一種核轉錄因子突變體rFoxO3a-MTSS及其重組載體與應用的製作方法
2023-09-18 22:36:40 1
一種核轉錄因子突變體rFoxO3a-MTSS及其重組載體與應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種核轉錄因子突變體rFoxO3a-MTSS及其重組載體與應用。所述核轉錄因子突變體rFoxO3a-MTSS是通過將野生型大鼠FoxO3a肽鏈中第32位蘇氨酸、252位絲氨酸、314位絲氨酸同時替換為丙氨酸。其中，所述突變體rFoxO3a-MTSS的胺基酸序列SEQ?IDNO.1所示；編碼該突變體的核苷酸序列如SEQ?IDNO.2所示。本發明公開的突變體rFoxO3a-MTSS相對野生型rFoxO3a而言，具有能夠避免被其上遊調控因子Akt磷酸化的特點，能夠在體內保持持續活化狀態，對研究FoxO3a基因的功能及FoxO3a基因有關疾病的靶向治療均具有重要的科學意義與潛在應用價值。
【專利說明】—種核轉錄因子突變體rFox03a-MTSS及其重組載體與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種轉錄因子突變體，特別涉及一種核轉錄因子突變體rFOX03a-MTSS及其重組載體與應用。
【背景技術】
[0002]核轉錄因子Fox03a 可通過調節 Bim、Fas Iigand(FasL)、TNFR2、p27、p53、抗氧化物酶等多種下遊靶基因的轉錄而發揮促細胞凋亡、細胞周期阻滯及抗氧化等不同的生物學功能。既往研究表明，Fox03a廣泛分布於哺乳動物的多種組織和細胞中，並參與糖代謝、骨骼肌的分化發育、血管發生、抑制細胞增殖、抑制心肌肥厚等生理和病理過程。因此，研究不同病理及生理條件下Fox03a轉錄因子的功能越來越受到人們的廣泛關注。Akt是哺乳細胞中廣譜存在的經典信號分子，可通過促進Fox03a的磷酸化而使其失活，從而給體內研究Fox03a基因的功能造成了巨大困難。
[0003]目前，國內外的研究重點放在了人類組織及細胞中Fox03a的功能研究。在人體組織及細胞中，Fox03a在體內可被其上遊調控因子Akt磷酸化其Thr-32、Ser_253及Ser-315等位點而導致轉錄因子Fox03a失活。然而，大鼠已經成為研究人類重大疾病的經典模式動物，尤其是在一些需要進行外科手術的疾病模型中，大鼠比小鼠更具有優勢，越來越受到人們的關注。然而，人源及大鼠來源的Fox03a基因序列存在一定差異，而且其在體內被Akt激活的位點不同。因此，本發明利用基因操作技術，構建大鼠Fox03a基因的突變體及其重組質粒，使其能夠擺脫Akt磷酸化的影響而在體內持續活化，為利用大鼠模型研究Fox03a基因的功能及相關疾病的治療提供了強有力的手段，可廣泛應用於Fox03a基因相關的大鼠細胞及動物模型研究，具有重要的科學意義與應用價值。
【發明內容】
[0004]本發明的首要目的在於克服現有技術的缺點與不足，提供一種核轉錄因子突變體rFox03a-MTSS。
[0005]本發明的另一目的在於提供含有編碼上述核轉錄因子突變體rFoX03a-MTSS核苷酸序列的重組載體。
[0006]本發明的再一目的在於提供上述重組載體的應用。
[0007]本發明的目的通過下述技術方案實現:
[0008] —種核轉錄因子突變體rFox03a_MTSS,其胺基酸序列如下所示:
MAEAPASPVPLSPLEVELDPEFEPQSRPRSC § WPLQRPELQASPAKPSGETAADSMIPEE60DDDEDDEDSGGRG
SSAMVIGGGVSSALGSGLLLEDSARLLSPGGQDLGTGPASSAGALSG I20GTQTQLQPQQPLPPPQPGAAGGSGQPRKCSSRRNAWGNLSYADLITRAIESSPDKRLTLS 180QIYEWMVRCVPYFKDKGDSNSSAGWKNSIRHNLSLHSR
FMRVQNEGTGKSSffffIINPDGG 240KSGKAPRRRAV MDNSNKYTKSRGRAAKKKAALQAAPESADDSPSQLSKWPGSPTSRSSD 300ELDAWTDFRSRTN § NASTVSGRLSPILASTELDDVQDDDGPLSPMLYSSSASLSPSVSKP
360CTVELPRLTDMAGTMNLNDGLAENLMDDLLDNIALPPSQASPPGGLMQRSSSFPYTAKSS 420GLGSPTSSFNSTVFGPASLNSLRQSPMQTIQENRPATFSSVSHYGNQTLQDLLTSDSLSH 480SDVMMTQSDPLMSQASTAVSAQNARRNVMLRNDPMMSFAAQPTQGSLVNQNLLHHQHQTQ 540GALGGSRALSNSVSNMGLSDSSSLGSAKHQQQSPVSQSMQTLSDSLSGSSLYSASANLPV 600MGHDKFPSDLDLDMFNGSLECDMESIIRSELMDADGLDFNFDSLISTQNVVGLNVGNFTG 660AKQASSQSWVPG*672
[0009] 編碼上述核轉錄因子突變體rFox03a-MTSS的核苷酸序列如下所示:1ATGGCAGAGGCACCAGCCTC CCCGGTCCCG CTCTCTCCGC TCGAAGTGGA GCTGGACCCA61 GAGTTCGAGC CACAGAGTCG
GCCACGCTCC TGT @ TGGC CCCTGCAGAG GCCGGAGCTG121 CAGGCGAGCC CGGCCAAGCC
CTCGGGGGAGACGGCGGCAG ACTCCATGATCCCCGAGGAG18I GACGACGATG AAGACGACGA
GGACAGCGGCGGCCGAGGCA GCTCGGCCATGGTGATCGGT241 GGCGGCGTGA GCAGTGCGCT
GGGCTCCGGGCTGCTCCTCG AAGATTCGGCCAGGCTGCTG301 TCTCCCGGAG GGCAGGACCT
CGGGACGGGGCCAGCGTCCT CCGCAGGCGCGCTGAGTGGG36I GGCACGCAGA CGCAGCTGCA
GCCTCAGCAGCCACTGCCAC CGCCGCAGCCGGGGGCGGCT421 GGGGGCTCTG GGCAACCGAG
GAA ATGCTCCTCGCGGCGGA ATGCCTGGGGGAACCTGTCC481 TACGCTGACC TGATCACCCG
CGCCATCGAGAGCTCCCCGG ACAAACGGCTCACTTTGTCC541 CAGATCTACG AGTGGATGGT
GCGCTGTGTGCCCTACTTCA AGGATAAGGGCGACAGCAAC601 AGCTCTGCGG GCTGGAAGAA
CTCCATCCGCCACAACCTGT CACTGCACAGCCGTTTCATG661 CGGGTTCAGA ACGAAGGGAC
TGGCAAGAGCTCTTGGTGGA TCATCAACCCCGATGGGGGA72I AAGAGTGGGA AGGCTCCCCG
GCGGCGGGCC GTC 回 TGG ACAACAGCAA CAAGTACACC78I AAGAGCCGAG GCCGGGCAGC
CAAGAAGAAG GCGGCCCTGC AGGCTGCCCC AGAGTCGGCA841 GACGACAGCC CTTCCCAACTCTCCAAGTGG CCGGGCAGCC CCACATCCCG CAGCAGCGAC90I GAGCTGGACG CCTGGACCGA
CTTCCGCTCG CGCACCAAT 舊—(? AACGCCAG CACCGTGAGC961 GGCCGCCTGT CACCCATCTT
GGCGAGCACGGAGCTGGATG ACGTCCAGGACGATGACGGG102ICCCCTCTCCCCCATGCTCTA
CAGCAGCTCTGCCAGCCTGT CGCCTTCCGTAAGCAAGCCG108ITGTACCGTGGAGCTGCCGCG
GCTGACTGACATGGCGGGCA CCATGAATCTGAACGATGGG1141CTGGCCGAGAACCTCATGGA
TGACCTGCTAGATAACATCG CGCTCCCGCCCTCCCAGGCG1201TCGCCTCCTGGCGGGCTTAT
GCAGCGGAGCTCCAGCTTCC CGTACACCGCCAAGAGCTCC1261GGCCTGGGCTCCCCAACCAG
CTCCTTTAACAGTACCGTGT TCGGACCTGCGTCACTCAAC1321TCCCTGCGCC AGTCGCCCAT
GCAGACCATCCAGGAGAACA GACCAGCCACCTTTTCTTCC1381GTGTCGCACTACGGCAACCA
GACACTCCAAGACCTGCTCA CTTCGGACTCGCTCAGCCAC1441AGCGATGTCATGATGACCCA
GTCAGACCCCTTGATGTCTC AGGCTAGCACCGCTGTGTCC1501GCCCAGAACGCCCGCCGGAA
CGTGATGCTTCGCAACGACC CAATGATGTCCTTTGCCGCC1561CAGCCTACCCAGGGGAGTTT
GGTCAATCAGAACTTGCTCC ACCACCAGCACCAAACCCAG1621GGCGCTCTTG GTGGCAGCCG
TGCCTTGTCAAATTCTGTCA GCAACATGGGCTTGAGTGAC168ITCCAGCAGCC TCGGCTCAGC
CAAACACCAGCAGCAGTCTC CCGTCAGCCAGTCTATGCAA1741ACCCTCTCGGACTCTCTCTC
AGGCTCCTCACTGTATTCAG CCAGTGCAAACCTTCCCGTC1801ATGGGTCACGACAAGTTCCCCAGTGACTTG GACCTGGACA TGTTCAATGG GAGCTTGGAG186I TGTGACATGG AGTCCATCATCCGTAGCGAA CTCATGGATG CCGATGGGTT GGATTTTAAC1921 TTTGACTCCC TCATCTCCACACAGAACGTT GTTGGTTTGA ACGTGGGGAA CTTCACTGGT1981 GCTAAGCAGG CCTCATCTCAAAGCTGGGTG CCAGGCTGA
[0010]一種重組載體，含有編碼上述核轉錄因子突變體rFOX03a-MTSS的核苷酸序列；
[0011]所述的重組載體優選為將編碼上述核轉錄因子突變體rFox03a-MTSS的核苷酸序列克隆到真核細胞表達載體上得到；
[0012]所述的真核細胞表達載體優選為pEGFP-Nl ；
[0013]所述的重組載體優選為pEGFP-rFox03a_MTSS，其通過如下具體步驟製備得到:
[0014](I)根據NCBI資料庫中大鼠Fox03a(rFox03a)基因(ΝΜ_001106395)的序列信息，設計PCR引物，擴增野生型大鼠Fox03a基因的CDS編碼區的全長序列，並將其克隆到PEASY-T3克隆載體中，得到重組載體pEASY-rFox03a-CDS ；
[0015](2)利用KOD-Plus-Mutagenesis突變試劑盒，設計突變引物，將重組載體pEASY-rFox03a-CDS中編碼Fox03a肽鏈中第32位蘇氨酸的鹼基ACG突變為GCG，從而將野生型大鼠Fox03a肽鏈中第32位的蘇氨酸替換為丙氨酸，得到突變體重組載體pEASY-rFox03a-MT32 ；
[0016](3)利用KOD-P lus-Mutagenesis突變試劑盒，設計突變引物，將重組載體PEASY-rFox03a-MT32中編碼Fox03a肽鏈中第252位絲氨酸的鹼基TCC突變為GCC，從而將突變體pEASY-rFox03a-MT32所編碼肽鏈中第252位的絲氨酸替換為丙氨酸，得到突變體重組載體 pEASY-rFox03a-MT32S252 ；
[0017](4)利用KOD-Plus-Mutagenesis突變試劑盒，設計突變引物，將重組載體pEASY-rFox03a-MT32S252中編碼Fox03a肽鏈中第314位絲氨酸的鹼基TCC突變為GCC，從而將突變體pEASY-rFox03a-MT32S252所編碼肽鏈中第314位的絲氨酸替換為丙氨酸，得到突變體重組載體 pEASY-rFox03a-MT32S252S314 ；
[0018](5)設計5』端分別包含Xho I及Sac II酶切位點的引物序列對，以突變體重組載體pEASY-rFox03a-MT32S252S314為模板擴增突變後的Fox03a基因編碼序列(不包含終止密碼子)，將其克隆到pEGFP-Nl表達載體上，得到突變體重組載體pEGFP-rFox03a-MTSS。
[0019]步驟(1)中所述的PCR引物為⑶S-F與⑶S-R，其序列如下所示:
[0020]CDS-F:5，-GAGAGGAGAGAGCAAGAGCCCA-3，；
[0021]CDS-R:5，-CTCAGTGATCCTTCAGCCTGGC-3，；
[0022]步驟(2)中所述的突變引物為MT32-F及MT32-R，其序列如下所示:
[0023]MT32-F:5』 -TGTGCGTGGCCCCTGCAGAGGCCGGAGCT-3』 ；
[0024]MT32-R:5， -GGAGCGTGGCCGACTCTGTGGCTCGAACT-3，；
[0025]步驟(3)中所述的突變引物為MS252-F及M S252-R，其序列如下所示:
[0026]MS252-F:5， -GTCGCCATGGACAACAGCAACAAGTACAC-3，；
[0027]MS252-R:5， -GGCCCGCCGCCGGGGAGCCTTCCCACTCTT T_3，；
[0028]步驟⑷中所述的突變引物為MS314-F及MS314-R，其序列如下所示:
[0029]MS314-F:5， -AATGCCAACGCCAGCACCGTGAGCGGCCG-3，；
[0030]MS314-R: 5 』 -GGTGCGCGAGCGGAAGTCGGTCCAGGCGT-3，；[0031]步驟(5)中所述的包含Xho I及Sac II酶切位點的引物為⑶SM-F與⑶SM-R，其序列如下所示:
[0032]CDSM-F:5，-CCGCTCGAGATGGCAGAGGCACCAGCCTC-3，；
[0033]CDSM-R:5，-TCCCCGCGGGCCTGGCACCCAGCTTTGAG-3』 ；
[0034]所述的重組載體可應用於研究Fox03a基因的功能以及Fox03a基因有關疾病的靶向治療。
[0035]本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果:
[0036]與野生型Fox03a基因編碼的蛋白相比，本發明中的核轉錄因子突變體rFox03a-MTSS在其編碼肽鏈的第32、252及314等三個位點的胺基酸同時存在突變，均突變為丙氨酸。所述突變體編碼的融合蛋白可在細胞內有效表達，能夠避免細胞內Akt蛋白的磷酸化而保持體內持續激活狀態，不僅可實現細胞內Fox03a的穩定高表達，同時為利用大鼠模型研究Fox03a基因的功能及相關疾病的治療提供了強有力的手段，可廣泛應用於Fox03a基因相關的大鼠細胞及動物模型研究，具有重要的科學意義與應用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0037]圖1是本發明所述重組載體pEGFP-rFox03a_MTSS轉染293T細胞的螢光顯微鏡圖，其中，對照為空白對照組，pEGFP-Nl為空載體pEGFP-Nl轉染組，pEGFP-rFox03a_WT為重組載體pEGFP-rFox03a-WT轉染組， [0038]PEGFP-rFox03a-MTSS為重組載體pEGFP-rFox03a_MTSS轉染組；螢光為螢光顯微鏡觀察圖片；白光為白光顯微鏡觀察圖片；合併為合併圖片；轉染時間為24小時；放大倍數為200倍。
[0039]圖2是利用Western blotting技術檢測重組載體pEGFP-rFox03a_MTSS轉染293T細胞後rFox03a蛋白及其上遊調控因子Akt的表達變化，其中，對照為空白對照組，pEGFP-Nl 為空載體 pEGFP-Nl 轉染組，pEGFP-rFox03a_WT 為重組載體 pEGFP-rFox03a_WT 轉染組，pEGFP-rFox03a-MTSS為重組載體pEGFP-rFox03a_MTSS轉染組；轉染時間均為72小時。
【具體實施方式】
[0040]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
[0041]實施例lrFox03a基因的CDS片段擴增及克隆
[0042](I)引物設計
[0043]通過GeneBank 資料庫(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/genbank)查詢大鼠Fox03a基因的mRNA信息，用Primer Primer5.0軟體設計引物CDS-F與CDS-R，用於擴增大鼠Fox03a基因⑶S編碼區。其中，所述引物序列為:
[0044]CDS-F:5，-GAGAGGAGAGAGCAAGAGCCCA-3，；
[0045]CDS-R:5，-CTCAGTGATCCTTCAGCCTGGC-3，；
[0046](2)大鼠Fox03a基因編碼區CDS的PCR擴增
[0047]用TRIzol試劑盒(Invitrogen)提取SD大鼠(購買於廣東省醫學實驗動物中心)心臟組織總RNA，並用反轉錄試劑盒(TOYOBO)合成cDNA，並稀釋至200ng/ μ L。以cDNA為模板，用KOD-Plus-Neo高保真酶(Τ0Υ0Β0)進行PCR擴增，具體反應體系如下所示:
[0048]表1大鼠Fox03a基因編碼區⑶S的PCR擴增反應體系
[0049]
【權利要求】
1.一種核轉錄因子突變體rFox03a-MTSS，其特徵在於:其胺基酸序列如SEQ IDN0.1所/Jn ο
2.編碼權利要求1所述核轉錄因子突變體rFox03a-MTSS的核苷酸序列，其特徵在於:所述的核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示。
3.—種重組載體，其特徵在於:含有權利要求2所述的核苷酸序列。
4.根據權利要求3所述的重組載體，其特徵在於:所述的重組載體為將權利要求2所述的核苷酸序列克隆到真核細胞表達載體上得到。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特徵在於:所述的真核細胞表達載體為pEGFP-Nl。
6.根據權利要求5所述的重組載體，其特徵在於:所述的重組載體為pEGFP-rFox03a-MTSS,其通過如下具體步驟製備得到: (1)根據NCBI資料庫中大鼠Fox03a基因的序列信息，設計PCR引物，擴增野生型大鼠Fox03a基因的⑶S編碼區的全長序列，並將其克隆到PEASY-T3克隆載體中，得到重組載體pEASY-rFox03a-CDS ； (2)利用KOD-Plus-Mutagenesis突變試劑盒，設計突變引物，將重組載體pEASY-rFox03a-CDS中編碼Fox03a肽鏈中第32位蘇氨酸的鹼基ACG突變為GCG，從而將野生型大鼠Fox03a肽鏈中第32位的蘇氨酸替換為丙氨酸，得到突變體重組載體pEASY-rFox03a-MT32 ； (3)利用KOD-Plus-Mutagenesis突變試劑盒，設計突變引物，將重組載體PEASY-rFox03a-MT32中編碼Fox03a肽鏈中第252位絲氨酸的鹼基TCC突變為GCC，從而將突變體pEASY-rFox03a-MT32所編碼肽鏈中第252位的絲氨酸替換為丙氨酸，得到突變體重組載體 pEASY-rFox03a-MT32S252 ； (4)利用KOD-Plus-Mutagenesis突變試劑盒，設計突變引物，將重組載體pEASY-rFox03a-MT32S252中編碼Fox03a肽鏈中第314位絲氨酸的鹼基TCC突變為GCC，從而將突變體pEASY-rFox03a-MT32S252所編碼肽鏈中第314位的絲氨酸替換為丙氨酸，得到突變體重組載體 pEASY-rFox03a-MT32S252S314 ； (5)設計5』端分別包含XhoI及Sac II酶切位點的引物序列對，以突變體重組載體pEASY-rFox03a-MT32S252S314為模板擴增突變後的Fox03a基因編碼序列，將其克隆到pEGFP-Nl表達載體上，得到突變體重組載體pEGFP-rFox03a-MTSS。
7.根據權利要求6所述的重組載體，其特徵在於: 步驟⑴中所述的PCR引物為⑶S-F與⑶S-R，其序列如下所示:
CDS-F:5，-GAGAGGAGAGAGCAAGAGCCCA-3，；
CDS-R:5』 -CTCAGTGATCCTTCAGCCTGGC-3』。
8.根據權利要求6所述的重組載體，其特徵在於: 步驟(2)中所述的突變引物為MT32-F及MT32-R，其序列如下所示:
MT32-F:5』 -TGTGCGTGGCCCCTGCAGAGGCCGGAGCT-3』 ；
MT32-R:5』 -GGAGCGTGGCCGACTCTGTGGCTCGAACT-3』 ； 步驟(3)中所述的突變引物為MS252-F及M S252-R，其序列如下所示:
MS252-F:5，-GTCGCCATGGACAACAGCAACAAGTACAC-3，；M S252-R:5， -GGCCCGCCGCCGGGGAGCCTTCCCACTCTT T_3，； 步驟(4)中所述的突變引物為MS314-F及MS314-R，其序列如下所示:
MS314-F:5，-AATGCCAACGCCAGCACCGTGAGCGGCCG-3，；
M S314-R:5』 -GGTGCGCGAGCGGAAGTCGGTCCAGGCGT-3』 ；
9.根據權利要求6所述的重組載體，其特徵在於: 步驟(5)中所述的包含Xho I及Sac II酶切位點的引物為⑶SM-F與⑶SM-R，其序列如下所示:
CDSM-F:5，-CCGCTCGAGATGGCAGAGGCACCAGCCTC-3，；
CDSM-R:5』 -TCCCCGCGGGCCTGGCACCCAGCTTTGAG-3，。
10.權利要求3~9任一項所述的重組載體在Fox03a基因的功能研究以及Fox03a基因有關疾病的靶向治療研 究中的應用。
【文檔編號】C12N15/12GK103965345SQ201410178820
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月29日 優先權日:2014年4月29日
【發明者】齊緒峰, 李昀鍵, 陳卓瑩, 夏景波, 蔡冬青, 龍穎妍, 趙天琪, 吳彩紅, 王健歡 申請人:暨南大學