蘋果抗逆相關基因MdSIMYB1的克隆及其應用的製作方法
2023-09-18 17:45:05
專利名稱：蘋果抗逆相關基因MdSIMYB1的克隆及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種蘋果抗逆相關基因MdSIMYBl的克隆及其應用，具體涉及一種蘋果抗逆基因MdSIMYBl的克隆、重組，及其轉基因蘋果、菸草在抗旱、抗鹽和抗冷等逆境方面的分析和應用，屬於分子生物學和生物技術領域。
背景技術：
蘋果作為世界四大果樹之一，是溫帶地區的主要栽培樹種。在蘋果的生長發育過程中，許多非生物脅迫是影響蘋果地理分布和產量提高的主要限制因子，尤其是高鹽、乾旱和低溫等，世界蘋果生產國都把選育抗鹽、抗旱、抗 寒等優質蘋果新品種作為主要育種目標。由於蘋果是多年生木本植物，遺傳背景複雜、雜和度高、童期長、自交親和性差等諸多問題給遺傳育種帶來了很大障礙，常規育種進展緩慢。近年來，蘋果基因組的測序(Velasco等，2010)的完成、以及迅速發展的現代生物技術為解決這些問題開闢了新途徑，通過基因工程技術有目的提高果樹抗鹽、抗旱、抗寒能力，成為果樹遺傳改良的重要研究方向，大量植物抗逆功能基因的分離和鑑定則為基因工程遺傳改良提供了目的基因。MYB類家族是指含有MYB結構域的一類轉錄因子，它是最大的植物轉錄因子基因家族之一，參與植物次生代謝調控、激素和環境因子的應答，並對細胞分化、細胞周期、器官的形成以及植物葉片的形態建成具有重要的調節作用(Martin等，1997)。目前對MYB的研究主要集中在擬南芥、水稻上等少數模式植物上，而在果樹方面研究甚少。由於諸多方面的原因，可耕土地面積越來越少，再加上世界範圍內氣候的異常變化，導致果樹的種植面積和範圍受到嚴重影響。挖掘蘋果MYB基因並進行功能研究，為果樹抗逆轉基因育種提供潛在的有效候選基因，不但具有重要的理論意義，而且具有廣泛的應用價值。蘋果轉基因育種多在蘋果砧木上進行，而蘋果砧木主要生活在地下，不開花坐果，減少了基因工程在果樹應用上的爭議。
發明內容
為了解決上述問題，本發明提供了一種蘋果抗逆相關基因MdSMYBl的克隆方法及核苷酸序列，同時提供了該基因在獲得抗逆，尤其是在抗旱、抗鹽、抗低溫的轉基因菸草和蘋果中的應用，並可應用於生產其它具有明顯抵抗乾旱、鹽鹼和低溫的轉基因植物。本發明中提供的核苷酸序列來自蘋果。本發明利用同源克隆和RACE技術獲得了蘋果新型抗逆境相關基因MdSIMYBl，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示，蛋白質胺基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。具體方法如下從經200mM NaCl鹽處理24小時的嘎啦蘋果組培苗中提取總RNA，反轉錄得到cDNA。根據國際基因庫中已發布的擬南芥中MYB基因家族的保守胺基酸序列，設計兼併引物，進行常規聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction, PCR)。將合適大小的PCR產物與PMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞，篩選重組子，並進行測序分析確認；然後通過5'和3'末端快速擴增(Rapid-amplification of cDNA ends, RACE)技術分別獲得5 ^和V端序列，並拼接成完整的cDNA序列。根據cDNA的V和Y端序列設計特異引物，以經200mM NaCl鹽處理24小時的嘎啦蘋果組培苗的cDNA為模板進行PCR擴增，得到cDNA全長序列。該基因的全長cDNA為999bp,其中包括711bp的開放閱讀框(open readingframe, 0RF)。由此推得，該基因編碼237個胺基酸，預測分子量約為26. 93kDa，等電點PI為8.03。將其胺基酸序列在國際基因庫中檢索，發現與已公布的MYB家族成員AtMYB63 (擬南芥，AK175344. I)、AtMYB72 (擬南芥，NM_104495. I)、AtMYBlO (擬南芥，NM_112118. 2)、VvMYB4 (葡萄，XM_002281466. 2)有較高的同源性，其胺基酸同源性分別為69. 23%,66. 35%、65. 38%,64. 42%。由此表明，經過上述克隆步驟得到了一個蘋果中MYB基因，又因該基因與鹽脅迫有關，所以將該基因命名為MdSIMYBl。該基因序列如下
序列表(l)SEQ. ID. NO. I 的信息(a)序列特徵長度999bp類型核酸拓撲結構線性(b)分析類型cDNA(C)假設否(d)反義否(e)最初來源蘋果(Malus domestica)(f)序列描述SEQ. ID. NO. Iatgagcacac tcgctaacag tctgcccgga gcgacaccgt atgtacattg ggtacggagg60 cggcagagaactcactgaat cggagataga ag atg gcgaa aaggactcag cggtgtgaga120 agacggtagc tgtgaagaagggtccatgga gtcctgagga ggatcacaag ttggtagctt180 acattcaaag atatggaatt tggaattggagtcggatgcc taaaccagct ggtctggcta240 ggtccgggaa gagttgtaga cttcgttggg tgaattacttaaggccggat attaagcgtg300 ggaacttcgg caaagacgaa gaggaaacca tacttgagtt gcatcaagcaataggaaacc360 gatggtctgc tattgcagca aggcttcccg gaagaacgga caatgagatt aagaattact420ggcacaccca catgaaaaaa c gcttcaagg cggggattga atcagtacac gaagaagcaa480 aagggtccggtgacaaggaa gccagcaaga acaagttatc tgaagctgga caactctttc540 ttgttgatga agetacgaaggtagcateat taaagtcgga ggcaacttgt tcagcttcat600 cgagcgtata ctttcccgtt tgggaattcgacgatcaaaa aggccagatt gcagagcaaa660 gtgtttgtgc atctgatgtc acatttggtg agcttcaaagtttggattct caagtgtggc720 agcaagagcc tatatttcca tgtgattcct acattaatca tgtcaccagtgattactggg
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說明:透明方框中的ra表示起始密碼子，而灰色方框內的M表示終止密碼子。(2 ) SEQ. ID. NO. 2 的信息(a)序列特徵長度237個胺基酸類型胺基酸拓撲結構線性(b)分析類型蛋白質(c)序列描述SEQ. ID.NO. 2MET Ala Lys Arg ThrGln Arg Cys Glu Lys Thr Val AlaVal Lys151015Lys Gly Pro Trp SerPro Glu Glu Asp His Lys Leu ValAla Tyr202530He Gln Arg Tyr GlyHe Trp Asn Trp Ser Arg MET ProLys Pro354045Ala Gly Leu Ala ArgSer Gly Lys Ser Cys Arg Leu ArgTrp Val505560Asn Tyr Leu Arg ProAsp He Lys Arg Gly Asn Phe GlyLys Asp657075Glu Glu Glu Thr HeLeu Glu Leu His Gln Ala He GlyAsn Arg808590Trp Ser Ala He AlaAla Arg Leu Pro Gly Arg Thr AspAsn Glu95100105He Lys Asn Tyr TrpHis Thr His MET Lys Lys Arg PheLys Ala110115120Gly He Glu Ser ValHis Glu Glu Ala Lys Gly Ser GlyAsp Lys
125130135Glu Ala Ser Lys AsnLys Leu Ser Glu Ala Gly Gln LeuPhe Leu140145150Val Asp Glu Ala ThrLys Val Ala Ser Leu Lys Ser GluAla Thr155160165Cys Ser Ala Ser SerSer Val Tyr Phe Pro Val Trp GluPhe Asp170175180Asp Gln Lys Gly GlnHe Ala Glu Gln Ser Val Cys AlaSer Asp185190195Val Thr Phe Gly GluLeu Gln Ser Leu Asp Ser Gln ValTrp Gln200205210Gln Glu Pro He PhePro Cys Asp Ser Tyr He Asn HisVal Thr215220225Ser Asp Tyr Trp ValSer Leu He Asp Lys Thr Gly
230235本發明提供了蘋果逆境抗性相關基因MdSIMYBl在菸草、蘋果和其它植物中應用的方法，可提高轉基因植物抵抗乾旱、低溫和鹽鹼等逆境的能力。步驟為(a)利用如上所述的MdSMYBl基因，將cDNA序列置於CaMV 35S啟動子之下，構建植物表達載體。
(b)採用本領域熟知的方法，如農桿菌介導的方法將構建的表達載體導入植物細胞，得到轉基因植株。本發明涉及一種植物表達載體，包含核苷酸序列SEQ. ID. NO. 1，用於提高植物抗逆境能力，尤其是抗乾旱、低溫和鹽鹼的能力。本發明涉及將上述植物表達載體導入植物細胞中，導入方法是本領域人員熟知的農桿菌介導轉化法，得到抗乾旱、低溫和鹽鹼的轉基因植物。基於草本植物菸草Nc89生長速度快、生活周期短、離體培養再生能力強、遺傳轉化效率高，而木本植物蘋果生活周期長，遺傳轉化效率低等特點，在下述實例中以菸草Nc89和蘋果兩種植物為例對本發明進行了詳細的說明，但本發明中MdSIMYBl基因及含有該基因的植物表達載體也可以用於生產其它提高抗逆境能力的轉基因植物。蘋果為多年生木本植物，通過常規育種選育抗性品種周期長。本發明從蘋果中分離到了一個R2R3類型的MYB家族基因MdSMYBl，通過在菸草和蘋果中轉基因功能驗證表明它在抵抗外界乾旱、低溫和高鹽中有明顯作用。而轉基因菸草、蘋果抗逆性的提高，提供了一種新的、快速的育種途徑，尤其是在轉基因蘋果砧木中，MdSIMYBl基因的發掘不僅能為蘋果抗逆基因工程提供新的基因源，豐富植物抗逆基因工程理論體系，而且對於培育其它植物的抗逆種質材料(包括一年生植物和多年生木本植物)也具有重要的現實意義。本發明採用離體葉片接種法對獲得的T3代轉基因菸草和蘋果進行抗逆能力分析發現，轉基因菸草和蘋果中MdSIMYBl的過量表達能顯著提高其抗乾旱、低溫和鹽鹼的能力。植物一生都生活在各種各樣的逆境條件中，可將該基因轉化蘋果、梨、楊樹等木本植物，或小麥、玉米等農作物(草本植物)，提聞轉基因植株的抗逆境能力，提聞其廣量和品質，具有重大的經濟效益和社會價值。
四
圖I :蘋果中MdSIMYBl蛋白結構保守域示意圖及不同R2R3類型的MYB家族植物的胺基酸序列的同源性比較。A.蘋果的MdSIMYBl蛋白結構保守域示意圖；B.不同R2R3類型的MYB家族植物的胺基酸序列的同源性比較。其中，atMYBlO (擬南芥NM_112118. 2)、atMYB63 (擬南芥AK175344. I)、atMYB72 (擬南芥 ΝΜ_104495· I)、VvMYB4 (葡萄 ΧΜ_002281466· 2)，R2、R3 分別表示MYB家族基因的特徵結構域。圖2 :蘋果中MdSMYBl蛋白的進化樹分析。其中，atMYBlO(擬南芥 ΝΜ_112118· 2)、atMYB72 (擬南芥 ΝΜ_104495· I)、atMYB63(擬南芥 AK175344. I)、atMYB6 (擬南芥 ΝΜ_117014· 2)、atMYB94(擬南芥 ΝΜ_114628· 3)、atMYB112(擬南芥 ΝΜ_103696· 2)、atMYB13(擬南芥 ΝΜ_100499· I)、VvMYB4 (葡萄XM_002281466. 2)、GmMYB88 (大豆 DQ822902. I)、GmMYB4(大豆 ΝΜ_001254089· I)、0sMYB4(水稻 D88620. I), MdMYB23(蘋果 DQ074471. I)、NtLBM4 (菸草 AB028652. I)、NtMYBl (菸草U72762. I), Rr-MYB17 (玫瑰 FR828550. I)。圖3 =MdSIMYBl基因在蘋果不同組織中的相對表達量，及在不同逆境處理條件下該基因的相對表達量。A. MdSMYBl基因在嘎啦蘋果不同組織(根、葉、莖、花、幼果)中的相對表達量；BI B3.分別經 200mM NaCl、4°C低溫(chilling)、乾旱(dehydration)處理 0h、6h、12h、24h、48h、72h嘎啦蘋果組培苗，MdSMYBl基因的相對表達量。其中，根(root)、葉(leave)、莖(stem)、花(flower)、幼果(fruit) ；h 表示小時。圖4 :野生型和過量表達MdSMYBl的轉基因菸草5周苗經不同逆境處理後的生長情況。A、野生型菸草和轉基因菸草株系的半定量RT-PCR檢測；B1、正常管理條件下培養5周菸草生長情況；B2.生長量一致的5周菸草苗，經200mM NaCl處理12天，正常澆水管理 8天後的生長情況；B3.生長量一致的5周菸草苗，連續15天不澆水做乾旱處理，澆水3天後的生長恢復情況；B4.生長量一致的5周菸草苗，4°C低溫處理6天，25°C正常溫度培養3天後的生長情況。其中，WT :對照；M1 M8 :過量表達的轉基因株系。圖5 :培養2周的生長量一致的嘎啦蘋果組培苗和轉基因組培苗(MdSIMYBl基因過量表達或抑制表達)，經不同逆境處理後的生長情況。
A、野生型蘋果和轉基因蘋果株系(抑制表達或過量表達)的半定量RT-PCR檢測；BI.在添加200mM NaCl的MS培養基上生長2周的情況；B2.在添加6%PEG MS培養基上生長2周的情況；B3.在4°C低溫條件培養7天，22°C正常溫度恢復4天的生長情況。其中，WT :對照；RT1-RT2:抑制表達的轉基因株系；T1 T12 :過量表達的轉基因株系。圖6 :生長2個月且長勢一致的嘎啦蘋果生根苗和轉基因生根苗(MdSMYBl基因過量表達或抑制表達)，經不同逆境處理後的生長情況。A、經200mM NaCl處理3次(3天處理I次)，正常管理至20天的生長恢復情況；B.連續15天不澆水做乾旱處理，正常澆水管理6天後生長恢復情況；C. 4°C低溫條件培養7天後，22°C正常溫度培養10天的生長恢復情況。其中，WT :對照；RT2:抑制表達的轉基因株系；T1、T2、T12 :過量表達的轉基因株系。五、具體實例方式以下結合具體實例，對本發明進行詳細說明。實例I :蘋果MdSMYBl基因的克隆。一)利用CTAB法提取總RNA，具體方法如下I)取I. 5g經200mM NaCl鹽處理24小時的嘎啦蘋果組培苗，放入預冷的研缽，加液氮磨碎，轉入預冷的50ml離心管中；2)迅速加入IOml預熱到65°C的提取緩衝液(其中PVP和巰基乙醇現用現加)，輕輕混勻，65°C水浴中O. 5小時；提取緩衝液
權利要求
1.一種蘋果MdSMYBl基因，其特徵在於其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。
2.根據權利要求I所述的一種蘋果MdSIMYBl基因，其特徵在於該核苷酸序列編碼的胺基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
3.如權利要求I所述的一種蘋果MdSIMYBl基因在菸草中的應用，能提高轉基因菸草抗乾旱、抗鹽和抗低溫能力。
4.如權利要求I所述的蘋果MdSIMYBl基因在轉基因蘋果中的應用，能提高轉基因蘋果抗乾旱、抗鹽和抗低溫的能力。
全文摘要
本發明涉及一種蘋果抗逆相關基因MdSIMYB1的克隆及其應用，具體公開了一種如SEQ.ID.NO:1所示的蘋果MdSIMYB1基因的克隆方法及其應用；本發明從蘋果中分離到了MdSIMYB1基因，該基因在菸草中過量表達能提高轉基因菸草的抗旱、抗鹽和抗冷等逆境能力；MdSIMYB1基因在蘋果中過量表達能提高轉基因蘋果株系的抗旱、抗鹽和抗冷等逆境能力；而抑制該基因的表達，可導致轉基因蘋果植株的抗旱、抗鹽和抗冷等逆境能力的下降；將MdSIMYB1基因轉入蘋果提高其表達水平，能提高蘋果的抗逆能力。
文檔編號C12N15/82GK102719449SQ201210197919
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月15日 優先權日2012年6月15日
發明者曹忠慧, 王榮凱, 由春香, 郝玉金 申請人:山東農業大學