Bard1基因突變檢測特異性引物和液相晶片的製作方法
2023-09-11 02:01:10
Bard1基因突變檢測特異性引物和液相晶片的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種BARD1基因突變檢測液相晶片和特異性引物，該液相晶片主要包括有：每種由5』端的tag序列和3』端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成的ASPE引物，所述特異性引物序列為：T6883G位點的SEQ?ID?NO.11及SEQ?ID?NO.12，針對A43635G位點的SEQ?ID?NO.13及SEQ?ID?NO.14，針對G1670C位點的SEQ?ID?NO.15及SEQ?ID?NO.16，針對G25542A位點的SEQ?ID?NO.17及SEQ?ID?NO.18，和/或針對G1134C位點的SEQ?ID?NO.19及SEQ?ID?NO.20；有不同anti-tag序列包被的微球；擴增引物。本發明所提供的檢測液相晶片的檢測結果與測序法的吻合率高達100％，實現多個突變位點的野生型和突變型並行檢測。
【專利說明】BARD1基因突變檢測特異性引物和液相晶片
【技術領域】
[0001]本發明屬於分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體的是涉及一種BARDl基因突變檢測特異性引物和液相晶片。
【背景技術】
[0002]BRCAl 關聯環域 I (BRCA1 associated RING domain，BARDl)是一種可以與 BRCAl蛋白結合的蛋白，因為具有和BRCAl相似的環指功能域，所以命名為BARD1。BARDl基因位於2號染色體2q34_35的長臂上，編碼含777個胺基酸殘基的蛋白。該蛋白的主要功能域有環指功能域、三個錨蛋白重複序列和兩個羧基端功能域。BARDl基因突變可以阻止BARDl蛋白對受損DNA的修復，DNA缺陷的累積會使細胞的生長分裂失去控制，從而形成腫瘤。另外，有研究發現BARDl基因在乳腺癌的發生發展中發揮了一定的作用。
[0003]目前，BARDl基因突變檢測方法主要有:基質輔助雷射解析電離時間飛行質譜技術(MALD1-T0F-MS)、螢光定量PCR技術和PCR-RFLP，基質輔助雷射解析電離時間飛行質譜技術是一種軟電離技術，在蛋白質等生物大分子的檢測中有著強大而成熟的功能，但是在核酸檢測領域，由於核酸分子本身的特殊性，檢測受到一定的限制，螢光定量PCR技術具有靈敏度高、特異性強、自動化程度高的特點，但也存在樣品易汙染、假陽性率高的缺點，且每次只能檢測一種突變類型，PCR-RFLP法是基於基因突變造成的限制性內切酶識別位點的改變，如位點丟失或產生新位點，通過PCR擴增某一特定片段，再用限制性內切酶酶切擴增產物，電泳觀察片段的大 小，這種方法用於檢測酶切位點改變的基因突變，可直接判斷基因型，但該法不能用於沒有產生新酶切位點的基因突變檢測。
【發明內容】
[0004]本發明的目的之一是提供BARDl基因突變檢測液相晶片，該液相晶片可用於單獨或並行檢測BARDl基因五種常見基因型T6883G、A43635G、G1670C、G25542A和G1134C的野
生型和突變型。
[0005]實現上述目的的技術方案如下。
[0006]一種BARDl基因突變檢測液相晶片，包括有:
[0007](A).針對BARDl基因不同突變位點分別設計的野生型和突變型的ASPE引物對:每條ASPE引物由5』端的tag序列和3』端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為:針對T6883G位點的SEQ ID N0.11及SEQ ID N0.12，針對A43635G位點的 SEQ IDN0.13 及 SEQ ID N0.14，針對 G1670C 位點的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，針對 G25542A 位點的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，和 / 或針對 Gl 134C 位點的 SEQ IDN0.19 及 SEQ ID N0.20 ;所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.10 ；
[0008](B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID N0.21~SEQ IDN0.30,且所述ant1-tag序列能相應地與(A)中所選的tag序列互補配對；[0009]( C).用於擴增出需要檢測的、具有相應突變位點的目標序列的引物。
[0010]在其中一個實施例中，所述擴增引物為:針對T6883G位點的SEQ ID N0.31及SEQID N0.32，針對 A43635G 位點的 SEQ ID N0.33 及 SEQ ID N0.34，針對 G1670C 位點的 SEQID N0.35 及 SEQ IDN0.36，針對 G25542A 位點的 SEQ ID N0.37 及 SEQ ID N0.38，和 / 或針對 G1134C 位點的 SEQ IDN0.39 及 SEQ ID N0.40。
[0011]在其中一個實施例中，所述ASPE引物對為針對T6883G位點的由SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.11組成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.12組成的序列，針對A43635G位點的由SEQ IDN0.3和SEQ ID N0.13組成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.14組成的序列，針對G1670C位點的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.15組成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.16組成的序列，針對G25542A位點的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.17組成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ IDN0.18組成的序列，和/或針對Gl 134C位點的由SEQ IDN0.9和SEQ ID N0.19組成的序列及由SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.20組成的序列。
[0012]本發明的另一目的是提供用於BARDl基因突變檢測的特異性引物。
[0013]實現該目的的技術方案如下。
[0014]用於BARDl基因突變檢測的特異性引物，所述特異性引物為針對T6883G位點的SEQ IDN0.11 及 SEQ ID N0.12，針對 A43635G 位點的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，針對G1670C 位點的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，針對 G25542A 位點的 SEQ ID N0.17 及 SEQID N0.18，和 / 或針對 G1134C 位點的 SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20。
[0015]本發明的主要優點在於:
[0016]1.本發明所提供的BARDl基因突變檢測液相晶片的檢測結果與測序法的吻合率高達100%。且檢測所需要的 時間遠遠低於常用的測序技術，特別符合實際應用需要。所製備的BARDl基因突變檢測液相晶片具有非常好的信號-噪聲比，並且所設計的探針以及ant1-tag序列之間基本上不存在交叉反應，tag標籤序列、ant1-tag標籤序列的選取以及tag標籤序列與具體ASPE引物的結合，能夠避免交叉反應，實現多個突變位點的並行檢測。
[0017]2.本發明通過發明人長期積累的設計經驗和大量的實驗操作，從眾多的特異性引物中選取了最優的組合。本發明設計的ASPE引物特異性引物能夠靈敏特異地識別目標檢測的突變位點，準確區分各種型別的基因型；在同一個反應體系中，不同的特異性引物之間、特異性引物與非目標檢測的PCR擴增產物之間基本上不存在交叉反應，檢測特異性好，交叉反應率低於3% ;除了能夠檢測單個位點突變情況，也能夠同時並行檢測多個突變位點的突變情況，檢測效果一致。
[0018]3.本發明的檢測方法步驟簡單，5種突變位點檢測可通過一步PCR即可完成5條含有突變位點的目標序列的擴增，避免了反覆多次PCR等複雜操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準確率，體現了精確的同時定性、定量分析特徵。
[0019]4.本發明不僅克服了傳統固相晶片敏感性不高，檢測結果的可重複性差的缺陷，同時對現有的液相晶片技術進行改進，使得所製備微球能適用於不同的檢測項目，具有很強的拓展性。檢測的螢光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進一步得到提高，信噪比增強，檢測結果更加準確可靠。
【具體實施方式】[0020]實施例1BARDl基因突變檢測液相晶片，主要包括有:
[0021]一、ASPE 引物
[0022]針對BARDl 基因五種常見基因型 T6883G、A43635G、G1670C、G25542A 和 G1134C 的野生型和突變型，分別設計特異性引物序列。ASPE引物由「tag序列+特異性引物序列」組成。ASPE引物序列如下表所示:
[0023]表1BARDl基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特異性引物序列)
[0024]
【權利要求】
1.一種BARDl基因突變檢測液相晶片，其特徵是，包括有: (A).針對BARDl基因不同突變位點分別設計的野生型和突變型的ASPE引物對:每條ASPE引物由5』端的tag序列和3』端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為:針對T6883G位點的SEQ ID N0.11及SEQ ID N0.12，針對A43635G位點的 SEQ IDN0.13 及 SEQ ID N0.14，針對 G1670C 位點的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，針對G25542A 位點的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，和 / 或針對 G1134C 位點的 SEQ ID N0.19及 SEQ ID N0.20 ;所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.10 ； (B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID N0.21~SEQ ID N0.30，且所述ant1-tag序列能相應地與(A)中所選的tag序列互補配對； (C).用於擴增出需要檢測的、具有相應突變位點的目標序列的引物。
2.根據權利要求1所述的BARDl基因突變檢測液相晶片，其特徵是，所述擴增引物為:針對 T6883G 位點的 SEQ ID N0.31 及 SEQ ID N0.32，針對 A43635G 位點的 SEQ ID N0.33 及SEQID N0.34，針對G1670C位點的 SEQ ID N0.35 及 SEQ ID N0.36，針對G25542A位點的 SEQID N0.37 及 SEQ ID N0.38，和 / 或針對 G1134C 位點的 SEQ ID N0.39 及 SEQ ID N0.40。
3.根據權利要求1或2所述的BARDl基因突變檢測液相晶片，其特徵是，所述ASPE引物對為針對T6883G位點的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.11組成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ IDN0.12組成的序列，針對A43635G位點的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.13組成的序列及由SEQ IDN0.4和SEQ ID N0.14組成的序列，針對G1670C位點的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.15組成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.16組成的序列，針對G25542A位點的由SEQ ID N0.7和SEQID N0.17組成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.18組成的序列，和/或針對G1134C位點的由SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.19組成的序列及由SEQID N0.10和SEQ ID N0.2 0組成的序列。
4.根據權利要求1或2所述的BARDl基因突變檢測液相晶片，其特徵在於，所述間隔臂為5 — 10個T。
5.用於BARDl基因突變檢測的特異性引物，其特徵在於，所述特異性引物為針對T6883G 位點的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，針對 A43635G 位點的 SEQ ID N0.13 及 SEQIDN0.14，針對 G1670C 位點的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，針對 G25542A 位點的 SEQ IDN0.17 及 SEQ ID N0.18，和 / 或針對 G1134C 位點的 SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20。
【文檔編號】C40B40/06GK103849940SQ201210512217
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年12月4日 優先權日:2012年12月4日
【發明者】劉麗, 胡文暉 申請人:益善生物技術股份有限公司