用於狼瘡腎炎的治療性隨訪中的預測、診斷和監測的體外方法與流程

2023-09-11 02:25:05

本發明涉及在患有狼瘡腎炎的患者中的腎中毒抗體的表徵。關於這樣的疾病分類學演變，提出了用於預測、診斷受全身性紅斑狼瘡影響或潛在影響的受試者體內狼瘡腎炎的體外方法、用於監測針對受全身性紅斑狼瘡影響或潛在影響的受試者體內狼瘡腎炎的治療的體外方法以及用於預測狼瘡腎炎的進展和/或用於監測針對患有或潛在含有紅斑狼瘡的受試者體內狼瘡腎炎的治療的試劑盒。

現有技術狀態

狼瘡腎炎(LN)是以腎結構和腎功能發生改變為特徵的臨床病理病症，其可以影響患有全身性紅斑狼瘡(SLE)的受試者。特別地，受SLE影響的患者的相關百分比發展這樣的病症，其如果沒有被及時識別和治療，則可以導致腎功能不全和死亡。相反，狼瘡腎炎的快速診斷，以及如果可能對其的預測開啟了有效和潛在解決如果在疾病開始時使用的藥物的使用。

不同的科學證據顯示LN受腎小球中的抗體的沉積介導。

在由科學家提出的關於LN的發展的理論之中，盛行的一種提議，抗-dsDNA循環抗體(雙鏈DNA)或對抗DNA的蛋白質組分(如組蛋白)的抗體，通過形成上皮下層免疫沉積和繫膜免疫沉積而可以與腎小球成分交叉反應。特別地，認為由於其正電荷所致，當染色質和組蛋白的組合連接至腎小球基底膜的陰性加載組分，特別是硫酸肝素和蛋白聚糖時，通過變為針對其它面對腎小球的蛋白結構(足細胞和基底膜)的抗體的靶抗原，染色質和組蛋白有助於充當針對其它不面對DNA的抗體的沉積的觸發劑。

當今這種理論沒有澄清導致患有SLE的受試者體內免疫沉積的形成和腎損傷的繼發出現的機制。特別地，尚不清楚哪一個是觸發抗體(即，抗-DNA)的一般作用並且它們是否充當觸發劑或參與抗體沉積機制。更一般地，高水平絲狀抗Dna抗體存在於幾乎所有的患有SLE的患者中但僅其一部分發展腎病的事實表明，伴隨且可能是主要的因素在決定腎損傷中具有核心作用。由於LN以沉積在自身抗體的腎小球中為特徵，所以可以假定與抗-腎臟抗體的形成相關且更精確地指向腎小球的細胞組分如足細胞的機制。明顯的是，有必要直接在病變位置(即在腎小球)驗證自身抗體的組成，並且僅在已對此項目澄清之後，才可以進行鑑別早期疾病標記。用於狼瘡腎炎的有效標記的缺乏轉化為臨床醫師不可能早期鑑別將發展LN的患者並採取最適合的治療方式。如今診斷仍然基於非特異性循環抗體(ANA,抗DNA,抗C1q)的評價，這些非特異性循環抗體可能涉及疾病發病機制，但是事實上當循環時，它們對於腎不具有特異性並且僅一般性地與腎病變的發展相關。

對於鑑別人中的狼瘡腎炎的特異性標記和開發允許可能在受全身性紅斑狼瘡影響的受試者體內的狼瘡腎炎的早期診斷的非侵入性診斷/預兆儀器的需要由科學界共享，以便定義合適且及時的治療策略。其在治療隨訪中的使用將對臨床醫師在試圖調節通常是長時間且提供涉及具有高毒性的藥物的若干治療聯合中提供幫助。

技術實現要素：

本發明涉及基於確定能夠預測、診斷和監測在受全身性紅斑狼瘡(SLE)影響的受試者中的治療隨訪中的狼瘡腎炎(LN)的循環抗體的體外方法，並且本發明提供了對抗代表狼瘡腎炎中的抗體損傷的靶標的內源性或植入的腎抗原的特異性抗體的用途。導致該發現的檢索開始目的是表徵存在於腎臟中的靶抗原、炎性病變(即腎小球腎炎)的位置。基於腎臟研究的結果，其導致鑑別對抗內源性和植入其中的蛋白質的特異性自身抗體，然後達到確定血清中的相同抗體以及顯示高循環水平與LN的存在相關。通過使用藉助於體內器官活檢直接獲得的腎組織，這樣的研究首次在人上實現。然後由其得出的結論基於這樣的研究，其首次在人腎組織上實現並且通過開發蛋白質組學研究技術(雷射捕獲，質譜儀，雙向電泳等)而成為可能。

本發明基於這樣的發現，即受全身性紅斑狼瘡影響的受試者，並且其中觀察到典型狼瘡腎炎的腎結構和功能發生變化，具有比IgG2同種型的一些自身抗體更高的腎臟和循環水平，具有作為抗原性靶標的由腎臟表達的內源性蛋白質如α-烯醇酶、膜聯蛋白AI和/或本文中植入的蛋白質如DNA以及若干類別的組蛋白(組蛋白2a,3,4)的抗體。本發明的發明人首次對在腎小球中存在對抗上述蛋白質(即α-烯醇酶、膜聯蛋白AI和若干類別的組蛋白)的IgG2類別的抗體進行了證實，其代表本文描述的發明的基礎。腎毒性(上述所有的抗-α烯醇酶)抗體的新靶標蛋白質的鑑別和對於狼瘡腎炎的抗體的特異性IgG2同種型的表徵允許對於涉及腎臟損傷的機制和對於直接評價作為疾病標記的這樣的特異性抗體的腎臟和循環的可能性二者的進展。事實上，在本文中，證實了相對於由不具有狼瘡腎炎的患者形成的對照，受狼瘡腎炎影響的患者具有高濃度的抗-α烯醇酶和抗-膜聯蛋白AI、抗-類別2a、3和4組蛋白的IgG2。主要的IgG2同種型的新穎性在本文報導，甚至是對於對抗DNA的抗體。然後，很重要注意到，存在涉及LN的自身抗體的多種組成，但是在本文中證實了這樣的混雜性是極大選擇性的並且作為靶標它僅具有一些內源性腎臟蛋白和/或植入其中的抗原，此外它涉及IgG2同種型的特異方式抗體。如在下文部分「材料與方法」中證實的，關於健康受試者和沒有腎炎的受SLE影響的受試者或受具有來自全身性紅斑狼瘡的不同病因學的腎炎影響的受試二者，證實了在發展或將發展LN的患者體內更高水平的對抗抗-α烯醇酶和抗-膜聯蛋白AI抗原、抗-類別2a、3和4的組蛋白的IgG2。

要注意的是，相對於在腎臟組織中檢測到的一組抗原(即α-烯醇酶、膜聯蛋白AI、組蛋白3和DNA)並且相對於其他風溼性疾病(例如類風溼性關節炎)和正常人，IgG2同種型的抗體在血清中的伴隨存在以高特異性和敏感性(在曲線下方的面積ROC>0.85；P0)獲得的受試者的至少第一生物學樣品中和至少第二生物學樣品中進行。特別地，所考察的受試者可以是服從針對狼瘡腎炎的治療的受試者和及時監測而沒有必需地服從任何類型的治療的受試者。換句話說，則是，在時間t＝0獲得的所述至少第一生物學樣品可以是例如在開始治療本身之前的樣品，並且相反在沒有服從治療的受試者中，在總體時間t＝0處獲得。不同地，第二生物學樣品可以在從所述時間t＝0開始的一個或多個時間間隔處獲得，因此定義為時間t>0，通過單純實例的方式其可以是幾小時、幾天或幾個月的間隔，例如每15天。在每種情況下，取決於受試者類型和病理學的重力，本領域技術人員基於他/她的知識將能夠鑑別用於本文所述監測方法的目的的最合適時間間隔。優選地，第一和第二樣品分別在開始針對LN的治療之前和所述治療期間和/或之後獲得。隨後，在所述第一和所述至少第二樣品中獲得的抗-α烯醇酶IgG2抗體的濃度之間的比較將提供關於患者的病理狀態的進展的信息。

然後所關注抗體例如抗-α烯醇酶IgG2的濃度的變化是允許臨床醫師評價所選治療策略的有效性或不是有效的手段。在一個特別實施方案中，相對於第一樣品，第二樣品中的IgG2抗體的濃度升高指示受全身性紅斑狼瘡影響或潛在影響的受試者體內狼瘡腎炎的進展。

可選地，相對於第一樣品，第二樣品中的IgG2抗體的濃度降低表明受全身性紅斑狼瘡影響或潛在影響的受試者的狼瘡腎炎無進展。

特別地，要監測的治療類型是針對狼瘡腎炎的一般治療。特別地，所述治療可以包括利用血管緊張素轉化酶(ACE)的抑制劑、高劑量可的松、環磷醯胺、環孢黴素和/或生物學療法(利妥昔單抗)的治療。

用於預測和/或診斷狼瘡腎炎和/或用於監測針對狼瘡腎炎的試劑盒。

本發明的主題還是用於在患有或潛在患有紅斑狼瘡的受試者體內預測和/或診斷狼瘡腎炎和/或用於監測針對狼瘡腎炎的試劑盒，包括。

特別地，這樣的試劑盒至包括用於確定所考察受試者的生物學樣品中的對抗選自以下組的抗原中的至少一種的IgG2抗體的一種以上試劑的至少一個等分試樣：α烯醇酶，膜聯蛋白AI，組蛋白2A，組蛋白3和組蛋白4，DNA，還至少包括對抗選自以下組的抗原中的至少一種的IgG2抗體的一種陽性對照的至少一個等分式樣：α烯醇酶，膜聯蛋白AI，組蛋白2A，組蛋白3和組蛋白4，DNA。

在本發明的一個優選實施方案中，需要所述一種以上試劑用於確定抗-α烯醇酶、抗-膜聯蛋白AI、抗-組蛋白2A、抗-組蛋白3和抗-組蛋白4、抗-DNA IgG2抗體的濃度。

優選地，根據本發明的試劑盒可以至少包括能夠識別這樣的抗原的多克隆或單克隆一抗(以用作標準曲線)和任選的抗-人IgG2抗體。所述試劑盒甚至可以包括標記或未標記二抗的一個或多個等分試樣，所述二抗顯然是特異於由此實現標準曲線中使用的一抗的免疫系統。然後，如果一抗在小鼠中實現，則二抗將是抗-小鼠的；如果在兔中實現，則將是抗-兔的；等類似。可選地，所述試劑盒可以包括其上存在劑量主題抗原以允許進行劑量ELISA的板。

所述試劑盒可以另外地包括陰性對照和/或陽性對照。特別地，單純通過實例而不以限制性目的的方式，所述試劑盒可以包括作為陽性對照的具有記載的高血清水平的抗-α烯醇酶和/或膜聯蛋白AI和/或組蛋白2A和/或組蛋白3和/或組蛋白4IgG2的患者(患者可以不同)的血清。作為陽性對照，甚至可以提供所關注蛋白的等分試樣，即α烯醇酶和/或膜聯蛋白AI和/或組蛋白2A和/或組蛋白3和/或組蛋白4和/或DNA。作為陰性對照，例如可以使用具有已知的腎小球腎炎的一組患者的血清，其中所關注的抗體不能進行給藥。在這種情況下，將使用具有膜性腎小球腎炎的患者的陰性血清。此外，所述試劑盒可以包括用於確定抗-α烯醇酶和/或抗-膜聯蛋白AI和/或抗-組蛋白2A和/或抗-組蛋白3和/或抗-組蛋白4和/或DNAIgG2抗體的濃度的過程的合適試劑和工具，如緩衝溶液的等分試樣、無菌水或通常用於檢測例如一抗-二抗複合物的其它試劑。

以下實施例和實驗結果具有指定用於實現本發明但不限制本發明的目的。

在試劑盒以及以上所述方法的優選實施方案中，確定能夠識別選自以下組中的抗原的IgG2類型的抗體的濃度藉助於斑點印跡法或ELISA完成：α烯醇酶，膜聯蛋白AI，組蛋白2A，組蛋白3和組蛋白4，DNA。

斑點印跡法。通過使用Bio-Rad(Hercules,CA,USA)的用於斑點印跡法的設備進行分析並且其基於在劑量下的抗原(α烯醇酶，膜聯蛋白AI，補體C1q，組蛋白H2A，H3和H4)在硝基纖維素膜上的固定化。將用TBS預處理的膜通過斑點印跡法固定至設備，然後裝載恆定量的在TBS中的抗原(100ng)。首先將抗原在接觸下留置24h然後另外地在負壓力(利用真空形成)下連接至硝基纖維素。連接有抗原的膜然後在TBS-T(TBS-5％白蛋白-0.05％gr/v，吐溫20v/v)中飽和。在TBS-T中1:50稀釋的在劑量下的血清在此時施加到孔中並在環境溫度留置溫育6小時，然後在4C過夜；在結束時將膜在TBS-T中洗滌3次。此時通過在環境溫度溫育，利用用辣根過氧化物酶(HPR)標記的在TBS-T中1:2000稀釋的抗-人IgG2抗體(克隆體：HP6014-InVitrogen Corporation,Camarillo,CA)來檢測IgG2的存在。在TBST-T中3次洗滌之後，反應物在化學發光(SuperSignal,West Pico,Chemiluminescent,Thermo scientific,Rockford,USA)中顯影。製備使用具有不同稀釋度的IgG2抗體的標準曲線以評價反應線性度並建立讀出範圍。

用於確定IgG2連接所關注的抗原的ELISA置於具有96孔板的單個孔中(MaxiPrep板，96孔)並在室溫溫育5h然後在4℃過夜。將封閉溶液(在PBS中的5％BSA和0.05％吐溫20)的等分試樣(200μl)添加到每個孔中，然後添加在PBS-T(PBS–吐溫20 0.05％v/v–BSA 1％gr/v)中1:50稀釋的血清(100μl)，將其在室溫溫育4小時然後在4C°過夜。在PBS-T中3次洗滌之後，利用用辣根過氧化物酶(HPR)標記的在TBS-T中1:3000稀釋的抗-人IgG2抗體(克隆體:HP6014-InVitrogen Corporation,Camarillo,CA)。

對過氧化物酶反應的顯影通過添加100μl的底物TMB/H2O2(10:1)並取決於色度反應(Mx 30分鐘)而溫育不同的時間獲得。這樣的色度反應然後通過添加100μl的0.45M的H2SO4的溶液封閉並在30min內讀出。

然後在合適讀出器，多板讀出器iMark(BioRad,Hercules,CA,USA)中在450nm讀數。製備使用在不同稀釋度的IgG2抗體的標準曲線用於評價反應線性度並建立讀出範圍。

材料和方法

患者。總體上，研究了216位患有紅斑狼瘡的患者，103位患有LN並且113位患有LES同時沒有腎病。所有情況用於給藥抗-烯醇酶、抗-膜聯蛋白AI和抗組蛋白IgG2。在免疫抑制治療之後，即在疾病開始後6個月和12個月，研究了患有狼瘡腎炎的相同患者的一部分。對通過來自20位患者的活檢獲得的腎臟樣品進一步研究以定義在腎臟中存在的腎的抗體的組成(表1)。在這種情況情況下，狼瘡腎炎通過由文獻顯示的已知參數定義。關於冷凍腎臟的活檢樣品的實驗部分如在後續會議中報導那樣進行。

正常腎臟/血清。正常腎臟的活檢從由於腫瘤原因的腎切除術獲得。在這種情況下僅使用未受腫瘤組織損害的部分。使用134位正常受試者的血清來使對於各單個抗體的正常水平穩定。

類風溼性關節炎。從患有處於處於活躍期的類風溼性關節炎的50位患者獲得的血清用於在急性風溼病症下的所有抗體給藥。

其它腎病。來自患有與狼瘡無關聯的原發性腎小球腎炎的278位患者的血清如上進行處理：186位是患有膜性腎病的患者，32位患有局灶性節段性腎小球硬化症，60位患有IgA型的腎炎。

倫理委員會。對研究的批准在2010年6月10日通過San Carlo Borromeo Hospital,Milan(I)的倫理委員會獲得。對該研究的知情同意從所有參與者獲得。

細胞培養。永生化人足細胞獲自Saleem博士(University of Bristol,UK)。將細胞保持在補充有10％胎牛血清(FCS)、胰島素轉鐵蛋白、硒、100U/ml青黴素和100mg/ml鏈黴素的RPMI 1640中。

抗體。

α烯醇酶-1：對抗非神經元烯醇酶(NNE)(α-α)的兔抗體，AbD Serotec MorphoSys Ltd.(Endeavour House,Kidlington Oxford,UK)。抗-膜聯蛋白A1：對抗人膜聯蛋白AI的兔抗體，Millipore Corp.(Billerica,MA,USA.)。抗-組蛋白2A、3、4.：對抗組蛋白2A、3、4的兔抗體，Novus(Biologicals,Cambridge,UK)。對抗人C1q的抗-C1q.小鼠抗體，Abcam(Cambridge,UK9)抗-IgG1-IgG2-IgG3-IgG4：對抗人IgG1-4的單克隆抗體(克隆體：HP6070,HP6014,HP6047和HP6023，分別用於IgG1,IgG2,IgG3和IgG4)InVitrogen Corporation,(Camarillo,CA)。

二抗-對抗以親和性色譜法純化並連接至異硫氰酸螢光素(FITC)的兔抗-IgG的親和性純化的異硫氰酸螢光素(FITC)F(ab』)2驢抗體均購自Jackson Immunoresearch(West Grove,PA,USA)。

重組蛋白。α烯醇酶：重組體，Abnova Corporation(臺北,臺灣)；膜聯蛋白A1：重組體，Creative BioMart,(Shirley,NY,USA)；組蛋白：重組體，New England BioLabs inc.(Whitby,Canada)；C1q：純化的蛋白，Calbiochem-Merck KG,(Darmstad,Deutschland)；DNA：純化的質粒，Invitrogen,(Carlsbad,CA,USA)。

雷射捕獲顯微切割術(LCM)和從組織的洗脫抗體。為了從剩餘腎組織顯微切割掉腎小球，使用了適用於冷凍組織的「雷射捕獲」技術。使腎組織的冷凍切片(5μm)適應於塗覆有恆溫膜(Molecular Machines&Industries AG；Glattburg,Zurich,Switzerland)的金屬支撐物並通過使用Arcturus HistoGene系統、LCM冷凍切片染色試劑盒(Arcturus Bioscience,Mountain View,CA)脫水。鑑別腎小球並利用Molecular Machines&Industries Cellcut LMD系統分離，該系統通過使用由雷射源產生的熱選擇性地切開Bowman膠囊。對於每個活檢腎樣品，平均製備25至30個腎小球，然後利用特種粘合劑材料(Nikon Instruments)分離。從分離的腎小球的洗脫出免疫球蛋白是通過使用鹽水滲透梯度完成的。

雙向電泳。雙向電泳在聚丙烯醯胺的軟凝膠中進行。樣品製備在4℃在冰中在磷酸三正丁酯中提供初始去脂質化達90min。在離心和在相同去脂質溶液中洗滌之後，將沒有懸浮的材料離心並在空氣中脫水。在電泳影響之前，將樣品溶解在7M脲、2M硫脲、4％(w/v)3-[3-(膽醯胺丙基)-二甲基銨]-1-丙烷磺酸酯(CHAPS)、5mM三丁基-膦(TBP)、20mM碘乙醯胺(IAA)、40mM Tris、0.1mM乙二胺四乙酸(EDTA)pH 8.5中並向其中加入1％(v/v)的兩性電解質的混合物，其含有60％的pH 3.5-10和40％的pH範圍為4-8的兩性電解質。過量的IAA通過添加二硫蘇糖醇(DTT)化學地除去。在第一個電泳維度，條帶具有18cm的pH-梯度；在第二個維度，在尺寸為180×160×1.5mm的凝膠中，使蛋白基於它們在8-16％T梯度聚丙烯醯胺中的尺寸進行分離。

染色技術和圖像分析。

在SDS-PAGE凝膠中分離之後，通過雙染色程序對蛋白質可視化：在第一階段，利用三氯乙酸甲酯負染色，接著對於準備用於質譜法的凝膠進行銀膠體考馬斯藍G250染色。來自凝膠的圖像使用GS800光度計數位化並利用Versa DOC 400獲取。分析圖像利用PD Quest軟體(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)進行。

單向電泳。這樣的技術根據Laemmli在具有聚丙烯醯胺梯度的平板凝膠中進行。

蛋白質印跡。對患有LN的患者的腎小球洗出液和血清的蛋白質印跡通過使用腎足細胞和繫膜細胞的細胞提取物完成。在分離之後，通過使用專用設備「Novablot半乾系統」和通過使用含有2-氨基2-羥甲基1,3-丙二醇tris 38mM、甘氨酸39mM、十二烷基硫酸鈉(SDS)0.035％w/v和甲醇20％v/v的連續梯度緩衝系統，將通過單向或雙向電泳分離的蛋白質轉移到硝基纖維素膜Protean BA(Schleicher&Schuell,Dassel Germany)上。轉移以1.55mA/cm2進行達1.5h。將血清(0.2ml，稀釋在20ml TBS中)在室溫溫育過夜並將該膜在TBS-T 0.15％v/v漂洗，並利用HRP-結合的抗-人IgG(Invitrogen Corporation,Camarillo,CA-2h,1:5000)溫育。

MALDI-MS。通過雙向凝膠電泳純化的蛋白用在5mM碳酸氫銨pH 8.9中的50％(v/v)乙腈(ACN)漂洗直至完全脫色，然後在100％(v/v)CAN中以及在1mM CaCl2和100mM碳酸氫銨pH 8.9中漂洗。作為質量分析的準備的酶消化在37℃利用在100mM碳酸氫銨緩衝液pH 7.8中的胰蛋白酶過夜進行。在結束時，消化反應通過添加甲酸pH 2猝滅。消化的樣品首先脫鹽並在MALDI(基質輔助雷射解吸電離)–MS分析之前，通過使用乙腈作為洗脫劑，利用μZipTipC18柱(Millipore,Bedford,MA,U.S.A.)濃縮。通過使用合適的片劑和α-氰基-4-羥基肉桂酸作為基質，將肽混合物加載到MALDI上。分析利用Voyager-DE PRO系統(Applied Biosystems,Framingham,MA,U.S.A.)進行。參照國家生物技術信息中心(National Centre for Biotechnology Information)和SwissProt非冗餘序列資料庫，使用PROWL軟體來鑑別非模糊斑點。

LC-MS。將LC-ESI MS-MS/MS用於表徵兩種單個蛋白質(然後表徵為波形蛋白和烯醇酶)。對於液體質量分析，對蛋白初步處理用於MALDI。蛋白斑點如上處理。酶消化在37℃利用在100mM碳酸氫銨pH 7.8中的胰蛋白酶過夜。反應通過添加甲酸酯pH 2猝滅。使用的質譜儀是LTQ線性離子阱質譜儀(Thermo Electron,San Jose,USA)，其連接至裝配有Jupiter C18柱250mm×1mm(Phenomenex)的HPLC Surveyor(Thermo Electron)。在50μl/min的低流速下用乙腈梯度(5％B持續6』，接著在109』內5至90％B–洗脫劑A：在水中的0.1％甲酸，洗脫劑B：在乙腈中的0.1％甲酸)洗脫肽。流出物直接引入到電噴霧(電壓5.0kV)，其又將離子引入處於200℃且電壓在2.85V的毛細管中。MS/MS譜圖具有第一次MS掃描(m/z 400–1800)，接著5次MS/MS分析。將通過譜儀獲得的數據轉換為用於在專門資料庫(Extract_msn in Bioworks 3.3.1Sp1personalized with LTQ spectra)中搜索的文件。對於蛋白鑑別，使用SEQUEST軟體3.3.1(Thermo Electron)，其在10個處理器集群(AETHIA,(Torino,Italia)Turin,Italy)上運行。作為MS/MS的單個肽的鑑別根據嚴格標準過濾：根據HUPO標準，對於單個離子Xcorr≥1.9，對於雙電荷離子Xcorr≥2.2，並且對於三電荷離子Xcorr≥3.7，其中概率≤0.01,δCn≥0.1和Rsp≤4。

關於腎活檢的免疫螢光。將OCT中的腎活檢(Tissue Tek,Miles Inc.,Elkhart,IN,USA)儲存在液氮中。組裝在用聚L賴氨酸處理的玻璃上的3-μm切片利用免疫螢光處理。在第一階段，將腎切片在4℃在改性Carnoy溶液中漂洗10』，隨後在磷酸緩衝溶液(PBS-pH 7.2)中洗滌。室溫下在PBS中的牛白蛋白血清(BSA)3％w/v中洗滌之後，將切片利用在PBS中1:100稀釋的對抗所關注抗原的單-多克隆抗體(關於種源參見關於抗體的部分)在室溫溫育2h。然後反應發展利用異硫氰酸螢光素-結合的(FITC)特異性抗體進行。陰性對照通過使用PBS或等同濃度的非免疫兔或小鼠血清作為一抗平行地處理。

足細胞抗原和植入有igG2的抗原的共定位和共聚焦分析。

即使對於共定位研究，將用OCT處理的腎活檢(Tissue Tek,Miles Inc.,Elkhart,IN,USA)儲存在液氮中。在4℃下將冷凍切片(3μM)在Carnoy溶液中固定10』並在PBS pH 7.2中洗滌。室溫下利用PBS中的牛血清白蛋白(BSA)3％w/v對非特異性相互作用封閉30』。然後在室溫將切片連續用在PBS中1:100稀釋的多克隆或單克隆抗體溫育2h。在另外的洗滌之後，將切片在室溫暴露於稀釋(1:20)的具有對抗兔IgG F(ab』)2片段的驢抗體的德克薩斯紅-綴合物(Texas Red-conjugate)達1h。然後在室溫將反應物以PBS中1:10稀釋的對抗人IgG2(Invitrogen,CA)的小鼠抗體顯影1h。然後將沉積的IgG2利用1:100稀釋的對抗FITC-綴合的小鼠IgG(Jackson Immunoresearch,PA)的驢抗體顯示1h。圖像通過使用裝配有43x/1.30油物鏡的共聚焦顯微鏡(LSM 510Meta，其集成有Axiovert 200M倒置顯微鏡Carl Zeiss,Jena Germany)進行分析。

腎小球洗出液中和血清中的同種型的表徵和自身抗體的確定。

斑點印跡。通過使用Bio Rad(Hercules,CA,USA)的用於斑點印跡的設備進行分析並且它基於在硝基纖維素膜上的定量抗原(α烯醇酶(αeolasi)、膜聯蛋白AI、DNA、C1Q、組蛋白H2A、H3和H4)的固定化。將用TBS預處理的膜固定在斑點印跡設備上，然後裝載恆定量的在TBS中的抗原(100ng)。在劑量(α烯醇酶，膜聯蛋白AI，DNA，C1Q，組蛋白H2A，H3和H4)期間，將100μl的這種溶液用於所述系統(「多孔」型)的多個孔，其中將抗原首先在接觸下留置24h，然後在利用真空生成的負壓力下進一步連接至硝基纖維素。然後將連接有抗原的膜在TBS-T(TBS-5％白蛋白-0.05％gr/v,吐溫20v/v)中飽和。在此時將在TBS-T中1:50稀釋的定量血清施加到孔中並留置以在室溫溫育6小時，然後在4C°溫育過夜；結束時將膜在TBS-T中洗滌3次。在此時利用用辣根過氧化物酶(HPR)標記的在TBS-T中1:200稀釋的抗-人IgG2抗體(克隆體：HP6014-InVitrogen Corporation,Camarillo,CA)，通過在室溫溫育檢測IgG2存在。在用TBST-T 3次洗滌之後，反應物在化學螢光中顯影(SuperSignal,West Pico,Chemiluminescent,Thermo scientific,Rockford,USA)。製備使用具有不同稀釋度的IgG2抗體的標準曲線以評價反應線性度並建立讀出範圍。

用於確定在PBS中所關注的IgG2的ELISA放置在9-孔板(MaxiPrep板，96孔)的單個孔中並在室溫溫育5h，然後在4℃溫育過夜。向每個孔加入封閉溶液(PBS,5％w/v BSA和0.05％v/v吐溫20)的等分試樣(200μl)，然後加入在PBST(PBS–吐溫20 0.05％v/v-BSA 1％w/v)中的1:50稀釋的血清(100μl)，將其在室溫溫育4小時然後在4C°溫育過夜。在PBS-T中3次洗滌之後，利用用辣根過氧化物酶(HPR)標記的在TBS-T中1:3000稀釋的抗-人IgG2抗體(克隆體：HP6014-InVitrogen Corporation,Camarillo,CA)。

對過氧化物酶反應的顯影通過添加100μl的TMB/H2O2底物(10:1)並取決於色度反應(Mx 30分鐘)溫育可變化的時間段而獲得。然後這樣的色度反應通過添加100μl的0.45M的H2SO4溶液終止並在30min內讀數。然後在特定讀數器，多板讀數器iMark(BioRad,Hercules,CA,USA)中在450nm讀出吸光度。製備使用在不同稀釋度的IgG2抗體的標準曲線以用於評價反應線性度並建立讀出範圍。

從血清和腎小球洗出液純化抗-DNA抗體。

從患有紅斑狼瘡的患者的血清和/或從患有狼瘡腎炎的患者的腎小球洗出液的純化抗-dsDNA抗體是利用色譜技術進行的，使用用25mM tris-緩衝液pH 8.0平衡的對於天然DNA具有親和性的纖維素柱(Amersham Pharmacia Biotech.)。棄去對於DNA沒有親和性的蛋白質部分，隨後在PBS中洗滌，而抗-DNA抗體利用線性梯度NaCl梯度洗脫。

α烯醇酶的CNBr消化和片段化產物的分析。對於利用溴化氰(CNBr)的消化，將α烯醇酶(100μg)在室溫在0.4M碳酸氫銨中與1％v/v 2-巰基乙醇在黑暗中溫育1h。然後，樣品利用真空脫水並重新懸浮在5μL的去離子水、15μL的三氟乙酸(TFA)和5μL的在乙腈(ACN)中的5M CNBr中；溫育在4℃持續過夜並且反應用新的脫水程序結束。將終樣品重新懸浮在Tris-HCl 62.5mM pH 6.8、2％w/v SDS和10％甘油中。片段的分析在聚丙烯醯胺梯度中的電泳中進行。

由來源於患有MRL-lpr/lpr自發性狼瘡的小鼠的單克隆抗-DNA(IgG2克隆體H147)識別的抗原的表徵。

來源於患有MRL-lpr/lpr自發性狼瘡的小鼠的克隆體(H147)的IgG2同種型的抗-DNA抗體由Michael Madaio博士(Georgia Health Sciences University,Augusta,Georgia,USA)提供。

BALB/c中的抗-α烯醇酶IgG灌注。將二十二隻BALB/c和六隻SCID小鼠腹膜內注射1×106個產生單克隆抗-α烯醇酶抗體的雜交瘤；將產生IgM抗-DNA抗體的雜交瘤細胞注射入3隻BALB/c和2隻SCID小鼠中作為對照。為確定蛋白尿進行每日尿液收集至兩周，處死日期。所有腎製備的組織學評價通過兩個獨立的病理學家一式三份地進行評價。所有實驗依照用於在實驗室動物中完成實驗的NIH標準進行。

實施例

來自患有LN的受試者的腎小球洗出液包括識別一組腎小球抗原的抗體。示於圖1的此系列實驗是作為在專利申請中顯示的診斷髮展的準備。事實上，該專利潛在的構思在於僅存在於患有LN的患者腎臟中(圖1a,b,c,d)並且可以甚至在其血清中確定(圖1e,f)的抗體將是致病性的，並且因此在臨床上與狼瘡腎炎相關。相同抗體在腎臟中和在血清中的存在之間的關聯構成發現的邏輯基礎，基於其形成早期診斷的可能性並通過對其血清水平(然後在具有易於訪問的流體中)給藥而預防疾病。發現作為開發診斷試劑盒的準備的第二邏輯基礎在於，僅相同患者的腎臟中和血清中可檢測的抗體的同種型具有診斷價值。

為了分析腎小球洗出液，我們利用了從順從診斷目的的活檢程序的受SLE與蛋白尿影響的20位患者獲得的活檢；大多數受檢的患者已用低劑量類固醇或免疫抑制藥物治療。通過活檢獲得的腎臟組織根據編碼技術冷凍(液氮)然後將腎小球藉助於『雷射捕獲』切開；免疫球蛋白如上所述的通過分離的腎小球洗脫並利用蛋白質印跡技術(單向和雙向電泳)分析，其中作為固定抗原利用來自足細胞(即構成腎小球的結構和功能基礎的上皮細胞)的細胞提取物。

為了表徵由洗脫的抗體識別的蛋白質，首先我們分析了利用雙向電泳從來自不同LN類別的樣品獲得的這組數據。然後藉助於用於所選抗原的單向電泳和斑點印跡法進行每個樣品的單獨分析(圖2)。來自第一種方法的結果表明存在對抗被純化並通過質譜法(LC-MS或MALDI)表徵的特定蛋白質的多種抗體。利用相同的邏輯程序和相同的技術來證實在有和沒有LN的考察下在患者的血清中存在相同的抗體(圖1e,f)。基於患有多種LN類別的患者的腎臟中存在對抗特定蛋白質的抗體，定義了對抗α-烯醇酶和膜聯蛋白AI的優勢抗體。這些抗體特徵在於與各單個活檢中的同種型、腎共定位和陽性相關(圖2)。為了驗證對抗α-烯醇酶和膜聯蛋白AI的抗體存在的實體，作為比較，考慮了廣義抗體，通過評價其在腎臟中的存在，其在患有紅斑狼瘡的患者的血清中升高是已知的。其中評價了在對抗DNA和對抗其蛋白成分(抗-組蛋白)的抗體的腎小球洗出液中的存在；也評價了對抗C1q的抗體。這些抗體的靶抗原不以暴露方式存在於腎臟中並且因此它們被定義為可植入的，即它們可以沉積在來自血清的腎小球循環中。對於由腎臟洗出的各個抗體(即抗-α烯醇酶，抗-膜聯蛋白AI，抗-DNA，抗-組蛋白和抗C1q)，表徵特定同種型，然後是各單個活檢中的主要同種型的抗體的頻度，最後是在腎小球中的共定位。在圖中，顯示了對於發現對抗由腎細胞表達的蛋白的抗體(抗-α烯醇酶和抗-膜聯蛋白AI)的分析(a,b)和對於可植入抗原(抗-DNA，抗-C1Q，抗-組蛋白2A、3和4)的分析(c，d，e)。在所有情形中，全部可能的同種型(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)利用斑點印跡法進行評價，並且在確定對於所有上述抗體(抗-α烯醇酶，抗-膜聯蛋白AI，抗-DNA，抗C1q，抗-組蛋白2A、3、4)，獨特的同種型為IgG2後，在所有收集的活檢中製備個性化劑量(a-e)。最後，單個活檢中的單個抗體的陽性並存顯示在(f)中，其圖示地表示為色標(熱強度圖)，對於對抗所有抗原的IgG2同種型的抗體家族的層次分析。相比於植入的抗原，對抗α烯醇酶和膜聯蛋白AI的抗體的單個患者的腎小球中的數量上優勢是明顯的(在圖2f中，從灰色至黑色的顏色表示高水平的抗體)。

在已證實抗-α烯醇酶和抗-膜聯蛋白AI IgG2抗體(以及具有小強度的抗-DNA，抗-C1Q，抗-組蛋白2A、3和4抗體)在患有LN的患者腎小球中的數量上優勢之後，通過首先表徵相同抗體的所有同種型然後表徵其循環水平，評價血清組分。在這個研究部分，集中在對抗α烯醇酶、抗-膜聯蛋白AI和組蛋白2A、3和4的抗體。在實驗的製備部分，進行在對抗所有不同類別的抗原的抗體的血清中的所有主要同種型的表徵(圖3a)。得出在血清中，存在較少的抗體的同型特異性，能夠證實除了IgG2(其保留主要的同種型)抗體之外，甚至IgG1和IgG3同種型。臨床研究涉及所有自身抗體的循環水平，調查的對象涉及具有不同臨床徵象的544位患者(103位患者患有LN，113位患有SLE，50位患有類風溼性關節炎，278位患有原發性腎小球腎炎，即60IgA，186膜性腎病，32位患有局灶性腎小球硬化症局灶性硬化腎小球)和130位正常受試者。在患有LN的患者的相關部分，劑量在嚴格免疫抑制治療的6個月(63位)和12個月(68位)之後以及在改善炎症和腎臟損害期間重複。對於關於抗-α烯醇酶IgG2的水平(圖3b)的部分，利用斑點印跡法製備劑量並與ELISA進行比較(圖8)。

在抗-抗-α烯醇酶IgG2的情況下，證實了相對於患有SLE的患者，所述水平高，特別是在患有急性LN的患者中，並且這樣的值在免疫抑制治療階段期間降低(圖3c,d)。發現抗-α烯醇酶IgG2的水平在患有類風溼性關節炎的患者中低並且在患有其他腎小球腎炎的患者中不能整體給藥。ROC曲線(圖10)顯示相對於所有其他類別的患者，包括SLE、類風溼性關節炎和原發性腎小球腎炎，對於鑑別患有LN的患者的高特異性和敏感性。

在抗-膜聯蛋白AI IgG2的情況下(圖4a，b)，顯示了相對於SLE在LN中增大的抗體循環水平。在12個月之後所述水平隨著治療而下降(圖4c)。

在抗-組蛋白2A、3和4抗體的情況下(圖5a，b，c)，顯示了對於所有抗原的特異性IgG2水平，其陽性涉及大部分的患者。即使在此情況下，相對於其他組(SLE、RA、其他腎小球腎炎)，抗體水平在患有LN的患者中顯著更高，但是相對於抗-α烯醇酶IgG2，所述水平更低一到二個數量級(0.5mg/l對40mg/l)。在抗-組蛋白2a抗體的情況下(a)，還存在IgG1和IgG3類別的抗體的增多，即使陽性涉及較少部分的患者。

在圖11中，顯示層次分析(熱圖)與在鑑別屬於不同研究組的患者中的各個特定抗體給出的貢獻相關。顯然高血清水平的抗-α烯醇酶和抗-膜聯蛋白AI IgG2的存在以非常明顯的方式鑑別出在有和沒有腎病的情況下受SLE影響的患者(深色)與受類風溼性關節炎影響的患者(淺色)；高水平的抗H3e IgG2和抗-DNA IgG3顯著有助於鑑別患有SLE的患者，但是它們對於鑑別患有類風溼性關節炎的患者不敏感。總的來說，本文中描述的所有抗體的劑量允許將多個子組並且主要是患有SLE、患有SLE和相關腎病的患者與患有類風溼性關節炎並且明顯是正常對照的患者區分開。

研究的最後一部分致力於驗證抗-α烯醇酶IgG2抗體對於狼瘡腎炎的特異性以及甚至定義在疾病動物模型中其併發症。涉及特異性的結果示於圖6。IgG2同種型的抗體的反應性通過患有膜性腎病的患者血清純化，所述患有膜性腎病的患者是一類最近被識別在腎小球和血清中具有高水平的抗-α烯醇酶IgG4的患者。通過使用利用CNBr獲得的烯醇酶的片段來評價特異性(a)。結果顯示，IgG2和IgG4識別源自CNBr片段化的不同肽，即分別是具有1.3KDa和6.8kDa的產物。實驗的結果使得人類狼瘡性腎病和鼠類狼瘡性腎病之間的同源性突顯。它們示於圖6d和圖9中。在第一種情況下，表徵了負責易於患有狼瘡的小鼠(MRL-lpr/lpr)的腎病特性的抗體。在這種模型中，實驗性狼瘡性腎病藉助於灌注由源自受試者小鼠的細胞產生的抗-DNA IgG2單克隆抗體而再現。在被動轉移至正常小鼠之後，由克隆體H147(由7183/81X VH基因編碼的IgG2)產生的這樣的抗體的原型誘發形成腎小球和腎小管基底膜形成、繫膜免疫沉積和增生性腎小球腎炎。這些抗體的靶抗原已被識別是α烯醇酶(圖6d)。因此在本文中，證實了α烯醇酶通過源自易患有狼瘡的小鼠的致腎炎抗體所識別。

在第二組實驗中，確認了抗-α烯醇酶IgG2可以在實驗動物中誘發狼瘡腎炎。實驗在22隻BALB/c小鼠中進行，所述小鼠腹膜內注射產生抗-α烯醇酶IgG抗體或抗-dsDNA IgM抗體作為對照的雜交瘤。在距注射的10天之後，在25％的注射小鼠中發現蛋白尿(100-300mg％)(圖9a)；檢查用小鼠中的蛋白尿恆定地低於10mg％。腎組織分析顯示在注射有抗-α烯醇酶單克隆抗體的22隻中的5隻中的增生性腎小球病變(b)，在2隻小鼠中增生性病變與基底膜增厚並存並且在2隻中與腎小管滲透並存(c)。在六隻以類似方式注射有雜交瘤的SCID小鼠中：4隻發展了腎小球增生性病變與半月形和腎小管-間質滲透(c)。注射有單克隆抗-DNA IgM的小鼠僅發展病灶性腎小管滲透。

總起來說，在動物中進行的實驗的結果應被考慮為支持這樣的構思，即抗-α烯醇酶IgG2對於腎臟是有毒的，然後其在患有狼瘡腎炎的受試者中發現的高水平在疾病的發病機制中找到直接理由。