一種抗血管內皮生長因子的單克隆抗體及應用的製作方法

2023-09-18 17:53:35 2

專利名稱：一種抗血管內皮生長因子的單克隆抗體及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗體工程和醫學領域。更具體地，本發明涉及獲得識別人血管內皮生長因子(hVEGF)表位的鼠單克隆抗體。
背景技術：
癌症是影響人類健康的重大疾病，死亡率高。1971年Folkman首先觀察到當腫瘤體積超過1 2mm3，需要形成新血管才能繼續生長，從而提出通過調控血管生成控制腫瘤生長的假說。目前研究表明通過阻斷腫瘤血管生成生長因子信號傳導通路能夠抑制實體腫瘤發展過程的新血管生成，可以特異地幹預腫瘤發展進程。新血管生成的過程需要多種刺激因子參與，其中包括血管內皮生長因子VEGF(vascular endothelia growth factor)。 Genentech公司生產針對VEGF的人源化單抗阿瓦斯汀(Bevacizumab，Avastin)是重組的人源化單克隆抗體，於2004年2月26日獲得FDA的批准，是第一個獲得批准上市的抑制腫瘤血管生成的藥物。Bevacizumab已被批准用於一線治療轉移性結直腸癌，與某些化療方案聯合治療晚期非小細胞肺癌以及乳腺癌。血管內皮生長因子(VEGF)是血管生成重要調節因子，在胚胎發育及出生後的血管發程中均起著極為重要的調節作用，主要參與新生血管的形成VEGF有至少五種不同大小的剪切形式，包括121、145、165、189和206個胺基酸等，其中VEGF121、VEGF145和VEGF165是分泌蛋白。VEGF受體包括VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3。VEGF與內皮細胞膜上內皮生長因子受體(VGFR)結合後，使VEGFR二聚體化，受體酪氨酸激酶活性被激活，由受體自身磷酸化後啟動下遊信號通路如PKC信號通路。VEGF在腫瘤細胞中表達水平顯著升高。高表達的VEGF 除了能夠使血管內皮細胞分化增殖和遷移，促進血管的構建及生長，還能夠提高血管的通透性、增加血漿蛋白溶酶激活物(PA)及血漿纖溶酶原激活物抑制劑-I(PAI-I)的表達，促進腫瘤的侵襲、轉移。由於VEGF和其受體的多樣性，不同抗原表位或者親和力不同的VEGF抗體對腫瘤生長抑制的效果可能是不同的。VEGF抗體藥物的升級需要獲得和研究針對VEGF不同表位的CDR。不同的CDR序列免疫原性是不同的，通過CDR移植製備的人源化抗體被機體的耐受速度及產生的毒性是有差異的，直接影響藥物的療效。抗體的療效還受抗體血漿半衰期和血管穿透能力等因素的影響。因此研究不同VEGF抗體將有助於獲得療效更好的治療性人源化抗體。

發明內容
本發明的目的提供一種特異性抗人血管內皮生長因子(hVEGF)的單克隆抗體，能夠特異識別人VEGF。本發明提供了一種針對hVEGF的免疫球蛋白，其特徵在於，它特異性地結合於人血管內皮生長因子(hVEGF)。所述的免疫球蛋白，其特徵在於，所述的免疫球蛋白是鼠單克隆抗體IgG。
所述的鼠單克隆抗體，其特徵在於，所述的鼠單克隆抗體產生的雜交瘤細胞株，它是小鼠雜交瘤細胞系18-5。本發明提供了一種抗人VEGF單克隆抗體，其重鏈可變區具有SEQ ID N0:1所示的胺基酸序列，輕鏈可變區具有SEQ ID NO :2所示的胺基酸序列。本發明還提供了一種分離的核苷酸，編碼抗人VEGF單克隆抗體重鏈可變區(SEQ ID NO 1)核苷酸序列具有表1所示的鹼基序列，編碼抗人VEGF單克隆抗體輕鏈可變區(SEQ ID NO 2)核苷酸序列具有表2所示的鹼基序列。本發明還提供了抗人VEGF單克隆抗體在免疫學檢測中的用途。


圖1 鼠單克隆抗體18-5的重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO 1)。圖2 鼠單克隆抗體18-5的輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO 2)。圖3 鼠單克隆抗體18-5用於Western-blot檢測VEGF。Ll 陰性對照，L2 pLenti7. 3/V5_VEGF165轉染細胞裂解物，L3 :pLenti7. 3/V5_VEGF165轉染細胞培養上清圖4 鼠單克隆抗體18-5用於VEGF的免疫螢光檢測。A 轉染pLenti7. 3/V5-T0P0 空載體EGFP螢光，B 轉染pLenti7. 3/V5-T0P0空載體對照，C 轉染pLenti7. 3/V5_VEGF165EGFP 螢光，D 轉染 pLenti7. 3/V5-VEGF165 (CY3 標記二抗)實施方式具體實施例1小鼠單克隆抗體的製備和篩選(1)抗原的製備將人血管內皮生長因子 VEGF165(Human Vascular endothelial growth factor, hVEGF165)基因通過PCR從人基因轉錄組中擴增獲得，上遊引物為5』 -CGCGGATCCGCACCCAT GGCAGAAGGAGG-3，；下遊引物為5，-CTCCTCGAGTCACCGCCTCGGCTTGTCACATC-3，。利用 BamH I和Xho I雙酶切，將基因片段連入原核表達載體pET32a(+)，PCR和雙酶切鑑定陽性克隆後測序，序列測定正確後，提取質粒。原核表達載體pET32a_VEGF165轉化Rosetta菌株，在 IOOmlLB培養基中，OD6tltl達到約0.5時，ImM IPTG誘導表達4h，VEGF165蛋白形成包涵體。超聲破菌後，用IXSDS上樣緩衝液溶解包涵體，測定靶蛋白的表達量。將製備好的VEGF165蛋白進行SDS-PAGE電泳，割膠純化蛋白。(2)小鼠的免疫將純化後的VEGF165蛋白溶解在1 XPBS，取適量的蛋白溶液與弗氏完全佐劑 (Sigma)混勻乳化，取8周齡的BALB/c雌鼠，皮下多點注射抗原。2周後，取適量的蛋白溶液與弗氏不完全佐劑(Sigma)混勻乳化，在小鼠的皮下，進行第二次免疫。以後每隔3周， 進行第三、四次免疫。第四次免疫後3天，取脾臟進行細胞融合。(3)細胞融合和陽性克隆的篩選引頸處死小鼠，用70%酒精消毒其體表。無菌條件下取出脾臟，在滅菌不鏽鋼網中，用注射器向脾臟內注入3ml無血清培養液，反覆抽吸數次獲得細胞懸液，將細胞懸液注入50ml離心管中，加入20ml無血清培養液，輕輕吹打數次，1000rpm/min離心。用無血清培養液將細胞重懸，與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0以適當比例輕輕混勻，在37°C水浴鍋中加入 PEG1400，水浴1. 5min。加入無血清培養液35ml，離心。沉澱用含有20% FCS的RPM1-1640重懸，每孔200 μ 1均分到96孔細胞培養板，放入37°C 5% CO2培養箱中培養。24h後，加入選擇培養液HAT，每3天換一次新鮮培養液。14天後，取細胞培養上清，ELISA鑑定出陽性克隆。多次進行亞克隆鑑定陽性克隆細胞成系，繼續體外培養6個月。選出5株高效表達細胞株，分別命名為18-1，18-2，18-3， 18-4，18-5。(4)單克隆抗體的鑑定血清1 1000-1 50000 稀釋，IOOngVEGF165 蛋白上樣，進行 Western Blot 分析抗體的特異性。將VEGF165基因通過TOPO克隆方法連入表達載體pLenti7. 3/V5-T0P0,真核表達載體 pLenti7. 3/V5_VEGF165 利用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)介導瞬時轉染 293T細胞，血清1 100稀釋，進行免疫螢光鑑定抗體。測定可知，18-5細胞株的抗體特異性最好，且能識別細胞內源表達的抗原。(4)單克隆抗體可變區序列的獲得利用Trizol (Invitrogen)法提取雜交瘤細胞株18-5的總RNA，然後用oligo-dT 弓I物禾口 superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen)反轉錄成 cDNA。根據小鼠抗體重鏈和輕鏈的FRl區胺基酸序列，合成兼併的寡核苷酸引物，用作正向引物。反向引物根據小鼠抗體的恆定區設計，可將全部的可變區擴增得到。PCR反應完成後，分別將抗體重鏈和輕鏈的DNA片段連於TA克隆載體，挑取克隆進行測序。具體實施例2小鼠單克隆抗體的Western-blot和免疫螢光檢測 將VEGF165基因通過TOPO克隆方法連入表達載體pLenti7. 3/V5-T0P0,真核表達載體pLenti7. 3/V5_VEGF165 利用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)介導瞬時轉染 293T 細胞， 血清1 100稀釋，進行免疫螢光鑑定抗體。測定可知，18-5細胞株的抗體特異性最好，且能識別細胞內源表達的抗原。取培養細胞或細胞上清，加入3XLoading buffer煮沸5分鐘上樣，westem-blot檢測。結果顯示陽性蛋白條帶的分子量與VEGF165 —致。
權利要求
1.一種免疫球蛋白IgG，其特徵在於，它能夠特異性地結合人VEGF。
2.如權利要求1所述的免疫球蛋白，其特徵在於，它是單克隆抗體。
3.如權利要求1所述的免疫球蛋白，其特徵在於，它具有的重鏈可變區具有SEQID NO :1所示的胺基酸序列，輕鏈可變區具有SEQ ID NO :2所示的胺基酸序列。
4.一種分離的核酸分子，其特徵在於，該分子含有SEQ ID NO :1所示的編碼所述單克隆抗體重鏈的核苷酸序列，以及SEQ ID NO :2所示的編碼所述單克隆抗體輕鏈的核苷酸序列。
5.根據權利要求4所述的核酸分子，其特徵在於，它編碼權利要求1所述的免疫球蛋白。
6.一種檢測VEGF免疫學檢測試劑，它含有權利要求1所述的免疫球蛋白。
全文摘要
本發明提供了一種能夠結合人血管內皮生長因子(VEGF)的特異單克隆抗體。該單克隆抗體具有與人VEGF特異結合的特性。本發明還提供了所述單克隆抗體在科學研究及免疫學檢測方面的應用。
文檔編號C07K16/22GK102212135SQ20111000735
公開日2011年10月12日 申請日期2011年1月14日 優先權日2011年1月14日
發明者馮傑, 邵長君, 高靜 申請人:中國科學院北京基因組研究所