固定化脂肪酶LipozymeTLIM作為不對稱Michael加成反應催化劑的應用的製作方法

2023-09-19 04:28:10 2

專利名稱：固定化脂肪酶Lipozyme TLIM作為不對稱Michael加成反應催化劑的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及物質的新應用，特別涉及固定化脂肪酶Lipozyme TLIM作為不對稱 Michael加成反應催化劑的應用。
背景技術：
由活潑亞甲基化合物形成的碳負離子對a，不飽和羰基化合物的碳碳雙鍵 的親核加成，是活潑亞甲基化合物烷基化的一種重要方法，該反應稱為Michael加成反應。 Michael加成反應通常是由鹼催化，或者是由胺和羧酸或路易斯酸聯合進行的均相催化，這 些催化劑的使用造成了一些環境問題。因此，近年來越來越多的注意力轉移到環境友好的 催化劑上。生物催化劑作為一種綠色、有效的催化劑在有機合成的應用中正逐步增多。水 解酶(主要為脂肪酶和蛋白酶)作為一種新穎的生物催化劑，由於其對很多底物都具有高 穩定性和高催化活性，已用於Michael加成反應中。但迄今為止，酶催化的不對稱Michael 加成反應尚未見文獻報導。

發明內容
有鑑於此，本發明的目的之一在於提供固定化脂肪酶Lipozyme TLIM作為不對 稱Michael加成反應催化劑的應用，具有底物適用性廣、催化活性和選擇性好、容易操作、 能夠回收再利用等優點；目的之二在於提供利用固定化脂肪酶Lipozyme TLIM催化不對稱 Michael加成反應的方法，產物收率高，選擇性好。為達到上述目的，本發明提供如下技術方案1、固定化脂肪酶Lipozyme TLIM作為不對稱Michael加成反應催化劑的應用。2、利用固定化脂肪酶Lipozyme TLIM催化不對稱Michael加成反應的方法，是以 固定化脂肪酶Lipozyme TLIM為催化劑，將Michael受體和Michael給體在含水有機溶劑 中反應，水與有機溶劑的體積比為0 30 100，反應溫度為25°C 85°C，Michael受體和 Michael給體的投料摩爾比為1 5 1 2。進一步，所述有機溶劑為四氫呋喃、二甲亞碸、N, N-二甲基甲醯胺或乙醇，水與有 機溶劑的體積比為10 100或20 100 ；所述反應溫度為35°C或65°C ；所述Michael受 體和Michael給體的投料摩爾比為2 5 1 ；進一步，所述有機溶劑為二甲亞碸，水與有機溶劑的體積比為10 100;所述反應 溫度為35°C ；所述Michael受體和Michael給體的投料摩爾比為3:1;進一步，所述Michael受體為芳香環或雜環取代的0 _硝基烯烴，或a，0 -不飽 和環酮；所述Michael給體為1，3-二羰基化合物或環酮。本發明的有益效果在於本發明提供了固定化脂肪酶Lipozyme TLIM作為不對稱 Michael加成反應催化劑的應用，具有底物適用性廣、催化活性和選擇性好、容易操作、能夠 回收再利用等優點；還提供了利用該固定化脂肪酶Lipozyme TLIM催化不對稱Michael加成反應的方法，產物收率高，選擇性好。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面對本發明的優選實施例進 行詳細的描述。優選實施例中使用的固定化脂肪酶Lipozyme TLIM(來源於疏棉狀嗜熱絲孢菌 (Thermomyces lanuginosus)，EC 3. 1. 1. 3,0. 25U/mg)購自諾維信(中國)投資有限公司。 除另有說明外，所有試劑均來源於商業渠道且未經進一步純化。優選實施例中採用薄層色譜法(GF254矽膠板)監測反應進程；快速柱色譜法採用 100 200目矽膠加壓柱；非對映異構體比例(dr)採用核磁共振氫譜(1HNMR)和高效液相 色譜手性固定相法測定，1HNMR採用Bruker AV-300型核磁共振儀(以TMS為內標)，手性 固定相採用AD-H、OD-H、AS-H或OJ-H手性柱；ee值採用高效液相色譜手性固定相法測定， 產物的絕對構型通過與文獻報導的色譜峰保留時間進行比較確定。實施例1 11、不同酶催化的Michael加成反應 在圓底燒瓶中加入反-2，4-二氯-β-硝基苯乙烯(120mg，0. 55mmol)、丙二酸二 乙酯(177mg，l. lmmol)、去離子水(ImL)、二 甲亞碸(DMS0，5mL)和酶(400mg)，室溫(25 300C )下攪拌反應；反應完畢後，濾過，濾餅用二氯甲烷洗滌，洗液與濾液合併，加水稀釋 後，用二氯甲烷萃取，合併二氯甲烷萃取液，用無水硫酸鈉乾燥後，減壓蒸餾除去溶劑得粗 產物，將粗產物用快速柱色譜法純化，即得目標產物。反應條件及結果見表1。表1不同酶催化的Michael加成反應 由表1可知，反-2，4- 二氯-3 -硝基苯乙烯與丙二酸二乙酯的Michael加成反應， 在無酶情況下未檢測到產物生成(實施例11)；在10種測試酶中，固定化脂肪酶Lipozyme TLIM的催化活性最好，產物收率最高(實施例1)；灰輪絲鏈輪絲菌產穀氨醯胺轉胺酶、木瓜 蛋白酶、木瓜凝乳酶和木黴產纖維素酶的催化活性次之，產物收率中等(實施例2 5)；其 它5種酶的催化活性極低或無催化活性，僅檢測到痕量產物或未檢測到產物(實施例6 10)。實施例12 46、Lipozyme TLIM催化2_環己烯酮與乙醯丙酮的不對稱Michael
加成反應 在圓底燒瓶中加入2-環己烯酮、乙醯丙酮、去離子水、有機溶劑和Lipozyme TLIM，在一定溫度下攪拌反應；反應完畢後，濾過，濾餅用二氯甲烷洗滌，洗液與濾液合併， 加水稀釋後，用二氯甲烷萃取，合併二氯甲烷萃取液，用無水硫酸鈉乾燥後，減壓蒸餾除去 溶劑得粗產物，將粗產物用快速柱色譜法純化，即得目標產物。反應條件及結果見表2。表2、Lipozyme TLIM催化2_環己烯酮與乙醯丙酮的不對稱Michael加成反應
5 注實施例35 46未檢測ee值。由表2可知，固定化脂肪酶Lipozyme TLIM催化的不對稱Michael加成反應在不 同條件下都可以順利進行。以2-環己烯酮與乙醯丙酮的反應為例，反應溶劑優選由有機溶 劑和水組成，有機溶劑優選四氫呋喃(THF)、DMS0、N, N-二甲基甲醯胺(DMF)或乙醇，更優 選DMS0(實施例12 21)；水與有機溶劑的體積比優選為10 100或20 100，更優選 10 100(實施例22 28)；反應溫度優選35°C或65°C，更優選35°C (實施例29 34)； 2-環己烯酮與乙醯乙酸乙酯的投料摩爾比優選為2 5 1，更優選3 1(實施例35 40)；此外，酶量對產物收率也有影響，可以通過調節酶量以獲得較高的產物收率(實施例 41 46)。實施例47 51、4_氯-硝基苯乙烯與乙醯乙酸乙酯的不對稱Michael加成反 應 在圓底燒瓶中加入4-氯-β-硝基苯乙烯(3.0mmol)、乙醯乙酸乙酯(1. Ommol)、 去離子水(0. 5mL)、DMS0(5mL)和催化劑(200mg)，35°C攪拌反應；反應完畢後，濾過，濾餅用
二氯甲烷洗滌，洗液與濾液合併，加水稀釋後，用二氯甲烷萃取，合併二氯甲烷萃取液，用無 水硫酸鈉乾燥後，減壓蒸餾除去溶劑得粗產物，將粗產物用快速柱色譜法純化，即得目標產 物。反應條件及結果見表3。表3、4_氯- β -硝基苯乙烯與乙醯乙酸乙酯的不對稱Michael加成反應 由表3可知，4-氯-β-硝基苯乙烯與乙醯乙酸乙酯的Michael加成反應，在固定 化脂肪酶Lipozyme TLIM催化下的產物收率為90 %，在非酶蛋白如卵清蛋白催化下的產 物收率僅30%，而在無酶情況下未檢測到產物生成(實施例47，50 51)，說明Lipozyme TLIM對不對稱Michael加成反應具有催化效果，且這種催化效果不是單純由蛋白質實現 的，而是依賴於Lipozyme TLIM的催化位點和三維結構。當用絲氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶 抑制劑苯甲基磺醯氟(PMSF)，或色氨酸和酪氨酸殘基修飾劑N-溴代琥珀醯亞胺(NBS)預 處理的Lipozyme TLIM催化時，未檢測到產物生成(實施例48 49)，說明PMSF或NBS處 理使Lipozyme TLIM的催化活性完全抑制，即絲氨酸和/或巰基、以及色氨酸和/或酪氨酸 是Lipozyme TLIM必不可少的催化位點。實施例52 66、Lipozyme TLIM催化的不對稱Michael加成反應在圓底燒瓶中加入Michael受體(3. Ommol)、Michael給體(1. Ommol)、去離子水 (0. 5mL)、DMSO (5mL)和Lipozyme TLIM(200mg)，35°C攪拌反應；反應完畢後，濾過，濾餅用 二氯甲烷洗滌，洗液與濾液合併，加水稀釋後，用二氯甲烷萃取，合併二氯甲烷萃取液，用無 水硫酸鈉乾燥後，減壓蒸餾除去溶劑得粗產物，將粗產物用快速柱色譜法純化，即得目標產 物。反應條件及結果見表4。表4Lipozyme TLIM催化的不對稱Michael加成反應 注絕對構型未確定。由表4可知，Michael受體如芳香環或雜環取代的β -硝基乙烯、2_環己烯酮 與Michael給體如乙醯丙酮、乙醯乙酸乙酯、丙二酸二乙酯、環己酮的不對稱Michael加 成反應在固定化脂肪酶Lipozyme TLIM的催化下均可以順利進行，得到中等至較高收率 (30% 90% )的產物，並顯示出較好的選擇性(實施例52 66)，說明Lipozyme TLIM催 化的不對稱Michael加成反應具有底物普遍適用性，Michael受體可以是芳香環或雜環取 代的β 「硝基烯烴，或α，β -不飽和環酮；Michael給體可以是1，3_ 二羰基化合物或環酮寸。實施例67、Lipozyme TLIM的回收再利用 在圓底燒瓶中加入4-氯-β-硝基苯乙烯(3.0mmol)、乙醯乙酸乙酯(1. Ommol)、 去離子水(0. 5mL)、DMS0(5mL)和Lipozyme TLIM(200mg)，35°C攪拌反應；反應完畢後，濾 過，濾餅即酶用二氯甲烷洗滌，洗液與濾液合併，加水稀釋後，用二氯甲烷萃取，合併二氯甲 烷萃取液，用無水硫酸鈉乾燥後，減壓蒸餾除去溶劑得粗產物，將粗產物用快速柱色譜法純 化，即得目標產物；將酶再用甲醇洗滌2次，丙酮洗滌3次，室溫下乾燥後用於下一輪反應， 底物用量與第一輪反應相同。反應條件及結果見表5。表5Lipozyme TLIM的回收再利用 由表5可知，固定化脂肪酶Lipozyme TLIM在前3次循環中催化活性和非對映選 擇性逐漸降低，而第4次循環產率急劇降低，說明Lipozyme TLIM可以回收再利用3次。最後說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管通過參 照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可 以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明 的精神和範圍。
權利要求
固定化脂肪酶Lipozyme TLIM作為不對稱Michael加成反應催化劑的應用。
2.利用權利要求1所述固定化脂肪酶LipozymeTLIM催化不對稱Michael加成反應的 方法，其特徵在於以固定化脂肪酶Lipozyme TLIM為催化劑，將Michael受體和Michael 給體在含水有機溶劑中反應，水與有機溶劑的體積比為O 30 100，反應溫度為25°C 85°C, Michael受體和Michael給體的投料摩爾比為1 5 1 2。
3.根據權利要求2所述利用固定化脂肪酶LipozymeTLIM催化不對稱Michael加成 反應的方法，其特徵在於所述有機溶劑為四氫呋喃、二甲亞碸、N，N-二甲基甲醯胺或乙 醇，水與有機溶劑的體積比為10 100或20 100;所述反應溫度為35°C或65°C ；所述 Michael受體和Michael給體的投料摩爾比為2 5 1。
4.根據權利要求3所述利用固定化脂肪酶LipozymeTLIM催化不對稱Michael加成反 應的方法，其特徵在於所述有機溶劑為二甲亞碸，水與有機溶劑的體積比為10 100;所 述反應溫度為35°C ；所述Michael受體和Michael給體的投料摩爾比為3 1。
5.根據權利要求2或3或4所述利用固定化脂肪酶LipozymeTLIM催化不對稱Michael 加成反應的方法，其特徵在於所述Michael受體為芳香環或雜環取代的β _硝基烯烴，或 α，β -不飽和環酮；所述Michael給體為1，3_ 二羰基化合物或環酮。
全文摘要
本發明涉及物質的新應用，特別涉及固定化脂肪酶Lipozyme TLIM作為不對稱Michael加成反應催化劑的應用，具有底物適用性廣、催化活性和選擇性好、容易操作、能夠回收再利用等優點；本發明還提供了利用固定化脂肪酶Lipozyme TLIM催化不對稱Michael加成反應的方法，產物收率高，選擇性好。
文檔編號C12P7/26GK101892273SQ20101020118
公開日2010年11月24日 申請日期2010年6月13日 優先權日2010年6月13日
發明者何延紅, 官智, 蔡建峰 申請人:西南大學