CCD相機及連結計算機的螢光掃描裝置，能夠自動測定微陣列上的螢光強度。代替CCD相機也可以使用共聚焦型或非聚焦型的雷射器。由此，得到圖像數據。由得到的數據能夠相對於固定於微陣列上的探針多核苷酸鑑定具有互補性的靶多核苷酸，據此，可製成基因表達譜，確定多核苷酸的鹼基序列。用於本發明的微陣列在載體上固定有探針多核苷酸及探針多核苷酸混合物。作為載體的材料，能夠使用在該技術領域公知物質，沒有特別限制。例如，可列舉鉬、鉬黑、金、鈀、銠、銀、水銀、鎢及它們的化合物等貴金屬，及石墨、碳纖維所代表的碳等導電材料；單晶矽、非晶矽、碳化矽、氧化矽、氮化矽等所代表的矽材料，SOI (絕緣體上矽)等所代表的這些矽材料的複合材料；玻璃、石英玻璃、氧化鋁、藍寶石、陶瓷、鎂橄欖石、感光性玻璃等無機材料；聚乙烯、乙烯、聚丙烯、環狀聚烯烴、聚異丁烯、聚對苯二甲酸乙二酯、不飽和聚酯、含氟樹脂、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯醇縮醛、丙烯酸樹脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、縮醛樹脂、聚碳酸酯、聚醯胺、酚醛樹脂、脲醛樹脂、環氧樹脂、密胺樹脂、苯乙烯-丙烯腈共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、聚苯醚及聚碸等有機材料等。雖然載體的形狀也沒有特別限制，但優選為平板狀。作為載體，優選使用在表面具有碳層和化學修飾基團的載體。在表面具有碳層和化學修飾基團的載體包含在基質的表面具有碳層和化學修飾基團的物質，及在由碳層構成的基質的表面上具有化學修飾基團的物質。作為基質的材料，能夠使用在該技術領域公知的物質，沒有特別限制，能夠使用與作為上述的載體材料列舉的物質一樣的物質。優選使用具有微細的平板狀構造的載體。雖然形狀不限於長方形、正方形及圓形等，但通常使用I 75mm四方的形狀,優選使用I IOmm四方的形狀,更優選使用3 5mm四方的形狀。因為容易製造微細的平板狀構造的載體，所以優選使用由矽材料或樹脂材料構成的基質，特別優選在由單晶矽構成的基質的表面具有碳層及化學修飾基團的載體。在單晶矽中，也包含結晶軸的方向逐部分極小地變化的物質(也有時稱為嵌鑲晶體)及含有原子尺度的混亂(晶格缺陷)的物質。
作為基底上形成的碳層，雖然沒有特別限制，但優選使用合成金剛石、高壓合成金剛石、天然金剛石、軟金剛石(例如，類金剛石碳)、無定形碳、碳系物質(例如，石墨、富勒烯、碳納米管)中的任意種，或它們的混合物，或使它們層疊的物質。另外，也可以使用碳化鉿、碳化鈮、碳化矽、碳化鉭、碳化釷、碳化鈦、碳化鈾、碳化鎢、碳化鋯、碳化鑰、碳化鉻、碳化鑰;等碳化物。在此，軟金剛石統稱為所謂的類金剛石碳(DLC :Diamond LikeCarbon)等,金剛石和碳的混合物即不完全金剛石構造體，其混合比例沒有特別限定。碳層的形成能夠用公知的方法進行。例如，可列舉微波等離子體CVD(Chemicalvapor deposit)法、ECRCVD(Electric cyclotron resonance chemical vapor deposit)法、ICP(Inductive coupled plasma)法、直流灘身寸法、ECR(Electric cyclotronresonance)派射法、離子蒸氣沉積法、電弧蒸鍍法、雷射蒸鍍法、EB(Electron beam)蒸鍍法、電阻加熱蒸鍍法等。在基質的表面形成碳層的情況下，碳層的厚度通常為單分子層 100 Pm左右，若過薄則底層基質的表面可能會局部露出，相反若變厚則生產性變差，因此，優選2nm Ium,更優選 5nm 500nm。 通過在形成有碳層的基質的表面導入化學修飾基團，能夠將寡核苷酸探針牢固地固定於載體上。只要是本領域的技術人員就能夠適當選擇導入的化學修飾基團，沒有特別限制，例如，可列舉氨基、羧基、環氧基、甲醯基、羥基及活性酯基。氨基的導入例如能夠通過在氨氣中對碳層照射紫外線或等離子體處理碳層來實施。或，在氯氣中照射紫外線氯化碳層，進一步在氨氣中通過紫外線照射進行實施。或，也能通過使亞甲基二氨、乙二胺等多元氨類氣體與氯化的碳層反應實施。羧基的導入例如能夠通過如上所述使氨化的碳層與適當的化合物反應來實施。作為用於導入羧基的化合物，例如，可列舉由式A-Ri-COOIK式中，X表示滷原子，R1表示碳數10 12的二價的烴基)所表示的滷代羧酸，例如氯乙酸、氟乙酸、溴乙酸、碘乙酸、2-氯丙酸、3-氯丙酸、3-氯丙烯酸、4-氯苯甲酸；由式H00C-R2-C00H(式中，R2表示單鍵或碳數I 12的二價的烴基)所表示的二羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、鄰苯二甲酸、聚丙烯酸；聚甲基丙烯酸、偏苯三酸、丁烷四羧酸等多元羧酸；由式r3-co-r4-cooh(式中，R3表示氫原子或碳數I 12的二價的烴基，R4表示碳數I 12的二價的烴基)所表示的酮酸或醛酸；由式X-0C-R5-C00H(式中，X表示滷原子，R5表示單鍵或碳數I 12的二價的烴基。)所表示的二羧酸的一滷化物，例如一氯化丁二酸、一氯化丙二酸；鄰苯二甲酸酐、丁二酸酐、草酸酐、馬來酸酐、丁烷四羧酸酐等酸酐。環氧基的導入例如能夠通過如上所述使氨化的碳層與適當的多元環氧化合物反應來實施。或者，能夠通過使碳層含有的碳碳雙鍵與有機過酸反應得到。作為有機過酸，可列舉過氧乙酸、過氧苯甲酸、過氧鄰苯二甲酸、過氧蟻酸、三氟過氧乙酸等。甲醯基的導入例如能夠通過如上所述使氨化的碳層與戊二醛反應來實施。羥基的導入例如能夠通過如上所述使氯化的碳層與水反應來實施。活性酯基是指在酯基的醇側具有酸度高的吸電子基團活化親核反應的酯基，即反應活性高的酯基。該酯基在酯基的醇側具有吸電子基團，比烷基酯活性更高。活性酯基具有相對於氨基、硫醇基、氫氧基等基團的反應性。更具體而言，苯酚酯類、苯硫酚酯類、N-羥基胺基酯類、氰基甲酯、雜環羥基化合物的酯類等以具有遠高於烷基酯等的活性的活性酯基被熟知。更具體而言，作為活性酯基，例如，可舉出對硝基苯基、N-羥基琥珀醯亞胺基、琥珀醯亞胺基、鄰苯二甲醯亞胺基、5-降冰片烯-2，3-二甲醯亞胺基等，特別優選使用N-羥基琥珀醯亞胺基。活性酯基的導入例如能夠通過如上所述用氰胺或碳二亞胺(例如，1-[3_( 二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺)等脫水縮合劑和N-羥基琥珀醯亞胺等化合物活性酯化導入的羧基來實施。通過該處理，經由醯胺鍵在烴基的末端能夠形成N-羥基琥珀醯亞胺基等活性酯基鍵合的基團(日本特開2001-139532)。
將探針多核苷酸及探針多核苷酸混合物分別溶解在點化用緩衝劑中製備點化用溶液，將其分注到96孔或384孔的塑料板上，將分注的溶液通過點焊裝置等點化在載體上，從而能夠製造微陣列。或，也可以將點化溶液用微吸液管進行手動點化。點化後，使探針多核苷酸及探針多核苷酸混合物結合在載體上進行反應，優選進行溫育。溫育通常在-20 100°C,優選0 90°C的溫度下,通常用0. 5 16小時,優選I 2小時進行。溫育優選在高溼度的氣氛，例如，溼度50 90%的條件下進行。溫育後，為了除去未結合在載體上的DNA，因此，優選使用清洗液(例如，50mM TBS/0. 05%Tween20,2XSSC/0. 2% SDS溶液、超純水等)進行清洗。在本發明的一實施方式中，優選在通過清洗微陣列，除去未反應的靶多核苷酸的工序之後，在實際的測定，即測定固定有探針多核苷酸的各檢測用點上的螢光之前，進一步實施以下的工序。下述工序可以在測定基準點上的螢光之前實施，也可以在之後實施。包括分別測定多個點的距點的中心有一定距離的位置的亮度，得到多個背景值的工序，算出代表得到的多個背景值的背景代表值的工序，及對於所有的點或對於測定背景值的所有的點，分別算出背景值和背景代表值的差，在存在具有規定值以上的差的點的情況下判斷為不可測定的工序。在此，點包含檢測用點和基準點雙方。作為得到背景值的多個點，優選測定排列配置於微陣列上的點中至少形成外周的所有的點的背景值。另外，雖然不需要對所有的點的背景值進行測定，但也可以對所有的點的背景值進行測定。測定背景值的多個點例如在檢測用點和基準點配置成外周為四角形的格子形狀的情況下，通常為四角形的至少兩個頂點，優選四角形的至少四個頂點，更優選最外周的所有點。更具體而言，為16行X16列的點時的最外周的60點，或為16行X 16列的點時的所有點即256點。測定距點的中心一定範圍的每個位置的亮度並作為背景值時，距中心一定的範圍基於點的大小和點間隔等適當設定。例如，能夠設定在距點的中心一定距離以上，將點間隔長作為一邊、將點的中心位置作為中心的四角形的範圍內。例如,在距點中心70iim以上，一邊為1000 Pm的四角形的範圍內，優選在距點中心70 m以上，一邊為380 y m的四角形的範圍內。另外，可以將測定的一定範圍的位置的所有點或一部分點的亮度的平均值作為背景值，也可以僅測定一定範圍的位置的一點的亮度並將其作為背景值。點的中心的定位方法沒有特別限制，例如，能夠設定檢測各點中具有規定螢光強度(例如，3000以上)的部分的中心。或者，也可以將連結兩處的基準點的中心的線作為基準線，由距基準點的距離及與基準線的角度，以及點間距等確定各點的中心位置。背景代表值雖然只要是代表測定的多個背景值的值就沒有特別限制，但優選多個背景值的平均值或中間值。分別算出對於所有的點或對於測定背景值的所有的點的背景值和背景代表值的差，在存在具有規定值以上的差的點的情況下，能夠判定在點周圍的背景值中偏差較大，因此，能夠判定為由該微陣列清洗不充分、可靠性欠缺引起的不可測定。在此，規定值由於條件等而不同，例如，在圖像的顯示為16位灰度時能夠設定為1000以上。圖像的顯示為例如8位灰度時，能夠設定比50還小的值。在本發明的另一實施方式中，優選在通過清洗微陣列除去未反應的靶多核苷酸的工序之後，在實際的測定，即測定固定有探針多核苷酸的各檢測用點上的螢光之前，進一步實施以下的工序。下述工序可以在測定基準點上的螢光之前實施，也可以在之後實施。包括分別測定多個點的距點的中心一定距離的位置的亮度，得到多個背景值的
工序，計算多個背景值的平均值或中間值作為背景代表值的工序， 在背景代表值為規定值以上的情況下判斷為不可測定的工序。在此，點中包含檢測用點和基準點雙方。作為得到背景值的多個點，優選測定排列配置於微陣列上的點中至少形成外周的所有的點的背景值。另外，雖然不需要對所有的點的背景值進行測定，但也可以對所有的點的背景值進行測定。測定背景值的多個點例如在檢測用點和基準點配置成外周為四角形的格子形狀的情況下，通常為四角形的至少兩個頂點，優選四角形的至少四個頂點，更優選最外周的所有點。更具體而言，為16行X16列的點時的最外周的60點，或為16行X 16列的點時的所有點即256點。關於距點的中心一定的距離，及中心的確定方法，如上所述。在多個背景值的平均值或中間值即背景代表值為規定值以上的情況下，能夠判定點周圍的背景值整體較大，因此，能夠判定為由該微陣列清洗不充分，可靠性欠缺引起的不可測定。在此，規定值由於條件等而不同，例如，在16位時能夠設定為1000以上。本發明另外涉及一種用於如上所述的探針多核苷酸和靶多核苷酸的雜交的檢測的試劑盒。本發明的試劑盒包含具有分別添加多種探針多核苷酸的多個固定的檢測用點，及一處以上的固定有兩種以上固定於檢測用點上的探針多核苷酸的基準點的微陣列，以及與固定於檢測用點上的探針多核苷酸中的任意種雜交的螢光標記的標誌多核苷酸。探針多核苷酸、靶多核苷酸、探針多核苷酸混合物、微陣列、及標誌多核苷酸等如上所述。本發明的試劑盒還可以包含雜交緩衝液、清洗緩衝液、微孔板、尼龍膜等。下面，雖然使用實施例更詳細地說明本發明，但本發明的技術範圍不限於以下的實施例。實施例實施例I載體的製備在3_角的矽基質上使用離子蒸氣沉積法，以下述條件製備兩層膜的DLC層。表I
權利要求
1.ー種使用微陣列檢測探針多核苷酸和靶多核苷酸的雜交的方法，包含 1)使具有分別添加多種探針多核苷酸的多個固定的檢測用點、及ー處以上的固定有兩種以上固定於檢測用點上的探針多核苷酸的基準點的微陣列與螢光標記的靶多核苷酸接觸的エ序； 2)通過清洗微陣列除去未反應的靶多核苷酸的エ序； 3)測定基準點上的螢光，若滿足規定值則判斷為可測定的エ序；及 4)若判斷為可測定，則測定固定有探針多核苷酸的各檢測用點上的螢光的エ序。
2.如權利要求I所述的方法，在基準點上固定有各類固定於檢測用點上的探針多核苷酸。
3.如權利要求I或2所述的方法，與微陣列接觸的靶多核苷酸必須包含與固定於基準點上的探針多核苷酸雜交的多核苷酸。
4.如權利要求I 3中任一項所述的方法，在微陣列中，排列配置有檢測用點和基準點，基準點至少存在兩處，將連結任意兩處的基準點的線作為基準線，基於距基準點的距離和與基準線的角度檢測檢測用點的位置。
5.如權利要求4所述的方法，檢測用點和基準點配置成外周為四角形的格子形狀，在四角形的不同的頂點上存在基準點。
6.如權利要求I 5中任一項所述的方法，在微陣列中，檢測用點和基準點排列配置成外周為正方形或長方形的格子形狀，在其對角線上的頂點上存在兩處基準點， 檢測穿過各基準點的兩條直線垂直相交的交點， 檢測連結所述交點和各基準點的兩條結線的長度， 由所述結線的長度和點數檢測結線上的各檢測用點位置。
7.如權利要求I 6中任一項所述的方法，標誌多核苷酸與固定於檢測用點上的探針多核苷酸中的任意種和互補的多核苷酸具有95%以上的同源性。
8.ー種試劑盒，其用於檢測探針多核苷酸和靶多核苷酸的雜交，包含 具有分別添加多種探針多核苷酸的多個固定的檢測用點，及ー處以上的固定有兩種以上固定於檢測用點上的探針多核苷酸的基準點的微陣列，以及與固定於檢測用點上的探針多核苷酸中的任意種雜交的突光標記的標誌多核苷酸。
9.如權利要求8所述的試劑盒，在基準點上固定有各類固定於檢測用點上的探針多核苷酸。
全文摘要
本發明的目的在於提供一種客觀地判定每個微陣列的性能退化或清洗不充分等以及雜交失敗的方法，具體而言，涉及一種使用微陣列檢測探針多核苷酸和靶多核苷酸的雜交的方法，包含1)使具有分別添加多種探針多核苷酸的多個固定的檢測用點、及一處以上的固定有兩種以上固定於檢測用點上的探針多核苷酸的基準點的微陣列與螢光標記的靶多核苷酸接觸的工序，2)通過清洗微陣列除去未反應的靶多核苷酸的工序，3)測定基準點上的螢光，若滿足規定值則判斷為可測定的工序，及4)若判斷為可測定，則測定固定有探針多核苷酸的各檢測用點上的螢光的工序。
文檔編號C12N15/09GK102686746SQ201080059469
公開日2012年9月19日 申請日期2010年12月13日 優先權日2010年1月4日
發明者伊藤茜, 山野博文, 平山幸一 申請人:東洋鋼鈑株式會社