從無聲杆捕鳥蛛中得到的阻斷鈣通道的多肽的製作方法

2023-09-10 08:47:35 2

專利名稱：從無聲杆捕鳥蛛中得到的阻斷鈣通道的多肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及從無聲杆捕鳥蛛(Theraphosidae aphonopelma)蜘蛛毒液中發現的多肽及基本上具有與上述多肽相同胺基酸順序和相同活性的多肽。該多肽及其可藥用鹽阻斷細胞(包括無脊椎動物和脊椎動物的各種生物的神經細胞和肌細胞)中的鈣通道。本發明還涉及上述肽及其鹽本身阻斷細胞(例如生物的肌肉和神經系統的細胞)中鈣通道和治療哺乳動物的鈣通道介導的疾病與症狀的用途。而且，本發明還涉及含有所述肽及其鹽的組合物。
鈣拮抗劑化合物具有廣泛的用途。已知鈣拮抗劑可臨床用於治療許多疾病，其中包括絞痛、高血壓、心肌病、室上性心律失常、食管馳緩不能(aesophogeal achalasia)、早產和雷諾病。見W.G.Nayler，Calcium Antagonists，Academic Press，Harcourt Brace Jovanovich Publishers，New York，NY 1988，本文引入其教導作為參考。並且，此類化合物用於細胞(如神經和肌肉細胞)的生理學研究。
本發明涉及無聲杆捕鳥蛛蜘蛛毒液中發現的多肽。本發明的多肽及含有本發明多肽的級份如下無聲杆捕鳥蛛的肽6-6具有胺基酸順序，SEQ ID No∶1。
無聲杆捕鳥蛛的肽6-8具有胺基酸順序，SEQ ID No∶2。
無聲杆捕鳥蛛的肽7-6.1具有胺基酸順序，SEQ ID No∶3。
無聲杆捕鳥蛛的肽7-13.1具有胺基酸順序，SEQ ID No∶4。
無聲杆捕鳥蛛的肽7-13.2具有胺基酸順序，SEQ ID No∶5。
無聲杆捕鳥蛛的肽7-15.2具有胺基酸順序，SEQ ID No∶6。
無聲杆捕鳥蛛的肽7-17.1具有胺基酸順序，SEQ ID No∶7。
無聲杆捕鳥蛛的肽7-17.3具有胺基酸順序，SEQ ID No∶8。
無聲杆捕鳥蛛的肽7-17.4具有胺基酸順序，SEQ ID No∶9。
本發明的多肽阻斷細胞中鈣通道。因此，這些多肽本身可用於阻斷細胞中鈣通道。這些多肽也可用於控制無脊椎有害動物及治療哺乳動物中由細胞鈣通道功能介導的疾病和症狀。
那些具有與上述多肽基本相同的胺基酸順序及基本相同的鈣通道阻斷活性的多肽也在本發明範圍之內。
本發明還涉及含有上述多肽的藥物組合物和施用上述多肽的方法。
通過本領域專業人員熟知的電刺激擠取的一般方法，從無聲杆捕鳥蛛蜘蛛得到毒液。所用方法以防止全毒液被腹部的回流液和血液汙染的方法為好。這種方法是本領域專業人員所熟知的。得到的全毒液冷凍存放(約-78℃)，直至用於如下述的精製。通過反相高效液相層析(HPLC)用不同的製備及半製備柱如C-4和C-18 Vydac
柱(Rainin Instrument co.Inc.，Mack Road，Woburn Massachusetts 01801)完成由全毒液開始的組份精製。在220-230nm處成單色光地進行峰值測定。可以用如Waters990二極體矩陣檢測器(Millipore Corporation，Waters Chromatography Division，34 Maple Street，Milford，Massachusetts 01757)收集的多色紫外數據將級份進行進一步分析。用已知方法如用ISCO/「FOXY」級份收集器和ISCO2159峰值檢測器(ISCO，4700 Superior，Lincoln，Nebraska 68504)收集柱級份。以適宜大小的容器如潔淨的聚乙烯實驗室容器收集級份。這些級份的濃縮是通過凍乾洗脫液然後凍幹水完成的。然後通過層析分析(用分析柱，和比級份的最後精製過程所用的洗脫系統更為等效的梯度洗脫系統)測定所得組份級份的純度。
本發明的多肽可以根據已知方法來測序。測定一級結構的方法包括，例如下列步驟。1)為提高底物對酶進攻的敏感性，將二硫鍵的半胱氨酸殘基還原並S-吡啶基化。2)通過一步或多步酶促消化，控制該肽的裂解。3)通過反相高效液相(H PLC)分離和精製肽片斷。4)通過N-末端測序及離子噴霧質譜來描述肽片斷的特徵。
例如，可以在溶液中將研究的多肽半胱氨酸殘基進行S-吡啶基乙基化，然後進行多肽的胺基酸測序。一種這類S-吡啶基乙基化方法可按下面的描述完成。
將約1至10μg的多肽溶於或稀釋到最多達50μl的緩衝液中，該緩衝液由1份1M Tris鹽酸緩衝液(pH8.5，含有4mM EDTA)和3份8M鹽酸胍混合而製得。加入2.5μl 10%的2-巰基乙醇水溶液，並將該混合物在氬氣氛下、室溫避光處培養兩小時。之後，加入2μl 4-乙烯基吡啶(存於-20℃氬氣中的新鮮試劑)並將該混合物於氬氣氛下、室溫避光處繼續培養2小時。然後將該混合物脫鹽，優選通過一根短的、反相柱層析脫鹽。再根據已知方法對回收的烷基化的多肽測序。
得益於本文公開了關於由無聲杆捕鳥蛛的毒液中得到的存在於級份6-6，6-8，7-6.1，7-13.1，7-13.2，7-15.2，7-17.1，7-17.3和7-17.4中的肽，現在可以不通過全毒液分離/精製的方法得到上述肽。本發明的多肽可以通過克隆上述肽或其部分編碼順序使用重組DNA技術來生產。例如，按本領域專業人員熟知的方法，可以應用利用了現在已知的上述多肽的胺基酸序列信息的雜交探針來克隆該完整多肽的編碼順序。結合重組DNA技術和體外蛋白質合成，也可用於生產本發明的多肽。這類體外蛋白質合成方法包括(但不限於)使用運用了本領域專業人員熟知的標準Merrifield化學或其它固相化學方法的ABI 430A固相肽合成儀(Applied Biosystems，Inc.，850 Lincoln Center Drive，Foster City，California 94404)合成多肽。
本領域熟知，多肽中可以進行某些不影響或基本不影響所述多肽功能的胺基酸替換。確切可能的替換因多肽不同而不同。根據本領域專業人員熟知的方法來確定可允許的替換。這樣，本發明的範圍包括了具有基本相同胺基酸順序和基本相同鈣通道阻斷活性的全部多肽。
本發明的多肽阻斷許多細胞中的鈣通道，例如無脊椎動物和脊椎動物的神經及肌肉系統的細胞。
以下的方法證實了本發明的多肽阻斷鈣通道的能力。由8日齡大白鼠的小腦製備小腦粒細胞(Wilkin等.，Brain Res，115，181-199，1976)。用多-L-賴氨酸覆蓋Aclar小塊(1cm2)(Proplastics Inc.，5033 Industrial Ave.，Wall，NJ 07719)並置於含有1ml Eagles Basal介質的12孔培養盤中。分離細胞，並將含有6.25×106個細胞的等分試樣加到含有Aclar小塊的每個孔中。鋪板後24小時加入胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(終濃度10μM)。該細胞用於在培養第6、7和8天的fura2分析。將細胞(附著於Aclar小塊上)轉移到含有1ml的2μM fura2/AM(於HEPES緩衝液中，該緩衝液含0.01%牛血清白蛋白、0.01%右旋糖，pH7.4，不含鎂)(Molecular Probes Inc.，Eugene，OR 97402)的12孔盤中。該細胞於37℃培養40分鐘;取出含fura2/AM的緩衝液並重新加入1ml不含fura2/AM的相同緩衝液。往一小石英杯中加入2.0ml預先溫熱(37℃)的緩衝液。將Aclar上的細胞加到該杯中並將該杯插入一個安有磁力攪拌器的保溫裝置中(37℃)，並用螢光分光光度計(Biomedical Instrument Group，University of Pennsylvania)檢測其螢光。使螢光信號穩定約2分鐘。然後，將5-20μl合適濃度的受試化合物的磷酸緩衝鹽水標準溶液(PBS，pH7.4)加到該杯中。在完成每批測定中，使用Nemeth等建立的方法(J.Biol.Chem.，262，5188(1987)進行螢光信號校正和fara2/AM滲漏校正。由加入伊屋諾黴素(35μM)測到了最大的螢光值(Fmax)，而隨後加入與鈣螯合的EGTA(12mM)測到了最小的螢光值(Fmin)。使用前述方法，加入本發明多肽，螢光降低，顯示出發生了本發明多肽對鈣通道的阻斷作用。使用該試驗，本發明的多肽阻斷了鈣通道，在200nm下表現出低IC50值。為比較說明，兩種已知的商用鈣通道阻斷劑，硝苯吡啶和異搏定分別具有33nm和4800nm的IC50值。
本發明的多肽本身用作細胞中的鈣通道阻斷劑。因此，這些多肽也可用於控制無脊椎有害動物的病害及治療哺乳動物的由細胞中鈣通道功能介導的疾病和症狀，例如絞痛、高血壓、心肌病、室上性心律失常、食管馳緩不能、早產和雷諾病。並且，這些肽用於細胞(包括(但不限於)神經、肌肉和心血管系統的細胞)的生理學研究。
本發明多肽的可藥用鹽也在本發明的範圍之內。此類鹽通過本領域專業人員熟知的方法生成。例如，多肽的酸式鹽可通過常規方法來製備。
當給哺乳動物施用本發明的多肽時，依一般藥用慣例，本發明多肽可以單獨使用或與可藥用載體或稀釋劑結合使用。該多肽可口服或經非胃腸道給藥，但多肽優選非胃腸道給藥途徑。非胃腸道給藥包括靜脈內、肌肉內、腹膜內、皮下和局部給藥。
用於口服的本發明多肽，例如可以以片劑或膠囊劑形式、或作為水溶液劑或懸濁劑形成服用該化合物。用於口服的片劑情形時，通常用的載體包括乳糖和玉米澱粉，也常加入潤滑劑，如硬脂酸鎂。用於口服的膠囊形式中，有利的稀釋劑是乳糖和幹玉米澱粉。當需口服水懸濁劑時，將活性成份與乳化劑和懸浮劑混合。如果需要，也可加入某些甜味劑和/或調味劑。
用於肌內、腹膜內、皮下和靜脈內，通常要製備該活性成份的無菌溶液劑，並且該溶液劑的pH應當適當調節並緩衝。靜脈內使用時，應控制溶質的總濃度，以使得該製劑等滲。
當本發明的多肽或其鹽用於人類對象時，一般應由處方醫師來確定每日劑量。並且，該劑量隨患者個體的年齡、體重和反應，以及患者症狀的嚴重程度和所施用的具體化合物的效能不同而不同。
當本發明的多肽或其鹽用於控制無脊椎有害動物時，將上述多肽直接施用於上述無脊椎動物或將上述多肽施用到上述無脊椎有害動物環境中。例如，可將本發明的化合物以溶液形式噴灑於上述無脊椎動物。控制上述無脊椎動物所需的化合物劑量隨無脊椎動物及環境條件不同而不同，並決定於人們所用的化合物。
當本發明的多肽或其鹽用於細胞的生理研究時，按照本領域技術人員熟知的方法給細胞施用上述多肽。例如，可在合適的生理緩衝液中給細胞施用上述多肽。此類研究所用的本發明多肽的適宜濃度為200μM。但是，在此類研究中上述肽的濃度可以大於或大大低於200μM。本領域專業人員可按熟知的方法來確定所施用多肽的量。
實施例第Ⅰ步，無聲杆捕鳥蛛的天然毒液的分級分離將無聲杆捕鳥蛛的天然毒液(約40μl)上樣至反相HPLC柱(Vydac
，C-18，300
，22×250mm)並使用雙相線性梯度系統洗脫(從95%A和5%B至80%A和20%B洗脫30分鐘，然後從80%A和20%B至30%A和70%B洗脫25分鐘(A＝0.1%三氟乙酸(TFA)，B＝乙腈))，在波長為220nm處檢測，流速為15ml/分。按如下規定收集了級份。
表1級份6 35.9至37.3分鐘級份7 37.3至39.5分鐘級份8 39.5至40.1分鐘級份9 40.1至40.9分鐘級份10 40.9至41.8分鐘通過凍幹濃縮了分段合併的上面每組級份。如下述進行進一步分級分離。
第Ⅱ步，第Ⅰ步級份的細分級分離A)級份6的細分級分離將由約60μl天然毒液經上述第Ⅰ步得到的級份6樣品上樣至反相HPLC柱(Baker WP C-18，4.6×250mm)，用85%A和15%B至65%A和35%B的線性梯度洗脫系統洗脫45分鐘(A＝0.1%TFA，B＝乙腈)，在220nm處檢測，流速為1.0ml/分。按下述規定收集了級份。
表2級份6-6 24.0至24.8分鐘級份6-7 25.0至25.4分鐘級份6-8 25.6至26.5分鐘級份6-9 27.0至28.7分鐘級份6-13 33.5至34.4分鐘級份6-14 34.4至35.4分鐘經凍幹濃縮了分段合併的上面各組級份。
B)級份7的細分級分離將從約60μl天然毒液經上述第Ⅰ步處理得到的級份7樣品上樣於強陽離子交換柱(磺乙基天冬醯胺(The Nest Group，45 Valley Rd.，Southborough，MA 01772)，5μ，4.6×200mm)，使用從100%A和0%B至0%A和100%B的線性梯度系統洗脫45分鐘(A＝5mM H3PO4/20%乙腈，B＝5mM H3PO4，1.0M NaCl/20%乙腈)，於230mm處檢測，流速為1.0ml/分。按下述規定收集了級份。
表3級份7-6 21.9至22.3分鐘級份7-9 24.8至25.5分鐘級份7-11 26.1至26.7分鐘級份7-12 27.1至27.6分鐘級份7-13 27.6至28.9分鐘級份7-14 29.7至30.8分鐘級份7-15 31.0至32.3分鐘級份7-16 32.5至33.1分鐘級份7-17 34.2至36.0分鐘經凍幹濃縮了分段收集的上述各組級份。
C)級份8的分級分離將從約100μl天然毒液經上述第Ⅰ步分離得到的級份8樣品物質上樣至反相H PLC柱(Vydac
，C-18，300
，10×250mm)，以線性梯度洗脫系統進行洗脫從80%A和20%B至71%A和29%B洗脫35分鐘，然後用71%A和29%B洗脫10分鐘(A＝0.1%TFA，B＝乙腈)，在220nm處檢測，流速為6.0ml/分。按下規定收集了級份。
表4級份8-5 19.2至21.2分鐘級份8-6 21.3至22.5分鐘級份8-7 25.9至26.5分鐘級份8-8 27.4至28.3分鐘經凍幹濃縮了分級合併的上述各組級份。
第Ⅲ步，第Ⅱ步級份的細分級分離。
A)級份7-6的細分級分離將由約70μl天然毒液經上述第Ⅱ-B步處理得到的級份7-6樣品上樣至反相HPLC柱(Vydac
，C-18，300
，10×250mm)，並用線性梯度系統展開用90%A和10%B洗脫10分鐘，然後用90%A和10%B至60%A和40%B洗脫40分鐘(A＝0.1% TFA，B＝乙腈)，在220nm處檢測，流速為3.5ml/分。如下規定收集了級份。
表5級份7-6.1 32.2至34.3分鐘級份7-6.2 35.5至36.2分鐘經凍幹濃縮分段收集的上每組級份。
B)級分7-9的細分級分離將從約300μl天然毒液經上述第Ⅱ-B步驟得到的級份7-9樣品上樣至反相HPLC柱(Vydac
，C-18，300
，10×250mm)，用線性梯度系統進行洗脫用90%A和10%B洗脫10分鐘，然後用90%A和10%B至65%A和35%B洗脫40分鐘(A＝0.1% TFA，B＝乙腈)，在220nm處檢測，流速為3.5ml/分。收集洗脫時間從33至35分鐘的洗脫級份，併合為級份7-9.1。
C)級份7-11的細分級分離將由約600μl天然毒液經上述第Ⅱ-B步得到的級份7-11樣品上樣至反相HPLC柱(Vydac
，C-18，300
，10×250mm)，用線性梯度系統進行洗脫(90%A和10%B洗脫10分鐘，然後用90%A和10%B至65%A和35%B洗脫60分鐘(A＝0.1% TFA，B＝乙腈)，在220nm處檢測，流速為3.5ml/分。收集洗脫時間從34.2至35.5分鐘的洗脫級份，合併為級份7-11.1。
D)級份7-12的細分級分離將由約600μl天然毒液經上述第Ⅱ-B步得到的級份7-12樣品上樣至反相HPLC柱(Vydac
，C-18，300
，10×250mm)，先用90%A和10%B洗脫10分鐘，然後用從90%A和10%B至65%A加35%B的線性梯度洗脫系統展開60分鐘(A＝0.1% TFA，B＝乙腈)，在220nm處檢測，流速為3.5ml/分。如下規定收集了級份。
表6級份7-12.1 28.0至29.1分鐘級份7-12.2 38.4至39.6分鐘E)級份7-13的細分級分離將從約200μl天然毒液經上述第Ⅱ-B步得到的級份7-13樣品上樣至反相HPLC柱(Vydac
，C-18，300
，10×250mm)，先用90%A加10%B洗脫10分鐘，然後用從90%A加10%B至60%A加40%B的線性梯度系統洗脫40分鐘(A＝0.1% TFA，B＝乙腈)，在220nm處檢測，流速為3.5ml/分。按下述規定收集了級份。
表7級份7-13.1 33.0至34.5分鐘級份7-13.2 35.1至36.5分鐘經凍幹濃縮了分段合併的上述每組級份。
F)級份7-15的細分級分離將從約200μl天然毒液經上述第Ⅱ-B步得到的級份7-15樣品上樣至反相HPLC柱(Vydac
，C-18，300
，10×250mm)，先用90%A加10%B洗脫10分鐘，然後用從90%A加10%B至60%A加40%B的線性梯度洗脫系統展開40分鐘(A＝0.1% TFA，B＝乙腈)，在220nm處檢測，流速為3.5ml/分。按下述規定收集了級份。
表8級份7-15.1 33.1至33.6分鐘級份7-15.2 34.5至36.2分鐘級份7-15.3 37.7至39.1分鐘經凍幹濃縮了分段合併的上述各組級份。
G)級份7-16的細分級分離將從約600μl天然毒液經上述第Ⅱ-B步得到的級份7-16樣品上樣至反相HPLC柱(Vydac
，C-18，300
，10×250mm)，先用90%A加10%B洗脫10分鐘，然後用從90%A加10%B至65%A加35%B的線性梯度洗脫系統展開60分鐘(A＝0.1% TFA，B＝乙腈)，在220nm處檢測，流速為3.5ml/分。收集了脫脫時間為31.8至33.0分鐘的級份，合併為級份7-16.1。
H)級份7-17的細分級分離將由約25μl天然毒液經上述第Ⅱ-B步得到的級份7-17樣品上樣至反相HPLC柱(Vydac
，C-18，300
，10×250mm)，先用90%A加10%B洗脫10分鐘，然後用從90%A加10%B至60%A加40%B的線性梯度系統洗脫40分鐘(A＝0.1% TFA，B＝乙腈)，在220nm處檢測，流速為3.5ml/分。按下述規定收集了級份。
表9級份7-17.1 15.6至18.4分鐘級份7-17.2 18.5至19.4分鐘級份7-17.3 27.1至28.6分鐘級份7-17.4 28.6至30.1分鐘級份7-17.5 30.1至31.9分鐘級份7-17.6 31.9至33.5分鐘經凍幹濃縮了分段收集的上述各組級份。
實施例1 無聲杆捕鳥蛛的肽6-6用下面的方法測定並證實了上述第Ⅱ-A步驟中製備的肽6-6的結構。用Waters Pico-Tag系統對1-10nmols樣品(分三份)進行苯氨基硫甲醯基(PTC)胺基酸分析。在脈衝液相順序分析儀(ABI)上，對天然肽和還原/吡啶基乙基化肽都進行了N-末端測序分析。由SCIEX API Ⅲ離子噴霧質譜儀獲得質譜分析。
取得的數據共同證實了肽6-6的結構如下所示。
SEQ ID No∶1，39個殘基，6個半胱氨酸，3個二硫鍵。
計算質量＝4382.3。
觀測質量＝4382.16±0.54(離子噴霧質譜)。
實施例2 無聲杆捕鳥蛛的肽6-8用下面的方法測定並證實了上述第Ⅱ-A步驟中製備的肽6-8的結構。用W aters Pico-Tag系統對1～10nmols樣品(分三份)進行PTC胺基酸分析。在脈衝液相順序分析儀(ABI)上對天然肽和還原/吡啶基乙基化肽都進行了N-末端測序分析。由SCIEX API Ⅲ離子噴霧質譜儀獲得質譜分析。
取得的數據共同證實了肽6-8結構如下所示。
SEQ ID No∶2，39個殘基，6個半胱氨基，3個二硫鍵。
計算質量＝4369.2。
觀測質量＝4368.26±0.27(離子噴霧質譜)。
實施例3 無聲杆捕鳥蛛的肽7-6.1用下列方法測定並證實了上述第Ⅲ-A步驟中製備的肽7.6-1的結構。用Waters Pico-Tag系統對1～10nmols樣品(分三份)進行PTC胺基酸分析。在脈衝液相順序分析儀(ABI)上對天然肽和還原/吡啶基乙基化肽都進行N-末端測序分析。由SCIEX API Ⅲ離子噴霧質譜儀獲得質譜分析。
取得的數據共同證實了肽7-6.1的結構如下所示。
SEQ ID No∶3，33個殘基，6個半胱氨酸，3個二硫鍵。
計算質量＝3786.2。
觀測質量＝3784.54(離子噴霧質譜)。
實施例4 無聲杆捕鳥蛛的肽7-13.1用下列方法測定並證實了上述第Ⅲ-E步驟中製備的肽7-13.1的結構。用Waters Pico-Tag系統對1～10nmols樣品(分三份)進行PTC胺基酸分析。在脈衝液相順序分析儀(ABI)上對天然肽和還原/吡啶基乙基化肽都進行N-末端測序分析。由SCIEX API Ⅲ離子噴霧質譜儀獲得質譜分析。
取得的數據共同證實了肽6-8的結構如下所示。
SEQ ID No∶4，34個殘基，6個半胱氨酸，3個二硫鍵。
計算質量＝3814.32。
觀測質量＝3813.67±0.27(離子噴霧質譜)。
實施例5 無聲杆捕鳥蛛的肽7-13.2用下面的方法測定並證實了上述第Ⅲ-E步驟中製備的肽7-13.2的結構。用Waters Pico-Tag系統對1～10nmols樣品(分三份)進行PTC胺基酸分析。在脈衝液相順序分析儀(ABI)上對天然肽和還原/吡啶基乙基化肽都進行了N-末端測序分析。由SCIEX API Ⅲ離子噴霧質譜儀獲得質譜分析。
取得的數據共同證實了肽7-13.2的結構如下所示。
SEQ ID No∶5，42個殘基，6個半胱氨酸，3個二硫鍵。
計算質量＝4844.45。
觀測質量＝4844.66(離子噴霧質譜)。
實施例6 無聲杆捕鳥蛛的肽7-15.2用下面方法測定並證實了上述第Ⅲ-F步驟中製備的肽7-15.2的結構。用Waters Pico-Tag系統對1～10nmols樣品(分三份)進行PTC胺基酸分析。在脈衝液相順序分析儀(ABI)上對天然肽和還原/吡啶基乙基化肽都進行N-末端測序分析。由SCIEX API Ⅲ離子噴霧質譜儀獲得質譜分析。
取得的數據共同證實了肽7-15.2的結構如下所示。
SEQ ID No∶6，39個殘基，6個半胱氨酸，3個二硫鍵。
計算質量＝4342.19。
觀測質量＝4341.84±0.33(離子噴霧質譜)。
實施例7 無聲杆捕鳥蛛的肽7-17.1用下面的方法測定並證實了上述第Ⅲ-H步驟中製備的肽7-17.1的結構。用Waters Pico-Tag系統對1～10nmols樣品(分三份)進行PTC胺基酸分析。在脈衝液相順序分析儀(ABI)上對天然肽和還原/吡啶基乙基化肽都進行N-末端測序分析。由SCIEX API Ⅲ離子噴霧質譜儀獲得質譜分析。
取得的數據共同證實了肽7-17.1的結構如下所示。
SEQ ID No∶7，39個殘基，6個半胱氨酸，3個二硫鍵。
計算質量＝4383.28。
觀測質量＝4382.33±0.52(離子噴霧質譜)。
實施例8 無聲杆捕鳥蛛的肽7-17.3用下面方法測定並證實了上述第Ⅲ-H步驟中製備的肽7-17.3的結構。用Waters Pico-Tag系統對1～10nmols樣品(分三份)進行PTC胺基酸分析。在脈衝液相順序分析儀(ABI)上對天然肽和還原/吡啶基乙基化肽都進行N-末端測序分析。由SCIEX API Ⅲ離子噴霧質譜儀獲得質譜分析。
取得的數據共同證實了肽7-17.3的結構如下所示。
SEQ ID No∶8。
觀測質量＝4368.23±0.47(離子噴霧質譜)。
實施例9 無聲杆捕鳥蛛的肽7-17.4用下面方法測定並證實了上述第Ⅲ-H步驟中製備的肽7-17.4的結構。用Waters Pico-Tag系統對1～10nmols樣品(分三份)進行PTC胺基酸分析。在脈衝液相順序分析儀(ABI)上對天然肽和還原/吡啶基乙基化肽都進行N-末端測序分析。由SCIEX API Ⅲ離子噴霧質譜儀獲得質譜分析。
取得的數據共同證實了肽7-17.4的結構如下所示。
SEQ ID No∶9，39個殘基，6個半胱氨酸，3個二硫鍵。
計算質量＝4383.23。
觀測質量＝4382.19±0.38(離子噴霧質譜)。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人(A)名稱Pfizer Inc(B)街道235 East 42nd Street(C)城市New York(D)州New York
(E)國家U.S.A.
(F)郵政編碼(ZIP)10017(G)電話(203)441-4905(H)電傳(203)441-5221(A)名稱NPS Pharmaceuticals，Inc.
(B)街道420 Chipeta Way(C)城市Salt Lake City(D)州Utah(E)國家U.S.A.
(F)郵政編碼(ZIP)84108(G)電話(801)583-4939(H)電傳(801)583-4961(ⅱ)發明名稱從無聲杆捕鳥蛛中得到的阻斷鈣通道的多肽(ⅲ)序列數9(ⅳ)計算機可讀形式(A)介質類型軟磁碟(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOC/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release ＃1.0，Version ＃1.25(EPO)(ⅵ)優選申請資料(A)申請號US 07/973，323(B)申請日03-11-1992(2)SEQ ID No∶1的信息
(ⅰ)順序特徵(A)長度39個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈單(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說(Hypothetical)無(ⅳ)反有意義(鏈)(Anti-Sense)無(ⅵ)最初來源(A)生物體無聲杆捕鳥蛛(B)組織類型毒液(xi)順序描述SEQ ID No∶1
(2)SEQ ID No∶2的信息(ⅰ)順序特徵(A)長度39個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈單(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說無
(ⅳ)反有意義(鏈)無(ⅵ)最初來源(A)生物體無聲杆捕鳥蛛(B)組織類型毒液(xi)順序描述SEQ ID No∶2
(2)SEQ ID No∶3的信息(ⅰ)順序特徵(A)長度33個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈單(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說無(ⅳ)反有意義(鏈)無(ⅵ)最初來源(A)生物體無聲杆捕鳥蛛(B)組織類型毒液(xi)順序描述SEQ ID No∶3
(2)SEQ ID No∶4的信息(ⅰ)順序特徵(A)長度34個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈單(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說無(ⅳ)反有意義(鏈)無(ⅵ)最初來源(A)生物體無聲杆捕鳥蛛(B)組織類型毒液(xi)順序描述SEQ ID No∶4
(2)SEQ ID No∶5的信息(ⅰ)順序特徵(A)長度42個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈單
(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說無(ⅳ)反有意義(鏈)無(ⅵ)最初來源(A)生物體無聲杆捕鳥蛛(B)組織類型毒液(xi)順序描述SEQ ID No∶5
(2)SEQ ID No∶6的信息(ⅰ)順序特徵(A)長度39個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈單(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說無(ⅳ)反有意義(鏈)無(ⅵ)最初來源(A)生物體無聲杆捕鳥蛛(B)組織類型毒液
(xi)順序描述SEQ ID No∶6
(2)SEQ ID No∶7的信息(ⅰ)順序特徵(A)長度39個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈單(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說無(ⅳ)反有意義(鏈)無(ⅵ)最初來源(A)生物體無聲杆捕鳥蛛(B)組織類型毒液(xi)順序描述SEQ ID No∶7
(2)SEQ ID No∶8的信息(ⅰ)順序特徵
(A)長度35個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈單(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說無(ⅳ)反有意義(鏈)無(ⅵ)最初來源(A)生物體無聲杆捕鳥蛛(B)組織類型毒液(xi)順序描述SEQ ID No∶8
(2)SEQ ID No∶9的信息(ⅰ)順序特徵(A)長度39個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈單(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說無(ⅳ)反有意義(鏈)無
(ⅵ)最初來源(A)生物體無聲杆捕鳥蛛(B)組織類型毒液(xi)順序描述SEQ ID No∶9
權利要求
1.一種基本上純的、含有胺基酸順序為SEQ ID No1、SEQ ID No2、SEQ ID No3、SEQ ID No4、SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9的多肽或一種具有與上述多肽基本相同的胺基酸順序和基本相同的鈣通道阻斷活性的多肽或其可藥用鹽。
2.一種根據權利要求1的基本上純的多肽或其可藥用鹽，該多肽含有胺基酸順序為SEQ ID No∶1、SEQ ID No∶2、SEQ ID No∶3、SEQ ID No∶4、SEQ ID No∶5、SEQ ID No∶6、SEQ ID No∶7、SEQ ID No∶8、SEQ ID No∶9。
3.一種阻斷細胞中鈣通道的方法，該方法包括給上述細胞施用鈣通道阻斷量的依據權利要求1的多肽。
4.根據權利要求3的方法，其中所述細胞位於哺乳動物的神經系統。
全文摘要
從無聲杆捕鳥蛛蜘蛛的毒液分離的多肽阻斷各種生物物體細胞的鈣通道，並且本身用於阻斷上述細胞中鈣通道和治療鈣通道介導的疾病和症狀，並用於控制無脊椎有害動物。
文檔編號A61P43/00GK1090289SQ93119818
公開日1994年8月3日 申請日期1993年11月2日 優先權日1992年11月3日
發明者R·A·福克曼, N·A·薩科曼諾, D·M·內森, D·菲利普斯 申請人:美國輝瑞有限公司, Nps藥物有限公司