一種基於CDKN1A基因鑑定奶牛產奶性狀的方法及其應用與流程

2023-09-10 11:42:40

本發明涉及一種基於cdkn1a基因鑑定奶牛產奶性狀的方法及其應用，屬於生物
技術領域：
。
背景技術：
：細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1a(cyclin-dependentkinaseinhibitor1a，cdkn1a)基因編碼p21(或稱waf1)蛋白，該蛋白是一種高效而重要的細胞周期調控蛋白，是cki家族的重要成員。它廣泛參與細胞的生長、分化、衰老及死亡過程，同時又與腫瘤發生密切相關。cdkn1a最早是作為一種能被p53轉錄激活的基因在1993年由deiry等人發現的，在人類上定位於染色體6p21.2，dna長度為85kb，包括3個長度分別為68、450、1600bp的外顯子，編碼一種分子量為21kda的蛋白，因此命名為p21(giacciaandkastan,1998)。該基因上遊2.4kb和8kb處各有一個p53蛋白特殊序列結合位點，因此能夠被p53轉錄激活，並參與了p53的腫瘤抑制功能，因此p21的表達也能夠抑制人腦、肺、和結腸腫瘤細胞的生長(giacciaandkastan,1998；vogelsteinandkinzler,1992)。此外，cdkn1a基因上遊1-2kb處還有肌源性轉錄因子結合區，在上遊50～104bp處有sp1結合區。cdkn1a基因的表達產物p21蛋白是目前已知的具有最廣泛激酶抑制活性的細胞周期抑制蛋白，是cki(cyclin-dependentkinaseinhibitor，細胞周期依賴性激酶抑制因子)家族的重要成員。p21可通過其氨基末端與幾乎任何cyclin-cdk複合物結合，廣泛的抑制各種cyclin-cdk複合物使之活性喪失，如cyclind-cdk4/cdk6、cycline-cdk2和cyclina-cdk2，但對cyclinb相關的複合物抑制活性相對較弱。radhakrishnan等(2004)發現，p21可通過抑制cyclind1-cdk4與cycline-cdk2的活性，使視網膜母細胞瘤蛋白(prb蛋白)不能發生磷酸化，e2f轉錄因子因此不能釋放，從而使細胞周期停滯在g1期，證明了p21的過表達可使細胞周期阻滯於g1期、g2期或s期。同時也有研究表明，p21可作為cdk聚集因子正性調節cdk功能，使相關功能基因磷酸化，促進細胞g1期轉化到s期(張春林，2002)。pcna(增殖細胞核抗原)是miyachi等於1978年在系統性紅斑狼瘡患者的血清中發現並提純的一種自身抗原，是dna多聚酶δ和ε的輔助蛋白(kelmanetal.,1995)，dna合成所必不可少的因子。由於p21的不同功能域對應不同的靶位，p21可通過c端與pcna結合，從而覆蓋pcna的某些功能域，使pcna不能與dna聚合酶δ形成複合物，從而阻斷pcna活化dna聚合酶的活性，或使dna全酶複合物不能在dna單鏈上滑動，最終影響dna複製使細胞周期停滯。對於cdkn1a的其他生物學功能研究有，p21與細胞凋亡的關係十分密切，但其對細胞凋亡的影響機制目前尚未完全明確，各國研究者的觀點主要分成了兩派，即p21是阻止還是促進細胞凋亡的發生。一方面，p21可能通過以下途徑對抗或阻止細胞凋亡的發生：1)p21通過促使細胞周期阻滯，阻止dna損傷或促使其修復，從而保護細胞免受凋亡(rajetal.,2001)；2)在複製抑制因子介導的dna複製叉損傷的過程中，p21可與細胞周期檢查點激酶1共同作用而阻止dna損傷介導的凋亡(rodriguezandmeuth,2006)；3)cyclina-cdk2複合物的活性上調可能促使缺氧誘導的心肌細胞凋亡，而p21則可以通過與cyclina-cdk2複合物結合使其失活，從而阻止凋亡的發生(adachietal.,2001)。另一方面，也有報導指出，p21可能在某些條件下具有促進細胞凋亡的作用，如：1)古麴黴素a通過下調p21水平來誘導破骨細胞凋亡(yietal.,2007)；2)p21的表達上調可競爭性抑制凋亡抑制基因bcl-2的表達，從而誘導足細胞凋亡的發生(marshallandshankland,2006)；3)在死亡受體腫瘤壞死因子家族成員誘導的凋亡過程中，p21可能起到正向促進的作用(hingoranietal.,2000；lashingeretal.,2005)；4)在細胞凋亡過程中p21的表達還可能與凋亡前體蛋白bax有密切的關係，p21表達升高的同時往往伴隨bax水平的上升，細胞凋亡數也相應增加(baiandcederbaum,2006；danieletal.,2001)。因此，p21在不同的條件下既有可能抑制細胞凋亡的發生，也有可能促進其發生，具體的機制尚未明確，還有待研究。牛的cdkn1a基因位於第23號染色體上，全長17.03kb，包含6個外顯子和5個內含子。其mrna長2352bp，共編碼161個胺基酸，mrna序列與人的同源性為78％，胺基酸序列與人的同源性為80％。聚合酶鏈式反應(pcr)技術是一種特異性dna體外擴增技術。以少量的dna為模板，經過變性-退火-延伸的多次循環，以接近指數擴增的形式產生大量的目標dna分子，目前，該技術已經成為最常用、也最重要的分子生物學技術之一。pcr產物經過瓊脂糖凝膠電泳後測序即可進行基因多態的鑑定工作，檢測方法簡單易行。技術實現要素：本發明的一個目的是提供檢測牛基因組23號染色體上第10565335位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質的新用途。本發明提供了檢測牛基因組23號染色體上第10565335位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質在鑑定或輔助鑑定牛個體產奶性狀中的應用。本發明還提供了檢測牛基因組23號染色體上第10565335位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質在製備鑑定或輔助鑑定牛個體產奶性狀的產品中的應用。上述應用中，所述產奶性狀為305天產奶量和/或乳脂量和/或乳脂率和/或乳蛋白量。本發明還提供了檢測牛基因組23號染色體上第10565335位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質在牛育種中的應用。本發明還提供了檢測牛基因組23號染色體上第10565335位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質在製備牛育種的產品中的應用。本發明還提供了檢測牛基因組23號染色體上第10565335位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質在選育305天產奶量高和/或乳脂量高和/或乳脂率和/或乳蛋白量高的牛中的應用。本發明還提供了檢測牛基因組23號染色體上第10565335位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質在製備選育305天產奶量高和/或乳脂量高和/或乳脂率高和/或乳蛋白量高的牛的產品中的應用。上述應用中，所述檢測牛基因組23號染色體上第10565335位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質為如下1)或2)：1)由序列表中序列1所示的單鏈dna分子和序列表中序列2所示的單鏈dna分子組成的引物對a；2)由序列a所示的單鏈dna分子和序列b所示的單鏈dna分子組成的引物對b；所述序列a為將序列1刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列1具有相同功能的核苷酸；所述序列b為將序列2刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列2具有相同功能的核苷酸。本發明的另一個目的是提供一種鑑定或輔助鑑定牛產奶性狀的方法。本發明提供的鑑定或輔助鑑定牛產奶性狀的方法是檢測牛個體的基因型是tt基因型還是cc基因型還是ct基因型，根據所述牛個體的基因型確定所述牛個體在第一泌乳期和第二泌乳期的305天產奶量和/或乳脂量和/或乳脂率和/或乳蛋白量：tt基因型的牛個體在第一泌乳期的305天產奶量高於cc基因型的牛個體，cc基因型的牛個體在第一泌乳期的305天產奶量高於ct基因型的牛個體；ct基因型的牛個體在第一泌乳期的乳脂率高於cc基因型的牛個體，cc基因型的牛個體在第一泌乳期的乳脂率高於tt基因型的牛個體；tt基因型的牛個體在第二泌乳期的305天產奶量、乳脂量和乳蛋白量高於ct基因型的牛個體，ct基因型的牛個體在第二泌乳期的305天產奶量、乳脂量和乳蛋白量高於cc基因型的牛個體；所述tt基因型為牛基因組23號染色體上第10565335個核苷酸位點的鹼基均為t的純合體；所述cc基因型為牛基因組23號染色體上第10565335個核苷酸位點的鹼基均為c的純合體；所述ct基因型為牛基因組23號染色體上第10565335個核苷酸位點的鹼基為c和t的雜合體。上述方法中，所述檢測牛個體的基因型是tt基因型還是cc基因型還是ct基因型的方法為如下a)或b)：a)直接測序；b)測序含有牛基因組23號染色體上第10565335個核苷酸的pcr擴增產物。上述方法中，所述pcr擴增產物所用的引物為如下1)或2)：1)由序列表中序列1所示的單鏈dna分子和序列表中序列2所示的單鏈dna分子組成的引物對a；2)由序列a所示的單鏈dna分子和序列b所示的單鏈dna分子組成的引物對b；所述序列a為將序列1刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列1具有相同功能的核苷酸；所述序列b為將序列2刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列2具有相同功能的核苷酸。本發明還有一個目的是提供一種鑑定或輔助鑑定牛產奶性狀的產品。本發明提供的鑑定或輔助鑑定牛產奶性狀的產品為檢測牛基因組23號染色體上第10565335位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質。上述產品中，所述檢測牛基因組23號染色體上第10565335位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質為如下1)-4)：1)由序列表中序列1所示的單鏈dna分子和序列表中序列2所示的單鏈dna分子組成的引物對a；2)由序列a所示的單鏈dna分子和序列b所示的單鏈dna分子組成的引物對b；所述序列a為將序列1刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列1具有相同功能的核苷酸；所述序列b為將序列2刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列2具有相同功能的核苷酸；3)含有1)所述引物對a和/或2)所述引物對b的pcr試劑；4)含有1)所述引物對a和/或2)所述引物對b和/或3)所述pcr試劑的試劑盒。上述應用或方法或產品中，所述牛為奶牛；所述305天產奶量為從產犢到第305個泌乳日的總產奶量；所述乳脂量為乳中所含脂肪的重量，它等於乳脂率與產奶量的乘積；所述乳脂率為乳中所含脂肪的百分率；所述乳蛋白量為乳中所含蛋白的重量，它等於乳蛋白率與產奶量的乘積；所述第一泌乳期為母牛第一次產犢後產奶的時期，一般泌乳期是305天；所述第二泌乳期為母牛第二次產犢後產奶的時期，一般泌乳期是305天。上述應用或方法或產品中，所述牛基因組序列為牛基因組bos_taurus_umd3.1.1/bostau8版本參考序列。本發明提供了一種基於cdkn1a基因鑑定奶牛產奶性狀的方法及其應用。通過試驗證明：c.271c>t分子標記在第一泌乳期與305天產奶量(p＝0.0162)和乳脂率(p＝0.0377)達到顯著水平的關聯；在第二泌乳期與305天產奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率達到極顯著水平的關聯(p＜0.01)。本發明的鑑定奶牛產奶性狀方法簡便、快速、靈敏，結果可靠、穩定、準確，並可用於輔助鑑定具有優良產奶性狀的牛群體，適合實驗室大群體規模檢測的需要。不僅可對待選牛進行早期篩選，而且降低了育種花費，能有效提高實際生產中的牛的產奶量，在牛的育種工作中將發揮巨大作用。附圖說明圖1為c.271c>t的突變位置。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。下述實施例中的中國荷斯坦公牛管制凍精樣品和女兒群體的母牛血樣分別來源於北京三元綠荷奶牛養殖中心和北京市畜牧獸醫總站。下述實施例中的305天產奶量：從產犢到第305個泌乳日的總產奶量。下述實施例中的乳脂率：乳中所含的脂肪的百分率。下述實施例中的乳脂量：乳中所含脂肪的重量，它等於乳脂率與產奶量的乘積。下述實施例中的乳蛋白率：乳中所含的蛋白的百分率。下述實施例中的乳蛋白量：乳中所含蛋白的重量，它等於乳蛋白率與產奶量的乘積。下述實施例中的第一泌乳期：母牛第一次產犢後產奶的時期，一般泌乳期是305天。下述實施例中的第二泌乳期：母牛第二次產犢後產奶的時期，一般泌乳期是305天。實施例1、奶牛產奶性狀相關的分子標記及鑑定奶牛產奶性狀的方法一、奶牛cdkn1a基因多態位點的確定1、dna池的製備選擇北京地區共40頭中國荷斯坦公牛作為基因多態性檢測的試驗群體，將40頭中國荷斯坦公牛隨機均分為兩組，利用核酸分析儀準確測定其凍精基因組dna的濃度，並將這些dna均稀釋成濃度為50ng/μl，等量混合成兩個dna池，作為pcr擴增的模板。2、引物的設計根據牛cdkn1a基因序列(位於genbank登錄號為ac_000180.1的序列中，更新日為2014年12月31日)，設計如表1的13對引物。表1cdkn1a基因pcr擴增引物序列信息3、pcr擴增以步驟1得到的dna池為模板，分別採用表1中的各組引物進行pcr擴增，得到pcr擴增產物。表1中引物8f和8r採用降落pcr方法(touchdownpcr)，其餘引物採用了常規pcr的方法。降落pcr的原理大致如下：首先在較高的溫度下擴增，此時雖然擴增效率低，但非特異擴增基本沒有；隨著反應循環數的增加，退火溫度的逐步降低，非特異擴增也會逐步增多；但由於此時特異的擴增產物已經達到一定的數量優勢，因此會對非特異擴增產生強烈的競爭抑制，從而大幅提高pcr的特異性和效率。表1中部分引物的退火溫度表示為「a-btouchdown」(a>b)的形式即為降落pcr中所用的退火溫度範圍，表示在反應過程中退火溫度逐步由a℃降落到b℃。pcr反應體系如表2所示(表2中的正向引物f和反向引物r分別表示1f和1r、2f和2r等)。常規pcr和降落pcr反應條件如表3所示。表2、pcr反應體系表3、pcr反應條件4、pcr擴增產物的測序及序列分析將pcr擴增產物進行測序，結果發現公牛群體cdkn1a基因第5外顯子處存在1個snp標記c.271c>t，如表4所示，突變位置如圖1所示。c.271c>t是以牛的基因組dna為模板，以6f和6r為引物進行pcr擴增得到的產物(產物的核苷酸序列如序列3所示)自5』末端起第56位(也即為牛基因組bos_taurus_umd3.1.1/bostau8版本參考序列23號染色體上第10565335個核苷酸位點的鹼基)。將牛基因組23號染色體上第10565335個核苷酸位點的鹼基均為c的個體的基因型命名為純合cc基因型，將牛基因組23號染色體上第10565335個核苷酸位點的鹼基均為t的個體的基因型命名為純合tt基因型，將牛基因組23號染色體上第10565335個核苷酸位點的鹼基為c和t的個體的基因型命名為雜合ct基因型。表4、cdkn1a基因發現的snps基因位置snps物理位置突變突變類型外顯子5c.271c>tchr23:10565335bpc/tsnp二、奶牛cdkn1a基因多態位點與產奶性狀的相關性分析1、基因型檢測根據步驟1中獲得的cdkn1a基因的snp，採用6f和6r引物對40頭荷斯坦公牛家系共1093頭女兒群體進行群體基因型分型。具體步驟如下：提取女兒群體的母牛血樣(為非抗凝血)的基因組dna，基因組樣品交由博淼生物科技(北京)有限公司使用「用基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜法」，即maldi-tof-ms檢測技術對步驟一獲得的snp位點的基因型進行檢測。基因型檢測結果如表5所示。2、產奶性狀檢測分別檢測上述1093頭試驗母牛的305天產奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率5個產奶性狀。每個個體的測定日的記錄依次包括牛隻個體號、父號、母號、外祖父號、出生日期、泌乳期、產犢日期、測定日期、測定日產奶量、測定日乳脂率、測定日乳蛋白率、測定日體細胞數、估計的305天產奶量、估計的305天乳脂量和305天乳蛋白量15項信息。3、單個snp位點與性狀的關聯分析模型採用sas9.13軟體中的mixed過程對奶牛305天產奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率等5個產奶性狀和基因型進行關聯分析。關聯分析採用動物模型，具體模型如下：y＝μ+hys+b×m+g+a+e。其中，y：產奶性狀(個體305天產奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量或乳蛋白率)觀察值，μ：總體均值，hys：場年季效應，b：協變量m的回歸係數，m：產犢月齡效應，g：基因型效應，a：個體隨機加性遺傳效應，e：隨機殘差效應。關聯分析方法參見文獻「東天，基於gwas後分析策略研究eef1d基因與奶牛產奶性狀遺傳效應[d].北京：中國農業大學，2013.」。5個產奶性狀和基因型關聯分析結果如表5所示。從表5中可以看出：在第一泌乳期時，c.271c>t與305天產奶量(p＝0162)和乳脂率(p＝0.0377)達到顯著關聯水平，優勢等位基因為t。tt基因型的牛個體的305天產奶量高於cc基因型的牛個體，cc基因型的牛個體的305天產奶量高於ct基因型的牛個體；ct基因型的牛個體的乳脂率高於cc基因型的牛個體，cc基因型的牛個體的乳脂率高於tt基因型的牛個體。在第二泌乳期時，c.271c>t與305天產奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率達到極顯著關聯水平(p＜0.0001)，優勢等位基因為t。tt基因型的牛個體的305天產奶量、乳脂量和乳蛋白量高於ct基因型的牛個體，ct基因型的牛個體的305天產奶量、乳脂量和乳蛋白量高於cc基因型的牛個體。表5cdkn1a基因與產奶性狀關聯分析(最小二乘均值±標準誤)註：*p<0.05，表示差異顯著；**p<0.01，表示差異極顯著。a,b同一列數據有不同上標表示差異顯著；a,b同一列數據有不同上標表示差異極顯著。序列表中國農業大學一種基於cdkn1a基因鑑定奶牛產奶性狀的方法及其應用3120bpdna人工序列1ggcctgcccaagctctacct20220bpdna人工序列2tcctcctctgctcccgtcct203286bpdna人工序列3ggcctgcccaagctctaccttcctcctctgctcccgtcctggcctgcccaagctctacct60gcccgtggggccccgagacgacctgggagggggcaagcggccgagcccctcatccgccct120gctgcagggcacgtctcaggaggaccacttggacctgtcgctgtcctgcaccctcgtgac180tcgctcccccgagcggcccgaggggacccccggtgggcctggcccctcccagggccggaa240acggcggcagaccagcatgacaggtgaggacgggagcagaggagga286當前第1頁12