新的修飾的核酸序列以及增加細胞系統中mRNA水平和蛋白質表達的方法
2023-09-18 17:34:50 6
專利名稱：新的修飾的核酸序列以及增加細胞系統中mRNA水平和蛋白質表達的方法
技術領域：
本發明的背景發明領域本發明涉及異源基因表達。更具體地，本發明涉及在較高等的真核細胞系統中表達微生物或寄生生物的基因。相關的現有技術綜述在體外細胞培養系統或體內重組生產系統中進行某種異源基因產物的重組生產通常是困難的。例如，許多研究人員發現，在與蛋白質原始來源的細胞不同的細胞培養系統，特別是哺乳動物細胞培養系統中難以表達來自細菌、寄生生物和病毒的蛋白質。難以由哺乳動物細胞產生的醫療上重要蛋白質的一個例子是瘧原蟲裂殖子表面蛋白(malaria merozoite surface protein)(MSP-1)。
瘧疾在熱帶國家是嚴重的健康問題。對現存藥物的抗性迅速發展，因而急需疫苗。在惡性瘧原蟲(P.falciparum)生長周期中表達的多種抗原中，MSP-1是研究最深入的並且看來是最成功的接種候選物。暴露於惡性瘧原蟲的個體產生抗MSP-1抗體，研究表明在對MSP-1的天然獲得性免疫反應和減低的瘧疾發病率之間有相關性。在一系列研究中，用純化的天然MSP-1或該蛋白的重組片段免疫可以誘導至少部分對該寄生生物的防護(Diggs等，(1993)Parasitol Today 9300-302)。因此MSP-1是開發抗惡性瘧原蟲疫苗的重要靶。
MSP-1是一種190-220kDA的糖蛋白。C-末端區域已經是可用作疫苗的重組產物的焦點。然而，開發MSP-1用作疫苗的一個主要問題是在細菌或酵母表達系統難以獲得與親和純化的天然蛋白質具有同等免疫學能力的重組蛋白(Chang等，(1992)免疫學雜誌(J.Immunol.)148548-555)以及使疫苗生產可行的足夠量的重組蛋白。
改進的方法是有利的，它能夠增強以前難以重組表達的來自寄生生物、細菌和病毒的蛋白質的足夠量的表達。特別是，一種能夠表達足夠量MSP-1的重組系統是特別有利的。
本發明的概述本發明提供了改進的重組DNA成分和增加蛋白質的mRNA水平和蛋白質表達的方法，這裡的蛋白質是來自異源細胞的，優選是諸如細菌、病毒和寄生生物等低等生物的，且以前在細胞培養系統、哺乳動物細胞培養系統或轉基因動物中難以表達的蛋白質。適於依據本發明的表達系統表達的優選蛋白候選物是那些具有相對重組表達系統而言含高總AT量或富AT區域和/或mRNA不穩定基序和/或稀有密碼子的DNA編碼序列的蛋白質。
第一個方面，本發明特徵是一種修飾的已知核酸，優選的是能在一種系統中表達的來自細菌、病毒或寄生生物的一個基因，其中的修飾包括相對未修飾序列有降低的AT含量，並且可任選的進一步包括消除至少一種或全部在天然基因中存在的mRNA不穩定基序。在特定優選實施方案中，修飾進一步包括用細胞系統的優選密碼子置換天然基因的一個或多個密碼子。
第二個方面，本發明提供了製備本發明的修飾的核酸的方法，包括降低編碼蛋白質的天然基因的總AT含量和/或消除mRNA不穩定基序中的至少一個或全部和/或使用選擇的細胞系統的優選密碼子置換一個或多個密碼子(均採用選擇的細胞系統識別的、優選地為選擇的細胞系優選的並且編碼與所置換的密碼子相同的胺基酸的密碼子來置換天然基因中的一個或多個密碼子)。本發明的這一方面進一步包括依據本發明方法製備的修飾的核酸。
第三個方面，本發明亦提供了含有本發明核酸和在選擇的細胞系或生物體中有活性的啟動子的載體，以及用本發明核酸轉化的宿主細胞。
第四個方面，本發明提供了，用於生產轉基因泌乳動物(lactatinganimal)的含有本發明核酸的轉基因表達載體以及其種系含有本發明核酸的轉基因非人泌乳動物。
第五個方面，本發明提供了用於生產轉基因的泌乳動物物種的轉基因表達載體，包括本發明核酸和操作地偶聯到該核酸上的指導乳腺將該核酸編碼的蛋白質表達到轉基因動物乳汁中的啟動子。
第六個方面，本發明提供了含有依據本發明的修飾的核酸的DNA疫苗。本發明這一方面的一個優選實施方案包括依據本發明的修飾的MSP-1基因的片段。
附圖的說明
圖1描繪了依據本發明修飾的MSP-142的cDNA序列[序列1]，其中置換了306個核苷酸以降低AT含量並消除了mRNA不穩定基序同時保持MSP-142的相同蛋白質胺基酸序列。大寫字母表示核苷酸置換。
圖2描繪了編碼「野生型」或天然MSP-142序列的核苷酸序列[序列2]。
圖3a是野生型MSP-142(在表中命名為「MSP-1 wt」)和新修飾的MSP-142基因(在表中命名為「編輯的MSP」)以及幾種乳蛋白質基因(來自山羊和小鼠的酪蛋白基因)的密碼子使用表。每一欄中的數目表示在列出的各基因中特定密碼子出現的實際次數。新的MSP-142合成基因是通過首先選擇給定胺基酸的富GC密碼子結合選擇在乳蛋白中最常使用的胺基酸從乳房特異密碼子用法中產生的。
圖3b是比較亦如圖3a所示的每一密碼子在野生型MSP-142(在表中命名為「MSP-1 wt」)和新修飾的MSP-142基因(在表中命名為「編輯的MSP」)中的出現次數的密碼子用法表。圖3b中的表亦將每一密碼子在野生型MSP-142和新修飾的MSP-142基因中的出現頻率與每一密碼子在大腸桿菌基因和人基因中的出現頻率進行了比較。從而，如果表達系統是大腸桿菌細胞，此表可用於確定大腸桿菌識別或優選的密碼子。
圖4a-c分別描繪了如實施例中所述的MSP-142構建體GTC479，GTC564和GTC627。
圖5A欄是Northern檢測，其中構建體GTC627含有依據本發明修飾的新MSP-142基因，GTC479是含有天然MSP-142基因的構建體，而構建體GTC469是陰性對照DNA。
圖5B欄是親和純化後洗脫組分的Western檢測。數字是收穫的級分。結果表明來自修飾的MSP-142合成基因構建體GTC679的級分與MSP-1多克隆抗體反應而陰性對照GTC479則不反應。
圖6描繪了實施例中所述的OT1[序列3]、OT2[序列4]、MSP-8[序列5]、MSP2[序列6]、MSP-1[序列7]的核酸序列。
圖7圖示質粒BC574。
圖8圖示BC620。
圖9圖示BC670。
圖10圖示轉基因乳汁中的MSP的Westen印跡。
圖11圖示MSP42-2的核苷酸序列[序列8]。
圖12圖示BC-718。
圖13圖示在轉基因乳汁中BC718表達的Westen印跡。
優選實施方案的詳細描述本專利和此處引用的科學文獻建立了本技術領域熟練技術人員可利用的知識。頒布的美國專利、允許的申請、公開的國外申請以及此處引用的文獻，通過參考文獻形式並於本發明。解決這些文獻和本公開之間的任何衝突均以本發明為準。
本發明提供了修飾的重組核酸序列(優選的是DNA)以及增加蛋白質的mRNA水平和蛋白質表達的方法，這裡的蛋白質是已知或很可能在細胞培養系統、哺乳動物細胞培養系統或轉基因動物中難以表達的蛋白質。使用本發明重組技術表達的優選的「困難」蛋白質候選物是從優選地諸如寄生生物、細菌和病毒等低等生物的異源細胞衍生的蛋白質。它們的DNA編碼序列相對使用的重組表達系統而言含有高的總AT含量或富AT區和/或mRNA不穩定基序和/或稀有密碼子。
第一個方面，本發明的特徵是一種修飾的已知核酸，優選的是能在一種細胞系統中表達的來自細菌、病毒或寄生生物的一個基因，其中的修飾包括相對未修飾序列有降低的AT含量，並且可任選的進一步包括消除至少一種或全部在天然基因中存在的mRNA不穩定基序。「細胞系統」包括細胞培養系統、組織培養系統、器官培養系統和活體動物的組織。在特定的優選實施方案中，修飾進一步包括用細胞系統的優選密碼子置換天然基因的一個或多個密碼子。這些特徵中的每一個均是通過用細胞系統可識別的並優選地是其偏愛的且與被置換的天然基因中密碼子編碼相同胺基酸的密碼子來替代天然基因中的一個或多個密碼子實現的。依據本發明，這種「沉默」核苷酸和密碼子置換將足以達到降低AT含量和/或消除mRNA不穩定基序和/或減少稀有密碼子數目同時保持並優選的改善細胞系統產生mRNA和表達所需蛋白能力的目的。
本發明亦包括那些在適當的嚴緊條件下與本發明修飾核酸序列特異性同源的序列，特別排除改進的核酸從其衍生的已知核酸。如果同源性足以使一個序列與另一個序列的準確互補序列雜交，則這個序列與另一個序列「特異性」同源。如果在體內或離子強度接近生理條件的條件下，例如140mM NaCl、5mM MgCl2的條件下能夠雜交形成Waston-Crick或Hoogsteen鹼基對，則一個序列與另一個序列「特異性雜交」。優選的，在嚴緊條件下，例如在68℃ 0.2X SSC條件下保持這種特異性雜交。
在優選實施方案中，本發明核酸在哺乳動物細胞培養或轉基因動物中能夠以天然基因在相同條件下(即相同的細胞類型，相同的培養條件，相同的表達載體)於體外細胞培養系統或轉基因動物中表達量的至少25％，優選的是50％，更優選的至少為100％或更高的水平表達蛋白質。
此處使用的術語「表達」是指導致蛋白質表達的mRNA轉錄。可通過本技術領域已知的一系列技術測定表達，包括使用對目的蛋白特異的抗體。「天然基因」或「自然基因」是指編碼野生型蛋白質的和作為修飾的核酸來源的基因序列或其片段(包括天然出現的等位基因變異)。「偏愛(優選)密碼子」是指選擇的細胞系統更普遍使用的密碼子。並非所有在此描述的密碼子改變都是變成偏愛密碼子，只需置換的密碼子至少能被細胞系統識別。此處使用的術語「減少的AT含量」是指由於在不改變靶蛋白的胺基酸序列的前提下使用選擇的細胞系統識別的核苷酸或密碼子置換含A或T的核苷酸位點或含A和/或T的密碼子而比天然基因具有較低的含A(腺嘌呤)或T(胸腺嘧啶)鹼基的核苷酸的總百分數。此處使用的「異源的」是指來自與其導入的種不同種的遺傳物質，或者從這種遺傳物質產生的蛋白質。
本發明的特別優選的細胞系統包括諸如COS細胞和CHO細胞的哺乳動物細胞系統，以及轉基因動物，特別是轉基因動物的乳房組織。然而，本發明亦考慮了細菌、酵母、大腸桿菌和諸如杆狀病毒的病毒表達系統甚至植物系統。
第二個方面，本發明提供了製備修飾的核酸的方法，包括降低編碼蛋白質的天然基因的總AT含量和/或消除至少一個或所有mRNA不穩定基序和/或使用選擇的細胞系統的偏愛密碼子置換一個或多個密碼子(均採用選擇的細胞系統識別的、優選地為偏愛的並且編碼與所置換的密碼子同樣的胺基酸的密碼子來置換天然基因中的一個或多個密碼子)。描述重組DNA技術的一般原理的標準參考書包括Watson，J.D.等，基因的分子生物學(Molecular Biology of the Gene)卷I和卷II，the Benjamin/Cummings Publishing Company，Inc.publisher，Menlo Park，CA(1987)Darnell，J.E.等，分子細胞生物學(MolecularCell Biology)，Scientific American Books，Inc.，Publisher，NewYork，NY(1986)；Old，R.V.等，基因操作原理基因工程入門(Principle of Gene ManipulationAn Introduction to GeneticEngineering)，第二版，University of California Press，publisher，Berkeley CA(1981)；Maniatis，T.等，分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版，冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory)，publisher，冷泉港(Cold SpringHarbor)，NY(1989)和分子生物學通用流程(Current Protocols inMolecular Biology)，Ausubel等，Viley Press，New York，NY(1992)。本發明的這一方面進一步包括依據本發明方法製備的修飾的核酸。
不局限於任何原理，以前的研究表明GM-CSF mRNA的3』非翻譯區的一段保守AU序列(AUUUA)介導選擇性mRNA降解(Shaw，G.和Kamen，R.細胞(Cell)46659-667)。過去的焦點在於基因非翻譯區的這些不穩定基序的存在。本發明是第一個意識到消除基因編碼區的不穩定序列的益處。
第三個方面，本發明亦提供了含有本發明核酸和在選擇的細胞系或生物體中有活性的啟動子的載體，以及用本發明核酸轉化的宿主細胞。優選的載體含有一個複製起點，因而在一個或多個細胞類型中可複製。某些優選的載體是表達載體，進一步具有至少一個啟動子和被動終止子，從而使重組表達元件可以在細菌、真菌、植物、昆蟲或哺乳動物細胞中轉錄。
第四個方面，本發明提供了用於產生轉基因泌乳動物的含有本發明核酸的轉基因表達載體以及其種系含有本發明核酸的轉基因非人泌乳動物。這種轉基因表達載體含有能夠使其作為宿主轉基因動物基因組一部分來表達的啟動子。本技術領域已知產生轉基因動物的一般原理。參看例如Hogan et al.，小鼠胚胎操作實驗室手冊(Manipulatingthe Mouse EmbryoA Laboratory Manual)，冷泉港實驗室(Cold SpringHarbor Laboratory)，(1986)；Simons et al，Bio/Technology 6179-183，(1988)；Wall et al.，Biol.Reprod.32645-651，(1985)；Buhler et al.，Bio/Technology 8140-143(1990)；Ebert et al.，Bio/Technology 9835-838(1991)；Krimenfort et al.，Bio/Technology 9844-847(1991)；Wall et al.，細胞生物化學雜誌(J.Cell.Biochem.)49113-120(1992)。將外源DNA序列導入哺乳動物及其生殖細胞的技術最初是在小鼠中開發的。參看例如，Gordon et al.，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)777380-7384，(1980)；Gordon and Ruddle科學(Science)2141244-1246(1981)；Palmiter and Brinster，細胞(Cell)41343-345，1985；Brinster et al.，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)824438-4442(1985)and Hogan et al.(出處如上)。隨後將這些技術改進為用於大型動物包括牛和羊。直至最近，產生轉基因小鼠或家畜的最廣泛應用的方法是將感興趣的上百個線性DNA分子以轉基因表達構建體的形式注射到受精卵的一個前核。將DNA注射到受精卵的細胞質亦有廣泛應用。最近，能夠注射到未受精卵的完整轉基因細胞系的克隆已獲得成功(KHS Campbell et al.，自然(Nature)380 64-66，(1996))。
第五個方面，本發明提供了含有本發明核酸和可操作偶聯到核酸上的指導乳腺將核酸編碼的蛋白質表達到轉基因動物乳汁中的啟動子的轉基因表達載體，用於產生轉基因泌乳期動物物種。乳腺表達系統具有高表達水平、低成本、正確加工和可及性的優點。多名研究人員已經在泌乳轉基因動物中產生了已知蛋白質，諸如牛和人α-乳清蛋白。(Wright et al.，Bio/technology 9830；834(1991)；Vilotte et al，歐洲生物化學雜誌(Eur.J.Biochem.)，18643-48(1989)；Kochiet al.，Mol Reprod. And Devel.33160-164(1992)；Soulier et al.，FEBS Letters 297(1，2)13-18(1992))，並且該系統顯示可以產生高水平的蛋白質。
優選的啟動子在乳房組織中是有活性的。特別有用的是在編碼乳汁特異性蛋白質的基因諸如乳房組織中發現的基因中有特異活性的，即在合成乳汁的生理條件下在乳腺組織中的活性強於其它組織中的啟動子。最優選的是既對乳房組織特異又高效的啟動子。這類啟動子中優選的是酪蛋白、乳清蛋白、乳球蛋白(lactalglobulin)啟動子，包括但不限於α-、β-和γ-酪蛋白啟動子和α-乳清蛋白以及β-乳球蛋白啟動子。優選的啟動子來自齧齒動物，山羊和牛。其它的啟動子包括調節乳清酸性蛋白質(WAP)基因的啟動子等。
本發明的一個優選實施方案提供了能夠在細胞培養系統、哺乳動物細胞培養系統或在轉基因動物乳汁中表達的編碼MSP-1或其片段的修飾核酸。依據本發明修飾了編碼天然MSP-1基因的核酸序列。首先通過使用編碼相同胺基酸的但與天然MSP-1基因或基因片段相比足以降低修飾的核酸中AT含量的選擇的細胞系統識別的並優選是其偏愛的密碼子置換天然基因中的密碼子來降低總AT含量。其次通過使用編碼相同胺基酸的但足以消除mRNA不穩定基序的選擇的細胞系統識別的並優選是其偏愛的密碼子置換天然基因中的密碼子消除了天然基因或基因片段中的mRNA不穩定基序(AUUUA，Shaw and Kamen，在前面)。任選地，天然基因中的任何其它密碼子均可用所說的選擇的表達系統的優選的密碼子置換。
第六個方面，本發明提供了含有依據本發明的修飾核酸的DNA疫苗。在特定優選實施方案中，DNA疫苗含有依據本發明的載體。本發明的DNA疫苗可能是依據本發明的「裸」的或純化的修飾核酸，可能或可能不與啟動子可操作地連接。如果核酸與啟動子連接的方式使核酸序列表達，即為核酸與啟動子可操作連接。這種DNA疫苗可以不進行膠囊化給藥，或可作為脂質體的部分給藥，或作為病毒基因組的部分給藥。通常以足夠使核酸表達並在接受DNA疫苗的動物體包括人體誘發抗體反應的量使用這種疫苗。隨後至少在第一次給藥後一星期之後可再次給藥增強抗體反應。優選的給藥途徑包括經黏膜以及腸胃外給藥。
本發明這一方面的一個優選實施方案包括依據本發明的修飾的MSP-1基因的片段。這種片段優選的包括大約5％至大約100％的全基因序列並含有依據本發明的一個或多個修飾。
圖3b圖示了大腸桿菌和人的密碼子使用的例子。圖3b顯示了MSP-1天然基因和依據本發明的修飾的基因的密碼子使用頻率並將其密碼子使用頻率與大腸桿菌和人基因的進行了比較。本技術領域熟練技術人員很容易得到和知道諸如酵母、杆狀病毒和哺乳動物系統等多種其他表達系統的密碼子使用頻率表。
下面的實施例說明了實施本發明的某些優選方式，但並非為了限制本發明的範圍，因為可以使用替代的方法獲得類似的結果。
實施例製造新的修飾的MSP-142基因在一種實施方案中，提供了編碼MSP-1 C-末端片段的新的修飾的核酸。圖1顯示了能夠在本發明哺乳動物細胞中表達的編碼MSP-142kD C-末端部分(MSP-142)的本發明新的修飾的核酸。天然MSP-142基因(圖2)不能夠在哺乳動物細胞培養或轉基因小鼠中表達。對天然MSP-142基因的分析表明其多種特徵與哺乳動物有區別。首先，它有高達76％的總AT含量。其次，在此1100 bp的DNA片段(圖2)中，mRNA不穩定基序AUUUA出現10次。為了針對這些區別，設計了新的MSP-142基因。向天然MSP-142基因的306個位點引入了沉默核苷酸置換將總AT含量降至49.7％。同樣經過密碼子用法的改變消除了天然基因中的10個AUUUA mRNA不穩定基序。為了改變密碼子用法，使用多種小鼠和山羊乳房特異蛋白質制出了乳房組織特異性密碼子使用表圖3a。將該表用於指導如上所述修飾的MSP-142基因的密碼子用法選擇。例如圖3a中的表中所示，在天然基因中，65％(25/38)的亮氨酸由TTA編碼，它在乳腺中是稀有密碼子。在修飾的MSP-142基因中，100％的亮氨酸由CTG編碼，它是乳腺中亮氨酸的優選密碼子。
使用修飾的MSP-142基因構建表達載體，其通過將山羊β-酪蛋白的前端26個胺基酸融合到修飾的MSP-142基因的N-末端和將攜帶融合基因的SalI-Xho I片段亞克隆到表達載體pCDNA3的XhoI位點而進行的。將His6標記融合到MSP-142基因的3』末端使基因產物能夠親和純化。這樣製備了質粒GTC627(圖4c)。
為了比較天然MSP-142基因構建體和本發明修飾的MSP-142核酸，亦構建了天然MSP-142基因的表達載體並將該基因加到哺乳動物細胞培養物和注射到小鼠中形成轉基因小鼠，如下所述構建天然MSP-142表達載體為了分泌截短的惡性瘧原蟲裂殖子表面蛋白-1(MSP-1)，將編碼MSP-1 42kD C-末端部分(MSP-142)的野生型基因融合到編碼山羊β-酪蛋白的前15或前25個胺基酸的DNA序列中。這是通過首先用引物MSP1和MSP2(圖6)PCR擴增MSP-1質粒(來自Dr.David Kaslow，NIH)，然後將PCR產物克隆到TA載體(Invitrogen)獲得的。將PCR產物的BglII-XhoI片段與寡聚物OT1和OT2(圖6)連接進入表達載體pCDNA3。這樣產生了質粒GTC564(圖4b)，它編碼15個胺基酸的β-酪蛋白信號肽和成熟山羊β-酪蛋白的前11個胺基酸，隨後是天然MSP-142基因。使用寡聚物MSP-8和MSP-2(圖6)通過PCR擴增MSP-1質粒，然後將產物克隆到TA載體。切下XhoI片段並克隆到表達載體pCDNA3的XhoI位點產生質粒GTC479(圖4a)，它編碼融合到野生型MSP-142基因的15個胺基酸的山羊β-酪蛋白信號肽。在GTC564和GTC479中的MSP-142基因3』末端加上了組氨酸6(His6)標記。
在COS-7細胞中未表達天然MSP-142基因通過瞬時轉染檢測測定了培養的COS-7細胞中天然MSP基因的表達。按照廠商手冊使用脂質轉染胺試劑(Gibco-BRL)將GTC479和GTC564質粒DNA導入COS-7細胞。轉染兩天後從COS細胞分離總細胞RNA。轉染兩天後通過將35S甲硫氨酸加入培養物中代謝標記新合成的蛋白質10個小時。
為了測定COS細胞中的MSP mRNA表達，用來自GTC479的32P標記DNA片段探測Northern印跡。在GTC479或GTC564轉染體中未測到MSP RNA(未發表資料)。延長的曝光揭示有殘餘水平的降解的MSPmRNA。用抗MSP的多克隆抗體免疫沉澱35S標記的培養物上清和裂解物。免疫沉澱實驗顯示GTC479或GTC564轉染細胞的裂解物或上清中沒有表達(未發表資料)。這些結果顯示天然MSP-1未在COS細胞中表達。
在轉基因小鼠乳腺中沒有天然MSP-142基因的表達將編碼15個胺基酸的山羊β-酪蛋白信號肽，山羊β-酪蛋白的前11個胺基酸以及天然MSP-142基因的GTC479 SalI-XhoI片段克隆到載體BC350中表達的β-酪蛋白XhoI位點。這樣產生質粒BC574(圖7)。將BC574的SalI-NotI片段注射到小鼠胚胎產生轉基因小鼠。建立了15個株系的轉基因小鼠。收集雌性建立者小鼠的乳汁並使用抗MSP多克隆抗體進行Western檢測。檢測的7個小鼠乳汁中均未發現表達MSP-142蛋白質。為了進一步確定在乳腺是否有MSP-142的mRNA表達，從第11天的泌乳轉基因小鼠提取總RNA並進行Northern印跡檢測。檢測的任何一個BC574株系均未測到MSP-142mRNA。因而，MSP-142轉基因未在轉基因小鼠的乳腺中表達。總的來說，這些實驗提示天然寄生生物的MSP-142基因不能在哺乳動物細胞中表達，其阻斷是mRNA豐度的水平的。
哺乳動物細胞中MSP的表達進行了瞬時轉染實驗以評價本發明修飾的MSP-142基因在COS細胞中的表達。將GTC627和GTC479的DNA導入COS-7細胞。轉染後48小時分離總RNA進行Northern檢測。用32P標記GTC627的SalI-XhoI片段探測固定化RNA。觀察到GTC479和GTC627的顯著不同。如前面顯示，GTC479轉染細胞中未檢測到MSP-142mRNA，而在GTC627中表達了豐富的MSP-142mRNA(圖5，A欄)。GTC469用作陰性對照並且含有克隆到商品化克隆載體PU19的GTC564的插入片段。使用35S甲硫氨酸的代謝標記實驗以及隨後的使用抗MSP的多克隆抗體(由NIH的D.Kaslow NIAID提供)的免疫沉澱顯示轉染的COS細胞合成了MSP-142蛋白質(圖5，B欄)。而且，在轉染的COS細胞上清中檢測到MSP-142，表明MSP-142蛋白質亦分泌出來。此外，使用Ni-NTA柱，從GTC627轉染的COS上清中親和純化了MSP-142。
這些結果證明寄生性MSP-142基因的修飾導致MSP mRNA在COS細胞中表達。隨後，哺乳動物細胞合成和分泌MSP-142產物。
亦可使用本技術領域熟知的方法製備本實驗中使用的多克隆抗體(抗體實驗室手冊(AntibodiesA Laboratory Manual)，Ed Harlowand David Lane，eds.冷泉港實驗室(Cold Spring HarborLaboratory)，publishers(1988))。MSP血清抗體的產生亦描述於Chang et al.，感染和免疫(Infection and Immunity)(1996)64253-261 and Chang et al.，(1992)美國國家科學院院報(ProcNatl.Acad.Sci.USA)866343-6347。
這些檢測表明與根本不表達的天然蛋白質相比，本發明的修飾的MSP-142核酸可以高水平表達。這些結果代表了降低基因中的AT％導致MSP基因在異源系統中表達的第一個實驗證據，同時代表了從MSP編碼區消除AUUUA mRNA不穩定基序導致MSP蛋白質在COS細胞中表達的第一個證據。
這樣，此處給出的資料提示某些因為其高A/T含量和/或存在不穩定基序，和/或使用了選擇的細胞系統不識別的稀有密碼子而難以在細胞培養物或轉基因系統中表達的異源蛋白質可以藉助該系統的密碼子用法表進行工程改造使它們能在任何給定的系統中表達。本發明第一次表明為了消除造成導致低RNA水平或無RNA的降解的懷疑序列的目的進行DNA序列的修飾。圖5A欄Northern的結果(即天然基因無RNA而本發明的修飾的DNA序列有合理的水平的RNA)很可能解釋了蛋白質產生的增加。
下面的實施例描述了MSP1-42作為天然未融合(並且未糖基化)蛋白質在轉基因小鼠乳汁中的表達。
MSP轉基因的構建為了將MSP1-42與15個胺基酸的β-酪蛋白信號肽融合，將編碼15個胺基酸酪蛋白信號和結束於Cla I位點的MSP1-42的前5個胺基酸的寡聚物對MSP203和MSP204(MSP203ggccgctcgacgccaccatgaaggtcctcataattgcctgtctggtggctctggccattgcagccgtcactccctccgtcat.MSP204cgatgacggagggagtgacggctgcaatggccagagccaccagacaggcaattatgaggaccttcatggtggcgtcgagc)與編碼其餘的MSP1-42基因的BC620的CLA I-Xho I片段(圖8)連接進入表達載體pCDNA3的Xho I位點。然後將這個質粒(GTC669)的Xho I片段克隆到乳汁特異性表達載體BC350的Xho I位點產生B670(圖9)。
MSP1-42在轉基因小鼠乳汁中的表達從質粒BC670製備Sal I-Not I片段並微注射到小鼠胚胎產生轉基因小鼠。通過從尾巴活組織檢查提取小鼠DNA隨後使用寡聚物GTC17和MSP101(寡聚物的序列GTC17，GATTG ACAAG TAATA CGCTGTTTCC TC寡聚物MSP101，GGATTCAATAGATACGG)進行PCR檢測確認轉基因小鼠。在哺乳第7和9天收集雌性建立者轉基因小鼠的乳汁，並使用多克隆抗-MSP抗體和單克隆抗MSP抗體5.2(Dr.David Kaslow，NIH)通過western檢測確定MSP-1-42的表達水平。結果表明轉基因小鼠乳汁中MSP1-42的表達水平是1-2毫克/毫升(圖10)。
構建MSP1-42糖基化位點負突變體我們對乳汁產生的MSP檢測揭示轉基因MSP蛋白質是N-糖基化的。為了消除MSP1-42基因中的N-糖基化位點，用穀氨醯胺(Q)取代了181和262位點的天冬醯胺(N)。通過設計與MSP1相應區域退火的攜帶AAC到CAG突變的DNA寡聚物導入了置換。然後將這些寡聚物用作PCR引物產生編碼N到Q置換的DNA片段。
為了導入N262-Q突變，使用一對寡聚物MSPGYLYCO-3(CAGGGAATGCTGCAGATC AGC)和MSP42-2(AATTCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATCGCAGAAAATAC CATG圖11)PCR擴增含有合成的MSP 1-42基因的質粒GTC627。將PCR產物克隆到pCR2.1載體。這樣產生了質粒GTC716。
為了導入N181-Q突變，使用寡聚物MSPGLYCO-1(CTCCTTGTTCAGGAACTTGTAG GG)和MSPGLCO-2(GTCCTGCAGTACACATATGAG圖4)PCR擴增質粒GTC627。將PCR產物克隆到pCR2.1載體(Invitrogen)。這樣產生了質粒GTC700。
通過下面三個步驟構建了MSP雙糖基化突變體首先將BC670的Xho I-Bsm I片段和GTC716的BSm I-Xho I片段連接導入pCR2.1載體的Xho I位點。這樣產生了含有具N262-Q突變的MSP1-42基因的質粒。然後將這個質粒中的EcoN I-Nde I片段用GTC716質粒的EcoNI-Nde I片段取代，引入第二個突變N181-Q。最後將這個質粒的Xho I片段克隆到BC350產生BC718(圖12)。
轉基因動物中非糖基化MSP1的表達BC718具有下列特徵它攜帶處於β-酪蛋白啟動子控制下的MSP1-42基因因而可在轉基因動物哺乳期乳腺中表達。此外，它編碼直接與MSP1-42融合的15個胺基酸的β-酪蛋白前導序列，這樣在N-末端沒有任何多餘胺基酸的MSP1-42可以分泌到乳汁中。最後，由於N-Q置換，轉基因動物乳汁中此構建體產生的MSP不會被糖基化。總而言之，在乳汁中由BC718產生的轉基因MSP與寄生生物MSP1是相同的。
從質粒BC718製備了SalI/XhoI片段並微注射到小鼠胚胎產生了轉基因小鼠。如前面所述鑑定轉基因動物。收集雌性建立者的乳汁，並使用抗體5.2進行Western印跡檢測。結果示於圖13，表明非糖基化MSP1以0.5至1毫克/毫升的濃度表達。
等價物本技術領域熟術人員僅使用常規實驗會認識到或能夠確定多種等價物均被認為在本發明的範圍內，並由下面的權利要求所覆蓋。
權利要求
1.一種能在哺乳動物細胞中表達的寄生生物的修飾的已知核酸，其中的修飾包括通過用與所置換的密碼子編碼相同胺基酸的優選密碼子置換基因中的一個或多個含AT的密碼子來降低AT含量。
2.一種能在哺乳動物細胞中表達的寄生生物蛋白質的修飾的已知核酸，其中通過用與所置換的密碼子編碼相同胺基酸的優選密碼子置換mRNA不穩定基序來消除基因編碼序列中存在的至少一個mRNA不穩定基序。
3.權利要求1或2的修飾的核酸，其中由與所置換的密碼子編碼相同胺基酸的優選的乳汁蛋白特異性密碼子置換已知基因的至少一個或多個密碼子。
4.一種能在哺乳動物細胞中表達的寄生生物的修飾的已知核酸，其中通過乳汁蛋白特異性密碼子的置換降低了已知編碼基因的總AT含量，並且其中用乳汁蛋白特異性密碼子置換消除了基因中存在的至少一個mRNA不穩定基序以及用優選的乳汁蛋白特異性密碼子置換了天然基因中的至少一個密碼子。
5.權利要求4的修飾的核酸，其中所述修飾的核酸在體外或體內哺乳動物細胞系統中能夠以天然基因表達水平的至少100％的水平表達所述蛋白質。
6.製備用於在哺乳動物細胞中表達的寄生生物的修飾的已知核酸的方法，包括用與所置換的密碼子編碼相同胺基酸的優選的乳房特異性密碼子置換天然基因中的一個或多個含AT的密碼子來降低天然基因的AT含量。
7.製備用於在哺乳動物細胞中表達的寄生生物蛋白質的修飾的已知核酸的方法，包括用與所置換的密碼子編碼相同胺基酸的優選的乳房特異性密碼子置換基因中的一個或多個mRNA不穩定基序來消除基因中至少一個mRNA不穩定基序。
8.權利要求5或6的方法，進一步包括用與所置換的密碼子編碼相同胺基酸的優選的乳房特異性密碼子置換編碼所述蛋白質的天然基因中的一個或多個密碼子。
9.用權利要求5或6的方法製備的修飾的核酸序列。
10.製備用於在哺乳動物細胞中表達的寄生生物的修飾的已知核酸的方法，包括下列步驟a)用與所置換的密碼子編碼相同胺基酸的優選乳汁蛋白質特異性密碼子置換基因中的一個或多個mRNA不穩定基序來消除編碼所述蛋白質的天然基因中至少一個mRNA不穩定基序。b)用與所置換的密碼子編碼相同胺基酸的乳汁蛋白質特異性密碼子置換基因中的一個或多個含AT密碼子來降低編碼所述蛋白質的天然基因的AT豐富含量以及c)用與所置換的密碼子編碼相同胺基酸的優選的乳房特異性密碼子置換編碼所述蛋白質的天然基因中的一個或多個密碼子。
11.使用權利要求10的方法製備的修飾的核酸。
12.權利要求1的修飾的核酸，其中所述寄生生物是瘧原蟲並且所述核酸是序列1或序列9的片段或與其特異性同源的序列。
13.權利要求1的修飾的核酸，其中所述寄生生物是瘧原蟲並且所述核酸是序列9或其片段或與其特異性同源的序列。
14.能夠在細胞系統中表達的修飾的核酸，其是序列1的片段或與其特異性同源的序列，其中使用與所置換的密碼子編碼相同胺基酸的但可以有效降低天然基因總AT含量的所述細胞培養系統識別的密碼子置換一個或多個密碼子降低了該天然基因的AT含量。
15.能夠在細胞系統中表達的修飾的核酸，其是序列1的片段或與其特異性同源的序列，其中使用可以有效消除不穩定基序的且與所置換的密碼子編碼相同胺基酸的所述細胞系統識別的密碼子置換含有不穩定基序的一個或多個密碼子，消除了天然基因編碼序列中存在的至少一個mRNA不穩定基序。
16.權利要求14或15的修飾的核酸，其中用所述細胞系統的優選密碼子置換了天然基因中至少一個或所有的密碼子。
17.含有權利要求12的修飾的核酸的載體。
18.使用權利要求17的載體轉染或轉化的宿主細胞。
19.含有權利要求12的修飾的核酸的轉基因表達構建體。
20.非人轉基因動物，其種系含有權利要求12的修飾的核酸。
21.含有一個與權利要求12的修飾的核酸可操作相連的啟動子的用於產生轉基因動物的轉基因表達載體，其中所述啟動子指導所述修飾的核酸編碼的蛋白質在乳腺表達進入該動物乳汁中。
22.一種能在細胞系統中表達的細菌、病毒或寄生生物的修飾的已知核酸，其中使用與所置換的密碼子編碼相同胺基酸但可以有效降低天然基因總AT豐富含量的所述細胞系統識別的密碼子置換一個或多個密碼子，降低了該基因的AT含量。
23.一種能在細胞系統中表達的細菌、病毒或寄生生物的修飾的核酸，其中使用可以有效消除不穩定基序且與所置換的密碼子編碼相同胺基酸的所述細胞系統識別的密碼子置換含有所述不穩定基序的一個或多個密碼子，消除了基因編碼序列中存在的至少一個mRNA不穩定基序。
24.權利要求22或23的修飾的核酸，其中用所述細胞系統的優選密碼子置換了天然基因中至少一個或所有的密碼子。
25.含有權利要求24的修飾的核酸的DNA疫苗。
26.含有權利要求17載體的DNA疫苗。
全文摘要
本發明提供了修飾的重組核酸序列(優選的是DNA)以及增加蛋白質的mRNA水平和蛋白質表達的方法,這裡的蛋白質是已知或很可能在細胞培養系統、哺乳動物細胞培養系統或轉基因動物中難以表達的蛋白質。使用本發明重組技術表達的優選的「困難」蛋白質候選物是從優選是諸如寄生生物、細菌和病毒等低等生物的異源細胞衍生的蛋白質。它們的DNA編碼序列相對使用的重組表達系統而言含有高的總AT含量或富AT區和/或mRNA不穩定基序和/或稀有密碼子。
文檔編號C07H21/04GK1276831SQ98810400
公開日2000年12月13日 申請日期1998年10月20日 優先權日1997年10月20日
發明者L·H·陳, H·米德 申請人:根茨美轉基因公司