一種前列腺癌的標誌物PCDH9及其應用的製作方法

2023-09-10 11:42:35

本發明屬於癌症預後判斷領域，具體涉及pcdh9作為對前列腺癌進行分子分型以及對前列腺癌進行預後判斷的標誌物中的應用，還涉及相應的試劑盒。
背景技術：
：：前列腺癌(prostaticcancer,pca)是一種嚴重威脅男性健康的惡性腫瘤，其發病率及死亡率的高峰在70歲左右，佔全球腫瘤發病率第二位、死亡率第六位。我國pca的發病率近年來一直處於顯著的上升趨勢。在北京、上海、廣州等醫學、經濟發達城市，pca發病率已位於當地十大常見腫瘤之列。流行病學數據顯示，中國pca發病率已從1993年的1.71/10萬男性人口增加到2005年的7.9/10萬男性人口，年增幅約13％。依次推算，預計2020年，我國pca發病率將超過40/10萬人口男性，接近歐美國家水平，成為危害男性健康的主要腫瘤「殺手」。由此可見，隨著我國普遍醫療水平的提高，以及中國正在步入老齡化社會，前列腺癌的防治、研究工作已經進入刻不容緩的階段。由於pca症狀隱蔽，導致國內初診時處於中晚期的患者居多，且高達46.3％的患者已發生局部進展或遠處轉移。前列腺癌患者一旦發生轉移不僅預後差，而且嚴重影響其生活質量。seer(surveillanceepidemiologyandendresults,seer)資料庫2004‐2010年的資料顯示，局限性前列腺癌的5年生存率為100％，而轉移性前列腺癌僅為28％。然而，由於國內前列腺癌研究方面的欠缺，科學、規範地開展前列腺癌的診療工作正面臨著重重挑戰，如前列腺癌的高度異質性。前列腺癌的預後迥異，有些患者術後可以超過10年，有些患者則只有2‐3年，目前雖然臨床上有些指標可以預測腫瘤的惡性程度，如病理評分gleasonscore，但這些指標不能準確的預測患者的預後，相同gleasonscore的患者預後也會存在較大的差異。因此亟需找到預測pca預後的分子分型標誌物。技術實現要素：本發明的目的之一在於提供pcdh9作為對前列腺癌進行分子分型以及對前列腺癌進行預後判斷的標誌物中的應用，通過pcdh9的檢測，提高對前列腺癌進行診斷或預測的準確性和特異性。pcdh9為原鈣粘蛋白家族成員之一，在細胞粘附、神經投射和突觸形成方面起到重要作用。本發明中，作為前列腺癌的標誌物可以是pcdh9的dna、mrna或由其編碼的蛋白質。所述pcdh9dna序列為：https://genome-asia.ucsc.edu/cgi-bin/hgc？hgsid＝471531278_ygpzlwdrai1aa0suyaxbvo6aikmn&g＝htcgetdna2&table＝&i＝mixed&l＝66302833&r＝67230336&getdnapos＝chr13％3a66％2c302％2c834-67％2c230％2c336&db＝hg38&hgseq.cdsexon＝1&hgseq.padding5＝0&hgseq.padding3＝0&hgseq.casing＝upper&boolshad.hgseq.maskrepeats＝0&hgseq.repmasking＝lower&boolshad.hgseq.revcomp＝0&submit＝get+dna；所述pcdh9mrna的核苷酸序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nm_203487.2)如seqidno.1所示；所述pcdh9的蛋白質序列如seqidno.2所示。本發明中，可通過pcdh9dna是否缺失或拷貝數變化，以及pcdh9的mrna或由其編碼的蛋白質的表達水平變化，確定基因的表達水平變化，從而對前列腺癌進行分子分型以及對前列腺癌進行預後判斷。本發明中，與所述pcdh9dna的同源性為80％、85％、90％、95％及99％的序列，也可作為前列腺癌的標誌物。本發明中，與所述pcdh9mrna的同源性為80％、85％、90％、95％及99％的序列，也可作為前列腺癌的標誌物。本發明中，與所述pcdh9蛋白質的同源性為80％、85％、90％、95％及99％的序列，也可作為前列腺癌的標誌物。本發明還提供了pcdh9dna的檢測試劑在製備對前列腺癌進行分子分型的產品中的應用，所述pcdh9dna的檢測試劑可以但不限於是特異性檢測pcdh9dna的核酸探針。通過pcdh9dna是否缺失或拷貝數變化進行定量，來對前列腺癌進行分子分型。本發明還提供了pcdh9mrna的檢測試劑在製備對前列腺癌進行分子分型的產品中的應用，所述pcdh9mrna的檢測試劑可以但不限於是特異性檢測pcdh9mrna的核酸探針。通過對所述基因pcdh9mrna的表達水平進行定量，來對前列腺癌進行分子分型。所述mrna的表達水平可通過以下方法確定：微陣列技術、rna印跡和定量pcr；所述定量pcr為實時定量pcr或多重pcr等。本發明還提供了pcdh9的蛋白質的檢測試劑在製備對前列腺癌進行分子分型的產品中的應用，所述蛋白質的檢測試劑可以但不限於是特異性檢測pcdh9蛋白質的抗體。通過對pcdh9蛋白質的表達水平進行定量，來對前列腺癌進行分子分型。所述pcdh9蛋白質的表達水平可通過以下方法確定：免疫組織化學、蛋白質印跡、elisa、ria和質譜法等。本發明還提供了一種前列腺癌體外診斷產品，所述體外診斷產品包括特異性檢測pcdh9dna的試劑，和/或特異性檢測pcdh9mrna的試劑，和/或特異性檢測pcdh9蛋白質的試劑。所述前列腺癌體外診斷產品可用於對前列腺癌進行分子分型以及對前列腺癌進行預後判斷。所述特異性檢測pcdh9dna的試劑可以但不限於是核酸探針，所述核酸探針能特異性識別所述pcdh9dna；所述特異性檢測pcdh9mrna的試劑可以但不限於是核酸探針，所述核酸探針能特異性識別所述pcdh9mrna；所述特異性檢測pcdh9蛋白質的試劑可以但不限於是抗體，所述抗體特異性識別所述pcdh9的蛋白質。其中，所述前列腺癌體外診斷產品包括試劑盒、基因晶片、固體支持體等。所述固體支持體包括陣列、微陣列、蛋白質陣列等。本發明還提供了pcdh9的dna、mrna或由其編碼的蛋白質在製備抑制前列腺癌細胞增殖、轉移以及侵襲的藥物中的應用。本發明還提供了pcdh9的dna、mrna或由其編碼的蛋白質在製備抑制前列腺癌致癌基因的藥物中的應用；所述前列腺癌致癌基因包括hoxb13、ets1等。本發明還提供了pcdh9的dna、mrna或由其編碼的蛋白質在製備抑制前列腺癌幹細胞標誌物的藥物中的應用；所述前列腺癌幹細胞標誌物為aldh1a1。本發明還提供了pcdh9的dna、mrna或由其編碼的蛋白質在製備促進前列腺癌細胞轉移抑制因子表達的藥物中的應用；所述前列腺癌細胞轉移抑制因子包括foxoa、foxp1等。本發明還提供了pcdh9的dna、mrna或由其編碼的蛋白質在製備促進上皮間質轉化標誌物表達的藥物中的應用；所述上皮間質轉化標誌物為cdh1。本發明還提出了一種對已確診為前列腺癌的患者進行分子分型以及預後判斷的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟：a)檢測前列腺癌病理樣本中pcdh9的dna拷貝數、mrna或由其編碼的蛋白質的表達量；b)通過a)中測定的表達量，將患者分為正常表達組和低表達組，若pcdh9的dna拷貝數相對於正常人群出現缺失或表達量降低，或pcdh9mrna或由其編碼的蛋白質的表達水平出現降低，則為低表達組，預示腫瘤惡化、侵襲性較高，生存預後水平較差，較容易出現生化復發，遠處轉移或疾病進展甚至死亡；否則為正常表達組。本發明的有益效果在於，本發明提出的診斷和預測前列腺癌的新標誌物，即pcdh9基因，該標誌物能對前列腺癌進行分子分型以及對前列腺癌進行預後判斷，具有高特異性和高靈敏度的特點；本發明提出的包含pcdh9標誌物的檢測試劑的前列腺癌體外診斷產品，其使用方便，具有高準確度、高特異性和高靈敏度的特點。附圖說明圖1為pcdh9缺失及其表達水平與前列腺癌惡性程度的關係：染色體13q21.31‐q21.33拷貝數變異顯著差別的區域，定位了pcdh9‐dach1‐klf5‐lect1‐olfm4抑癌基因簇。圖2為65對前列腺癌與癌旁組織樣本測序結果：pcdh9在癌組織中表達顯著低於癌旁組織，在缺失型和野生型pcdh9的前列腺癌組織中均發現了這一現象。圖3為pcdh9缺失前列腺癌組織的pcdh9表達顯著低於野生型前列腺癌組織樣本；a為tcga資料庫；b為talyor2010公開數據。圖4為前列腺癌組織中pcdh9表達量較癌旁正常組織中的表達量明顯下降；a為gse62872公開資料庫；b為tcga公開資料庫。圖5為前列腺癌組織中pcdh9表達量高於轉移性前列腺癌組織的表達量，正常組織中pcdh9mrna的表達量明顯高於腫瘤組織，同時更加高於轉移的前列腺癌組織；a為公開資料庫gse6811；b為公開資料庫gse21032；c為公開資料庫gse35988。圖6為pcdh9表達量在高臨床分期前列腺癌組織中明顯低於低臨床分期前列腺癌組織(glinsky2004公開數據)。圖7為患者pcdh9mrna的表達水平隨著psa水平的不斷升高(4‐10,10‐20，>20)逐漸下降(talyor2010公開數據)。圖8為pcdh9高表達和低表達前列腺癌患者人群生化復發風險的生存曲線；a為glinsky2004公開數據；b為tcga公開數據。圖9為pcdh9拷貝數缺失和正常的前列腺癌患者人群生化復發風險的生存曲線。a為mskcc紀念斯隆凱特琳腫瘤中心數據；b為tcga公開數據。圖10為taylor2010數據中轉移性前列腺癌樣本中的pcdh9拷貝數缺失顯著高於原位前列腺癌樣本。圖11為mskcc紀念斯隆凱特琳腫瘤中心數據pcdh9拷貝數缺失在轉移性前列腺癌患者中與生存期縮短顯著相關。圖12為grasso2010數據中pcdh9拷貝數缺失在轉移性前列腺癌患者中與生存期縮短顯著相關。圖13為體外實驗證實pcdh9作為抑癌基因在前列腺癌中的作用；其中，人為外源性過表達pcdh9後發現腫瘤細胞的增殖能力、遷移和侵襲能力減弱(preceiver為對照質粒，pcdh9為過表達pcdh9質粒)；其中，a，d為增殖能力；b，e為侵襲能力；c，f為遷移能力。圖14為體內實驗證實pcdh9作為抑癌基因在前列腺癌中的作用；其中，a，b為過表達pcdh9的前列腺癌細胞du145‐pcdh9皮下荷瘤裸鼠模型，前列腺癌腫瘤體積和重量與正常對照組相比明顯降低；c為免疫組化(ihc)顯示，在過表達pcdh9的前列腺癌細胞du145‐pcdh9的腫瘤中，pcdh9表達水平顯著上調，且細胞增殖標記物ki‐67表達水平明顯降低。圖15為基因表達譜晶片數據分析，發現pcdh9表達上調後，前列腺癌致癌基因(如：hoxb13、ets1)、癌症幹細胞標誌物aldh1a1下調，轉移抑制因子(如：foxoa、foxp1)、上皮間質轉化標誌物(cdh1)上調。圖16為實時定量pcr方法檢測pcdh9表達上調後，hoxb13、ets1、foxoa、foxp1、cdh1的表達變化。具體實施方式結合以下具體實施例和附圖，對本發明作進一步的詳細說明。實施本發明的過程、條件、實驗方法等，除以下專門提及的內容之外，均為本領域的普遍知識和公知常識，本發明沒有特別限制內容。實施例1前列腺癌患者前列腺癌組織及周圍正常組織中pcdh9mrna的表達(1.1)前列腺癌組織與周圍正常組織中pcdh9mrna的表達量有顯著差異本發明通過對中國的前列腺癌患者的65對前列腺癌與癌旁組織進行測序發現，位於第13號染色體上的pcdh9出現缺失(如圖1所示)。在同一患者的樣本中，pcdh9mrna表達水平在前列腺癌組織中較正常組織出現明顯下降。即pcdh9mrna在前列腺癌組織中的表達量明顯低於相對應的癌旁正常組織(圖2)。提示pcdh9可能作為前列腺癌相關的抑癌基因從而發揮作用。在pcdh9缺失和pcdh9未發生缺失的野生型前列腺癌組織中，pcdh9表達水平在前列腺癌組織中的表達量也明顯低於相對應的癌旁正常組織(圖2)，pcdh9表達下調可能與前列腺癌發生發展相關。(1.2)患者前列腺癌組織中pcdh9mrna的表達量下降與pcdh9基因缺失密切相關如上所述，pcdh9mrna的表達量與患者生存預後有顯著相關性，患者pcdh9mrna的表達量與多種因素相關，其中染色體缺失是造成pcdh9mrna的表達量下降的可能因素之一。通過本發明的研究發現，pcdh9mrna的表達量下降與患者前列腺癌中pcdh9基因缺失密切相關(圖1，圖2)。(1.3)pcdh9表達水平下調與前列腺癌發生轉移相關本發明通過研究幾組獨立的臨床數據(如tcga2015年的數據(圖3a)，taylor2010年(圖3b)中pcdh9mrna的表達量發現，pcdh9在出現缺失的樣本中，其表達量明顯出現下降；同時對gse62872(圖4a)和tcga(圖4b)的數據研究發現，前列腺癌組織中pcdh9mrna的表達量較癌旁正常組織中的表達量明顯下降。進一步地，本發明對gse6811(圖5a)，gse21032(圖5b)以及gse35988(圖5c)的數據進行分析，前列腺癌患者的正常組織中pcdh9mrna的表達量明顯高於腫瘤組織(pgse21032＝4.35×10-10，pgse35988＝1.18×10-9)，同時更加高於轉移的前列腺癌組織(pgse6811＝0.0087，pgse21032＝2.05×10-8，pgse35988＝3.65×10-9)；提示pcdh9mrna的表達量與前列腺癌的惡性程度密切相關，隨著前列腺癌的惡性程度升高，pcdh9mrna的表達量逐漸下降。(1.4)pcdh9下調與高psa含量和高級別臨床分期有關本發明對不同級別前列腺癌腫瘤組織中pcdh9mrna的表達量差異進行分析，發現與t1期相比，t2期前列腺癌腫瘤組織中pcdh9mrna的表達量降低(ginsky，2004，圖6)，表明pcdh9mrna的表達量下調與前列腺癌的高級別臨床分期相關。前列腺特異性抗原(prostatespecificantigen,psa)是一種傳統的前列腺癌診斷標誌物，與前列腺癌的惡性程度密切相關，通過對taylor2010的數據進行分析發現(圖7)，隨著患者psa水平的不斷升高(4-10，10-20，>20)，患者pcdh9mrna的表達水平逐漸下降，表明pcdh9mrna的表達水平下調與高psa水平相關。(1.5)pcdh9mrna的表達量下降與發生生化復發的時間相關本發明通過生物信息學的方法，分析前列腺癌患者腫瘤組織中pcdh9mrna的表達量，發現pcdh9mrna的高表達和低表達組之間患者的預後有顯著差異。本發明以前列腺癌患者預後研究中常用的患者生化復發作為衡量患者預後的標準(即前列腺癌根治術後連續兩次血psa水平>0.2ng/ml)。本發明通過分析發現，pcdh9mrna的表達量下降的患者發生生化復發的時間明顯縮短(生化復發的時間是指從前列腺癌根治術到發生生化復發之間的時間，時間明顯縮短，提示這類患者預後較差)(圖8a，b)。(1.6)pcdh9基因缺失與前列腺癌患者根治術後生化復發相關如上所述，pcdh9mrna的表達量與患者生存預後有顯著相關性，而pcdh9mrna的表達量與其dna缺失有密切關係，為此，本發明進一步探索了pcdh9基因的dna缺失與患者預後之間的關係。本發明通過進一步研究分析發現，pcdh9出現dna缺失的患者，其生化復發的速度要明顯快於dna拷貝數正常的患者(圖9a，b)，即pcdh9出現dna缺失的患者，生化復發時間明顯縮短。(1.7)轉移性前列腺癌中pcdh9基因缺失頻率與西方人群相比，中國的前列腺癌患者在初診時出現轉移的患者比例明顯較高。轉移性前列腺癌患者的預後判斷也是臨床的難點之一，本發明通過對數據分析發現，在轉移性前列腺癌患者中，pcdh9基因缺失頻率顯著高於非轉移性前列腺癌患者(圖10)。進一步地，本發明分析了轉移性前列腺患者樣本中pcdh9dna的表達量，發現在轉移性前列腺癌患者當中(圖11和圖12a，b)，pcdh9出現dna缺失的患者其總體生存預後(overallsurvival)要明顯較未出現dna缺失的患者差。綜上所述，本發明的研究均提示，pcdh9在前列腺癌的發生發展過程中起到抑癌基因的作用，pcdh9基因缺失以及pcdh9mrna的表達量下降在對前列腺癌進行預後判斷方面具有重要價值。實施例2pcdh9在前列腺癌惡性進展過程中的作用(2.1)pcdh9與前列腺癌細胞的增殖、遷移及侵襲性的相關性既往並無pcdh9與前列腺癌惡性進展相關的研究報導。在本發明的前述內容中，發明人發現pcdh9mrna的表達量以及是否出現dna缺失與患者預後密切相關。而無限增殖以及侵襲轉移是腫瘤的重要特徵，本發明對pcdh9與前列腺癌細胞的增殖、轉移侵襲性的相關性進行了研究。本發明通過慢病毒感染的方式，在前列腺癌細胞系du145中過表達pcdh9基因，通過cck8實驗檢測了細胞增殖能力的變化(圖13a，d)，通過transwell實驗檢測了細胞侵襲(圖13b，e)和遷移能力的變化(圖13c，f)，發現在過表達pcdh9基因後，細胞的增殖能力出現下降，細胞的侵襲和遷移能力也出現下降。(2.2)裸鼠荷瘤實驗向裸鼠皮下注射過表達pcdh9的du145前列腺癌細胞(實驗組，du145‐pcdh9)和陰性對照組(du145‐preceiver，其中preceiver是空載體)，待細胞生長至對數增長期，即狀態最佳時，將1×106個實驗組和陰性對照組的細胞，分別按照1：1的體積比與基質膠混合(bd公司)。每兩天對裸鼠的腫瘤大小進行測量。結果表明，植入過表達pcdh9的前列腺癌細胞du145-pcdh9的裸鼠，前列腺癌腫瘤體積和重量明顯降低(圖14a，b)。免疫組化(ihc)分析顯示，在植入過表達pcdh9的前列腺癌細胞du145-pcdh9的腫瘤中，pcdh9表達量顯著上調，說明體內實驗模型成功構建，pcdh9得到了外源性地表達增多，並且細胞增殖標記物ki-67表達量明顯降低(圖14c)。以上研究均表明，pcdh9的過表達可以降低前列腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力。(2.3)基因組表達測定本發明對du145-pcdh9與du145-preciever兩組細胞進行基因組表達測定。本發明通過基因表達譜晶片測定的方式，發現pcdh9過度表達後，前列腺癌致癌基因(如hoxb13、ets1)、癌症幹細胞標誌物aldh1a1下調，轉移抑制因子(如foxoa、foxp1)、上皮間質轉化標誌物(cdh1)上調(圖15)。進一步地，本發明通過實時定量pcr的檢測方式，進一步驗證了相關基因的表達變化，也得到了類似的結果，如圖16所示。綜上所述，pcdh9在前列腺癌中通過抑制癌症發生通路，增強癌症抑制通路來發揮抑癌基因作用。上海長海醫院一種前列腺癌標誌物pcdh9及其應用2patentinversion3.316234pcdh9mrna人工序列11agttcagagagaggagagggagaaggagagaggggcagaggggaagggagagagggagag61cacgcgagacggaaaggagcgcctcagagtctctgaagcacgcaagagataaccgattag121gaatttttcgggcaactgtcacccggatagctgtcagagaatcatcatcaccgcaactct181gacgtttcctacaagaagttagagacttaagcagtattggcatcggatggaaatggtatg241catgctgctgtggaaaatatccctgagctgaagaagtgcaactatgtgttgtgtgtgcta301aatgcccagaagaacccagacccagtgggtaagagagacgaaatgtggagagaatgacta361acgacaaatccgtgaatttgttctctggagttgctaatttgccagcccgaagcaacacat421tttacaaggaggaaacattttgctgcttctgatttctccccaaactggtgctaccagatg481catggctttctatgtgttggaacaaatcattcctaactgcagcatactgggaaaggggaa541aggttgaggcaactaaccggctgtctccaaataagtgatgagatataatgcatcctccag601tccatgcacgcttcctcttgcaatttgtgcatcattcctcagtggaaacctttaaaccct661aaaatccaggaaaagaaaataaatacattatcatggacctgagggatttttacctgttgg721ctgctctgattgcctgtttaaggctggattccgcaatagctcaagaacttatttacacta781ttagagaggaattgcctgaaaatgtgcccataggaaacataccaaaggatctgaacattt841ctcacatcaatgctgccacagggaccagcgccagccttgtctacagactggtttctaaag901ctggggatgcccctttggtgaaagtttccagcagcactggggaaattttcacaacctcca961acagaatagacagagaaaaactctgtgctggcgcctcatatgctgaggagaatgagtgtt1021tctttgaacttgaggtggtgatcctccccaatgatttcttcaggctgatcaaaataaaaa1081taattgtcaaggataccaatgataatgcccccatgtttccatctcctgtcatcaatattt1141ccattccagaaaacactttgatcaacagccgctttccaattccatcagcaacagatcctg1201acacaggcttcaatggtgtacagcattatgaattgttaaatgggcagagtgtttttggac1261tggatatcgtggaaactccagagggagagaagtggccacaactgattgttcagcaaaact1321tggatagagaacagaaagatacctatgtgatgaaaatcaaagtagaggatggaggcactc1381cacagaaatccagtacggccatactgcaggtcacagtaagtgatgtaaatgacaacaggc1441cagtgtttaaagagggtcaagtggaggtgcatattccagagaatgctcccgtaggtacct1501ctgtaattcagctccatgccactgatgcagatataggcagtaatgctgaaatccggtaca1561tttttggtgcccaggtcgcccctgcaaccaaaagactctttgctttaaataatactactg1621ggctgattacagttcagaggtccttagatagagaggagacagccattcacaaagtgacag1681tgctggctagtgacggcagctccactcctgctcgagcaacggttaccatcaatgtcaccg1741atgtaaatgataaccctcctaatatagacctcaggtacattataagtcccatcaatggca1801ccgtgtatttatctgagaaagatcctgtcaatacaaagattgccctaattacagtttcag1861ataaggacacagatgtgaatggcaaagtgatctgttttattgaaagagaggtcccatttc1921atttgaaggcggtatatgacaaccaatatttgttagagacctcttctttgttggactatg1981agggcaccaaagaattcagctttaaaattgttgcctctgattctgggaagcccagtttaa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