利用原子力顯微鏡的生物分子相互作用的製作方法
2023-09-10 23:14:20 1
專利名稱：:利用原子力顯微鏡的生物分子相互作用的製作方法
技術領域：
：本發明主要涉及原子力顯微鏡(AFM)、用於AFM的懸臂以及利用原子力顯微鏡測量生物分子之間的分子間相互作用的設備和方法。本發明涉及樹枝狀大分子塗布的Bio-AFM針尖在測定生物分子之間相互作用時的用途。本發明還提供了通過利用具有可控中間間隔的表面進行細胞受體的Bio-AFM(生物原子力顯微鏡)作用力作圖的細節。
背景技術：
：在後基因組時代，為了藥物發現以及疾病診斷和預防的目的，對基因組的定量和全面研究是快速成長的研究和發展領域。這些方面的發展已經形成了對具有高度敏感性和優良特異性的先進的生物分子識別探針的強烈需求(K.Wangetal.Anal.Chem.76,57212004)。在多種生物分子識別研究中，理解互補DNA鏈的機械穩定性(或識別特性)對於深入理解多個重要的生物過程例如DNA轉錄、基因表達和調節以及DNA複製都很關鍵。在這個方面，已經利用多種技術例如光鑷子、微吸量管抽吸和AFM等研究了拉伸和力誘導的DNA角軍鏈(H.Clausen-Schaumann,M.Seitz,R.Krautbauer,H.E.Gaub,Curr.0pin.Chem.Biol.4,524，2000;R.Merkel，PhysicsReports346，343，2001;G.U.Lee，LA.Chris，R.J.Colton，Science266，771，1994)。由於能夠在幾皮牛頓力之下，以較小的長度尺度和較高的敏感性測定單個分子之間的特異性相互作用，AFM正成為一個快速發展的技術，用於在分子水平探測親和力和識別性能(R.Krautbauer,M.Rief,H.E.Gaub,NanoLett.3,493,2003)相比於其他用於力測定的敏感方法，AFM具有較高力解析度和較高空間解析度的優勢，且可在生理條件下操作，用於研究生物過程中的特異相互作用，例如靜電相互作用(J.Wang，A.J.Bard,Anal.Chem.73,2207,2001)、配體-受體結合(S.M.Rigby-Singletonetal.，J.Chem.Soc.,PerkinTrans.21722,2002)、抗原-抗體相互作用(F.Schwesingeretal.,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.97，9972，2000)、核酸適體-蛋白相互作用(C.Baietal.，Anal.Chem.75，2112，2003)、蛋白質摺疊/去摺疊(P.M.Williamsetal.,Nature422，446，2003;M.S.Ζ.Kellermayer,S.B.Smith,H.L.Granzier,C.Bustamante,Science276,1112,1997)、細胞-細胞黏附(M.Benoit,D.Gabriel,G.Gerisch,H.E.Gaub,NatureCellBiol.2,313,2000)以及DNA-DNA雜交(C.ff.Frank,Biophys.J.76，2922，1999)。儘管實施了多個對互補DNA鏈之間的解鏈力測定的研究(H.Clausen-Schaumann,M.Seitz,R.Krautbauer,H.E.Gaub,Curr.0pin.Chem.Biol.4,524,2000；R,Merkel,PhysicsReports346，343，2001；G.U.Lee,L.A.Chris,R.J.Colton,Science266，771.1994；R.Krautbauer,M.Rief,H.E.Gaub,NanoLett.3,493,2003)，在單分子水平的研究過程中，DNA鏈之間的識別依然存在問題。通常的固定途徑經受多點相互作用，分辨出單分子相互作用尚不是一個容易的任務。為了避免不需要的相互作用，可通過與惰性的表面活性劑混合而降低表面密度，但該途徑導致較低的識別效率，從而得到可靠性較低的分析。因此，通常用於這種固定所使用的表面化學例如氧化物-矽烷和金-硫醇化學(T.Hugel,M.Seitz,Macromol.Rapid.Commun.22,989,2001；ff.K.Zhang,X.Zhang,Prog.Polym.Sc1.28,1271,2003)尚未優化為可糾正在利用AFM的力測定過程中單個DNA-DNA相互作用中的無價值基礎信息。傳統上，原子力顯微鏡在理解生物體內存在的生物分子之間的多種相互作用機制中發揮重要作用。儘管其能夠分析相互作用力，隨著在分子水平上開展了越來越多的研究，預期未來其在納米和生物
技術領域：
：內的重要性將會增加。利用該技術的優勢，已經努力研究不同表面上生物分子之間的相互作用機制。然而，與液體不同，觀察表面上的生物材料產生了獨特的問題，例如不隨意吸收和空間位阻。在解決這種問題所採取的多種措施中，最常用的措施涉及到通過將複合自組裝膜塗布於表面上而測定單分子相互作用。當用AFM觀察兩個生物分子之間的單一相互作用力時，遇到了兩個問題。第一個問題涉及表面上生物分子活性與機體內部相比的差異。第二個問題圍繞這樣一個事實，即在這種情況下不能保證單分子相互作用。先前的研究表明兩個問題均可利用自組裝膜技術和中間間隔控制技術得到解決(Langmuir2005，21，4257，WO2006/016787)。所述技術涉及通過限制官能團(其上可引入所述分子)的數目而控制生物分子的間隔和數目，從而在單分子水平上觀察分子間相互作用。該方法最常見的問題涉及導致相分離的相同官能團的分子之間的非期望的吸引。此外，沒有具體的證據表明生物分子彼此之間是平均間隔的。利用BiO-AFM技術的生物分子研究的重要性正在迅速增長，BiO-AFM能夠在支持生物活性的液體環境中觀察非傳導性物質例如納米水平的生物分子的能力，已經使Bio-AFM成為一種研究生物分子的結構和亞結構的重要工具。此外，Bio-AFM使得可以通過它的Bio-AFM針尖近距離觀察分子相互作用，生物分子可加載於所述針尖上。重要的應用包括觀察互補DNA分子之間的相互作用、蛋白質之間的相互作用、配體-受體相互作用，後者在研究對藥物的免疫反應中具有顯著意義。在單分子水平上研究生物分子之間的相互作用力時，高敏感性是最重要的。單分子觀察可以通過諸如Bio-AFM、光鑷子和磁鑷子等方法實現。每一種方法均有其缺點，例如磁鑷子方法缺乏準確性，光鑷子方法則可招致對分子的潛在損傷。為了利用Bi0-AFM研究配體-受體機制，需要將配體加載於所述針尖的頂端。通常這可利用生物素-抗生物素蛋白鏈菌素相互作用或利用複合自組裝膜而實現。然而，這些方法不能直接控制分子距離，而且可引起配體在某個區域聚集，使得準確觀察配體-受體相互作用比較困難。
發明內容本發明的一個目的是提供用於原子力顯微鏡(AFM)的懸臂，所述原子力顯微鏡包括具有固定端和自由端的懸臂體，所述自由端具有的表面區域可用樹枝狀大分子進行化學修飾，其中所述樹枝狀大分子分支區的多個末端均結合於該表面，樹枝狀大分子的線性區的末端被功能化。本發明的另一個目的是提供用於AFM的懸臂，其中在線性官能團之間，所述樹枝狀大分子以約0.1nm和約IOOnm之間的固定間隔隔開。尤其是,所述樹枝狀大分子以約IOnm的固定間隔隔開。本發明的進一步目的是提供用於製造懸臂的方法，包括(i)功能化所述懸臂的表面區，使得其可與樹枝狀大分子的末端反應；以及(ii)將樹枝狀大分子接觸表面區使得該末端與表面形成鍵。本發明的一個目的是提供用於製造懸臂的方法，其中探針核苷酸、用於受體的配體或連接於所述探針核苷酸或配體的連接分子固定於樹枝狀大分子線性區的末端，包括以下步驟i)從表面區域上所述樹枝狀大分子線性區的末端去除保護基團；以及ii)使探針核苷酸、配體或連接於所述探針核苷酸或配體的連接分子接觸支持物(substrate)枝狀大分子線性區的末端，從而使所述探針核苷酸、配體或連接分子與所述末端成鍵，其中所述連接分子是同-雙功能或異-雙功能連接子。本發明還提供一種用於通過原子力顯微鏡測定一個探針核苷酸或配體與一個靶核苷酸或配體結合伴侶例如其受體之間的相互作用的設備，所述設備包括:具有固定端和自由端的懸臂，所述自由端具有被樹枝狀大分子化學修飾的表面區，其中所述樹枝狀大分子的分支區的多個末端結合於該表面，樹枝狀大分子的線性區的末端連接於所述探針核苷酸或配體。支持物，靶核苷酸或配體結合伴侶被固定在支持物上。控制器，用於調節懸臂和支持物上的靶核苷酸或配體結合伴侶的相對位置和方向，以引起固定於懸臂樹枝狀大分子修飾的表面區上的探針核苷酸或配體與固定於支持物上的靶核苷酸或配體結合伴侶之間的相互作用；以及檢測器，用於測定與探針核苷酸或配體和樣本核苷酸或配體結合伴侶之間的相互作用相關的物理參數。在一個具體實施方式中，由靶核苷酸或配體結合伴侶固定的支持物可採取本領域中任何一種表面修飾的方法。優選地，所述支持物具有一個樹枝狀大分子修飾的表面。本發明的另一個目的是提供分析與探針核苷酸或配體相互作用的靶核苷酸或配體結合伴侶的方法，所述方法包括以下步驟:(a)提供具有固定端和自由端的懸臂，所述自由端具有被樹枝狀大分子化學修飾的表面區，其中所述樹枝狀大分子的分支區的多個末端均結合於該表面，以及支持物；(b)化學修飾所述支持物，以在其上固定靶核苷酸或配體結合伴侶；(C)化學修飾樹枝狀大分子修飾的懸臂表面區，以固定探針核苷酸或配體；(d)將支持物和懸臂連接於包含控制器的設備，所述控制器用於調節支持物和懸臂的相對位置和方向，以引起固定於樹枝狀大分子修飾的懸臂表面區上的探針核苷酸或配體與固定於樣品支持部件的支持物上的靶核苷酸或配體結合伴侶之間的相互作用；(e)控制懸臂和支持物的相對位置和方向，以引起探針核苷酸或配體與靶核苷酸或配體結合伴侶之間的相互作用；以及[0028](f)測定與探針核苷酸或配體和靶核苷酸或配體結合伴侶之間相互作用相關的物理參數。上文中，分支區的末端用-C0Z、-NHR、-0R』或-PR」3進行功能化處理，其中Z可以是離去基團，其中R可以是烷基、其中R』可以是烷基、芳香基或醚，R」是H、烷基、烷氧基或O。尤其是，COZ是酯、活化酯、酸性滷化物、活化醯胺或CO-咪唑基(imidazoyl);R可以為C1-C4烷基，R』可以為C1-C4烷基。此外，在上述支持物中，所述聚合物可以為樹枝狀大分子。更進一步，所述聚合物的線性區可以包括一個間隔區。而且所述間隔區可以通過第一官能團連接於分支區。這種第一官能團不限於-順2、-0!1、-!13、-(1)0!1、-010或-5!1。此外，所述間隔區可包括共價結合於所述第一官能團的連接區。在所述支持物和AFM懸臂中，優選AFM針尖，所述連接區可包括取代或未取代的烷基、烯基、炔基、環烷、芳香基、醚、聚醚、酯或氨烷基。此外，所述間隔區可包括第二官能團。所述第二官能團可包括但不限於-NH2、-oh、-PH3>-C00H、-CHO或-SH。第二官能團可以位於線性區的末端。而且，保護基團可結合於線性區的末端。這種保護基團可以為酸不穩定或鹼不穩定的。在本發明的另一個具體實施方式中，在上述AFM懸臂中，探針配體或核苷酸和/或靶配體結合伴侶或核苷酸可結合於樹枝狀大分子線性區的末端。尤其是，所述靶核苷酸和探針核苷酸可以為DNA、RNA、PNA、核酸適體、核苷酸類似物或其組合。靶特異性配體包括核苷酸，但更通常被認為是化學複合物、多肽、碳水化合物、抗體、抗原、生物模擬物(biomimetics)、核苷酸類似物或其組合。此外，結合於樹枝狀大分子線性區的配體或核苷酸之間的距離可以為從約0.1nm至約100nm。在本發明的另外一個具體實施方式中，上述支持物可由半導體、合成的有機金屬、合成的半導體、金屬、合金、塑料、矽、矽酸鹽、玻璃或陶瓷。尤其是，所述支持物可以不限於載玻片、顆粒、珠、微孔或多孔材料。根據本發明的下列描述、本文中所附的參考附圖以及所附的權利要求，可以更充分地理解本發明的這些和其他目的。圖1A是Bio-AFM的示意圖，圖1B和IC是Bio-AFM的照片。圖2A是用於Bio-AFM的懸臂的示意圖，圖2B示出了根據本發明的示例性實施方式的AFM懸臂的針尖的放大視圖，圖2C示出了多種市售的AFM針尖。圖3是AFM的探針針尖與支持物祀標之間接觸面的示意圖,該接觸面用於通過AFM方法學來測定結合力和非結合力。圖4A是一個柱狀圖，示出了具有相對較窄間隔的互補的30個鹼基對在110nm/s的回縮速率下的力分布；圖4B至圖4C是在540nm/s的回縮速率下直接測定互補的30個鹼基對的單一非結合力。圖5A是一個柱狀圖，示出了具有相對較寬間隔的互補的30個鹼基對在110nm/S的回縮速率下的力分布；圖58至圖5C是在110nm/S的回縮速率下測定互補的30個鹼基對的結合力。[0040]圖6A和圖6B是柱狀圖，示出了互補的DNA雙鏈的結合力分布，圖6C是柱狀圖，示出了互補的DNA雙鏈的非結合力分布。圖7是一個柱狀圖，示出了單鹼基錯配的DNA雙鏈的結合力分布。圖8是一個柱狀圖，示出了雙鹼基錯配的DNA雙鏈的結合力分布。圖9示出了AFM懸臂的示意圖和AFM懸臂針尖的放大視圖。圖1Oa示出了樹枝狀大分子修飾的AFM針尖的示意圖，該針尖連接有具有足夠間隔的配體。圖1Ob示出了AFM針尖的示意圖，該針尖連接有緊密填充的配體。圖1la示出了將蛋白固定於樹枝狀大分子修飾的AFM針尖上的方法的示意圖。圖1lb示出了將蛋白固定於樹枝狀大分子修飾的支持物上的方法的示意圖。圖12示出了利用AFM進行力測量的方法的示意圖。圖13a示出了利用AFM通過封閉蛋白進行力測量的示意圖。圖13b示出了利用AFM通過競爭性蛋白進行力測量的示意圖。圖14a是一個柱狀圖，示出了Munc-18-l與PLD1-PX之間相互作用的力分布。圖14b是一個柱狀圖，示出了在溶液中加入過量的游離Munc-18-l後，Munc-18-l與PLDl-PX之間相互作用的力分布。圖15是一個曲線，示出了力隨著競爭蛋白PLC-YI的濃度而變化的情況。圖16a示出了通過配體塗布的AFM針尖篩查細胞上受體的方法的示意圖。圖16b_16d示出了FPRl與其結合肽之間相互作用的力曲線。圖17a_17b示出了在細胞每個不同區域上FPRl與其結合肽之間相互作用的力圖譜和柱狀圖。圖18示出了用游離WKYMVm(SEQEDNO:17)封閉之前和封閉之後FPRl與其結合肽之間相互作用的力圖譜和柱狀圖。具體實施方式在本申請中，「一個」既用來指單個又用來指多個對象。如本文中所使用的，「核酸適體」意思是單鏈、部分單鏈、部分雙鏈或雙鏈核苷酸序列，有利地為可複製的核苷酸序列，它們能夠通過不同於Watson-Crick鹼基配對或形成三體的機制而特異性識別選擇的非寡核苷酸分子或分子基團。如在本文中使用的，「模仿生物的(biomimetic)」意思為模擬生物分子、分子基團、結構的分子、基團、多分子結構或方法。術語「樹枝狀聚合物」的特徵在於具有一個核心、至少一個內分支層以及一個表面分支層(見Petaretal,Pages641-645,InChem.1nBritain,August1994)。「樹枝狀大分子」是一種樹枝形聚合物，具有從焦點發出的分支，所述焦點為核心或可直接或通過連接基團連接到核心以形成樹枝狀聚合物。許多樹枝狀聚合物包括連接於一個共同核心的兩個或多個樹枝狀大分子。然而，術語「樹枝狀聚合物」可廣泛應用，包括單個樹枝狀大分子。如在本文中使用的，「超分支」或「分支」，如其用來描述大分子或樹枝狀大分子結構，意思指具有多個末端的多個聚合物，所述末端能共價結合或通過離子鍵結合於支持物。在一個具體實施方式中，包含所述分支或超分支結構的大分子是「預先製備的」，然後連接於支持物。如在本文中使用的，「固定的」意思為不溶解的或包括連接於或可操作地連接於不溶的、部分不溶的、膠體、微粒、分散體系、懸浮液和/或脫水物質或分子或包括固態支撐物或連接於固態支撐物的固相。如在本文中使用的，「文庫」指的是分子、材料、表面、結構形狀、表面特徵的隨機或非隨機混合、收集或分類，或可選地但不限於多種化學實體、單體、聚合物、結構、前體、產物、修飾、衍生物、物質、構型、形狀或特徵的隨機或非隨機混合、收集或分類。如在本文中使用的，「配體」意思是一種選擇的分子，其能夠通過基於親和力的吸引而特異性結合於另一個分子，所述吸引包括互補性鹼基配對。配體包括但不限於核酸、多種合成的化學物質、受體激動劑、部分激動劑、混合激動劑、拮抗劑、反應誘導或刺激分子、藥物、激素、信息激素、遞質、內泌素、生長因子、細胞因子、輔基、輔酶、輔因子、底物、前體、維生素、毒素、調節因子、抗原、半抗原、碳水化合物、分子模擬物、結構分子、效應分子、可選擇的分子(selectablemolecules)、生物素、地高辛、交叉反應物、類似物、這些分子的競爭劑或衍生物以及從文庫選擇的非寡核苷酸分子，這些分子能夠特異性結合於選定的靶標和通過將這些分子中任何一種連接於另一種分子而形成的軛合物。如在本文中使用的，「配體結合伴侶」指特異性結合於該配體的分子。如在本文中使用的，「連接分子」和「連接子」，用於提到分子時，將大小受控的大分子例如分支/線性聚合物的分支部分連接於保護基團或配體。連接子可以包括例如但不限於間隔分子、例如所選擇的能夠將配體連接於樹枝狀大分子的分子。如在本文中使用的，「低密度」指的是約0.01至約0.5個探針/nm2，優選約0.05至約0.2，更優選約0.075至約0.15，最優選約0.1個探針/nm2。如在本文中使用的，「分子模擬物」和「模擬物(mimetics)」是天然或合成的核苷酸或非核苷酸分子或分子基團，其經設計、選擇、製造、修飾或加工而具有的結構或功能等同於或類似於另一種分子或分子基團(例如天然存在的生物的或可選擇分子)的結構或功能。分子模擬物包括能夠發揮天然的、合成的、可選擇的或生物分子的代替物、替換物、升級物、改良物、結構類似物或功能類似物的作用的分子和多分子結構。如在本文中使用的，「探針核苷酸」或「靶核苷酸」包括核苷酸序列，例如寡核苷酸，且不限於一種核苷酸。如在本文中使用的，「核苷酸類似物」指的是在核酸合成和加工中，優選在酶促合成以及化學合成和加工中可替代天然存在的鹼基而使用的分子，特別是能夠鹼基配對的修飾的核苷酸，可選合成的鹼基不包括腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或稀有鹼基。該術語包括但不限於修飾的嘌呤或嘧啶、稀有鹼基、可逆核苷、嘌呤和嘧啶的結構類似物、帶標記的、衍生的及修飾的核苷和核苷酸、軛合的核苷和核苷酸、序列修飾物、末端修飾物、間隔區修飾物、以及具有主鏈修飾的核苷酸，包括但不限於核糖修飾的核苷酸、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯(phosphorothioates)、亞膦醯胺(phosphonamidite)、甲基膦酸酯、甲基亞磷醯胺(methylphosphoramidites)、甲基亞膦醯胺(phosphonamidite)、5』氰乙基亞憐酸胺(cyanoethylphosphoramidites)、亞甲基勝酸鹽(methylenephosphonates)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioates)、肽核酸、非手性和中性核苷酸間鍵和非核苷酸橋例如聚乙二醇、芳香聚醯胺和脂類。[0072]如在本文中使用的，「多肽」、「肽」和「蛋白」可以在本文中交換使用，指的是胺基酸殘基的聚合物。所述術語適用於胺基酸聚合物，其中一個或多個胺基酸殘基是相應天然存在的胺基酸以及天然存在的胺基酸聚合物的人工化學類似物。該術語還包括傳統肽鍵的變異體，所述傳統肽鍵連接構成多肽的胺基酸。如在本文中使用的，「保護基團」指的是連接於分子上反應基團(例如羥基或胺)的基團。所述被選擇的保護基團用來防止特定基團在化學反應的一個或多個步驟中的反應。通常，選擇所述特殊保護基團以允許在後期去除該基團，以恢復所述反應基團並不改變分子中存在的其他反應基團。保護基團的選擇依賴於待保護的特定基團和該保護基團將暴露於其中的化合物。保護基團的選擇為本領域中的技術人員所熟知。參見例如Greeneetal.，ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,2nded.，JohnWiley&Sons，Inc.Somerset,N.J.(1991)，其全部內容以引用的方式結合於此。如在本文中使用的，「受保護胺」指的是已經與氨基保護基團發生反應的胺。所述線性針尖官能團是氨基的情況下，氨基保護基團防止在分支末端連接於固態支持物的過程中氨化物功能的反應。氨基保護基團可以在後期去除而恢復氨基，並不改變分子中存在的其他反應基團。例如，環外胺可以與二甲基甲醯胺二乙縮醛發生反應，形成二甲基氨基亞甲胺(dimethylaminomethylenamino)功能部分。氨基保護基團通常包括氨基甲酸鹽/酯、苯甲基、亞氨酸酯以及其他為本領域中技術人員已知的基團。優選的氨基保護基團包括但不限於P-硝苯基乙氧羰基或二甲氨基亞甲基胺。如在本文中使用的，「固定間隔」指的是尺寸受控的大分子的針尖之間的間隔，其為約Inm至約IOOnm的距離，以留出靶特異性配體與靶標之間相互作用的空間，基本上無空間位阻。因此，支持物上的大分子層不過於濃密，從而使特異性分子相互作用能夠發生。如在本文中使用的，「固態支持物」指具有固定基質的組合物，該固定基質例如但不限於不溶物質、固相、表面、支持物、層、塗布層、紡織或無紡纖維、基質、晶體、膜、不可溶聚合物、塑料、玻璃、生物或生物相容性或生物蝕解性或生物可降解性聚合物或基質、微粒子或納米粒子。固態支持物包括，例如但不限於單層、多層、商品膜、樹脂、基質、纖維、分離介質、層析支持物、聚合物、塑料、玻璃、雲母、金、珠子、微球、納米球、矽、砷化鎵、有機和無機金屬、半導體、絕緣體、微結構和納米結構。微結構和納米結構可以包括但不限於超小型化、納米尺度和超分子探針、針尖、棒、釘、塞、杆、套管、金屬線、絲和管。如在本文中使用的，「間隔分子」指的是一個或多個核苷酸和/或非核苷酸分子、基團或間隔臂，其經選擇或設計用來連接兩個核苷酸或非核苷酸分子，優選用來改變或調節這兩個核苷酸或非核苷酸分子之間的距離。如在本文中使用的，「特異性結合」指的是配體與其特異性結合伴侶之間，或確定的序列節段與選定的分子或選定的核酸序列之間可測定且可再現的吸引的程度。該吸引的程度無需最大化而優化。微弱、中等或強烈吸引適合於不同的應用。在這些相互作用中發生的特異性結合為本領域中的技術人員所熟知。提到合成時，指的是序列片段、合成的核酸適體、合成的雜聚體、核苷酸配體、核苷酸受體、形狀識別元件以及特異性吸引表面。術語「特異性結合」可包括結構性形狀和表面特徵的特異性識別。在其他方面，特異性結合特指兩個分子(即特異性結合伴侶)之間的特異性、可飽和的、非共價性相互作用，可被第三個分子(即競爭劑)競爭性抑制，所述第三個分子與兩個特異性結合伴侶之一共有一種化學識別特性(即一種或多種相同的化學基團)或分子識別特徵(即分子結合特異性)。所述競爭劑可以為交叉反應物，或者抗體或其抗原的類似物、配體或其受體，或者核酸適體或其靶標。例如，抗體與其抗原之間的特異性結合可以被交叉反應性抗體或被交叉反應性抗原競爭性抑制。為了方便，術語「特異性結合」可用來近似或簡略表示既包括特異性結合又包括結構性形狀識別的特異性識別的亞類(子集)。如在本文中使用的，「支持物」當用在物質、結構、表面或材料時，是指一種包括非生物的、合成的、無生命的、平面的、球形的或扁平表面的組合物，迄今人們還不知道其包含特異性結合、雜交或催化識別位點或多個不同的識別位點或超過了構成所述表面、結構或材料的不同分子種類數目的多種不同的識別位點。所述支持物可包括例如但不限於半導體、合成(有機)金屬、合成的半導體、絕緣體和摻雜劑；金屬、合金、元件、化合物和礦物質；合成的、切割的、蝕刻的、平版印刷的、印刷的、工具機加工的和微裝配玻片(microfabricatedslides)、裝置、結構和表面；工業聚合物、塑料、膜；矽、矽酸鹽、玻璃、金屬和陶瓷；木、紙、卡紙板、棉花、羊毛、布、針織和非針織纖維、材料和織物；未通過分支/線性聚合物由固定探針分子而修飾的納米結構和微觀結構。如在本文中使用的，「靶探針結合」意思是兩種或多種分子(其中至少一個為選定的分子)以特異性方式彼此連接。典型地，第一個選定的分子可結合於第二種分子，該結合可以為間接的，例如通過插入間隔臂、基團、分子、橋、載體或特異性識別伴侶，或直接地，即無需插入間隔臂、基團、分子、橋、載體或特異性識別伴侶，通過直接結合比較有利。選定的分子可通過雜交特異性結合於核苷酸。用於核苷酸和非核苷酸分子軛合的其他非共價方式包括例如離子鍵合、疏水性相互作用、配體-核苷酸結合、螯合劑/金屬離子對或特異性結合對例如抗生物素蛋白/生物素、抗生物素蛋白鏈菌素/生物素、抗螢光素/螢光素、抗_2，4-二硝基苯酚(DNP)/DNP、抗過氧化物酶/過氧化物酶、抗地高辛/地高辛，或者更常見地，受體/配體。例如，受體分子(例如鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、半乳糖苷酶、脲酶、螢光素酶、羅丹明、螢光素、藻紅蛋白、發光氨(魯米諾，3-氨基苯二甲醯肼)、異發光氨、吖啶酯或螢光微球，其為了例如標記目的，利用抗生物素蛋白/生物素、抗生物素蛋白鏈菌素/生物素、抗螢光素/螢光素、抗過氧化物酶/過氧化物酶、抗DNP/DNP、抗地高辛/地高辛或受體/配體連接於選定的分子或選定的核酸序列(即非直接和共價連接)，則可通過特異性結合配對的方式軛合於選定的分子或選定的核酸序列。通過控制固定在AFM針尖和支持物表面上的DNA鏈之間的間隔，測定單個寡核苷酸的非結合和結合力。已觀察到可改善識別效率，通過選擇恰當的間隔可消除多重和/或次級相互作用。特別地，具有20、30、40和50個鹼基對的DNA雙鏈的非結合力的柱狀圖變尖，且代表單個雙鏈體的力。令人吃驚的是，還觀察到了結合的發生，且相應的力與所述非結合力一致。此外，觀察到兩種力隨著DNA鏈長度的增加而出現線性增加，且力測定足夠敏感，可區分單一的點突變。本發明提供用於原子力顯微鏡(AFM)的懸臂，包括具有固定端和自由端的懸臂體，所述自由端具有被樹枝狀大分子化學修飾的表面區域，其中所述樹枝狀大分子分支區的多個末端均結合於該表面，所述樹枝狀大分子的線性區的末端被功能化。在本發明的一個具體實施方式中，在懸臂游離末端附近提供至少一個錐形突起，所述突起是角錐形或圓錐形。圖2C中示出了多種類似結構的探針針尖。因此，可使懸臂的游離末端的表面區與特定突起相接觸或到達其附近，這樣，即可測定參照化合物分子之間的相互作用。所有類型的AFM懸臂均可用於本發明中，且對其無特殊限制。根據本發明所述的懸臂可用於所有類型的AFM，例如在圖1B和IC中示出的設備。圖1A示出了常見原子力顯微鏡的實例，圖2A是用於AFM的懸臂。可參照圖1A闡釋本發明的AFM0AFM系統10包括底座15、支架20(其中心位置有一個開口，固定於底座15)、固定於底座15的管狀壓電傳動器55。通過接線將電壓從控制器CO傳送至壓電傳動器，使得管狀壓電傳動器55在垂直方向即懸臂的厚度方向是可轉向的(由箭頭V2指出)。參照圖2A，懸臂50具有一個在支持物95的一個側面上形成壓電傳動器25的結構。懸臂的一個示例性具體實施方式，懸臂50包括懸臂底座90，其具有形成在絕緣層110上的電極10，其中絕緣層110層積在矩形支持物95上。所述懸臂可由本領域中已知用於AFM懸臂中的任何材料構建，包括S1、SiO2,Si3N4,Si3N4Ox^Al或壓電材料。懸臂的化學組成並不關鍵，優選為可易於微裝配且具有用於AFM測量的必要機械性能的材料。同樣，所述懸臂可以為本領域中用於AFM懸臂的任何大小和形狀。懸臂的大小優選長約從5微米至約1000微米，寬約從I微米至約100微米，厚約從0.04微米至約5微米。典型的AFM懸臂長約100微米，寬約20微米，厚約0.3微米。可對懸臂的固定端加以改造使得該懸臂適合傳統AFM的懸臂容納的部分與其形成的界面。懸臂的游離末端的表面區可通過矽烷試劑例如GPDES或TPU修飾用於用樹枝狀大分子進行處理。本發明的設備和方法不限於通過基於懸臂的AFM儀器而使用。描述本發明的聚合物時，可提到諸如化學式I的聚合物。化學式I權利要求1.一種用於原子力顯微鏡AFM的懸臂，包括具有固定端和自由端的懸臂體，其中所述自由端包括包含多個共價結合的樹枝狀大分子的表面區域的錐形突起，其中每一個樹枝狀大分子包含分支區和單個線性區，並且其中每個樹枝狀大分子的所述分支區的多個末端共價結合於所述表面區域，並且每個樹枝狀大分子的所述單個線性區的末端被功能化，並且樹枝狀大分子的線性官能團以0.1nm至IOOnm的固定間隔隔開。2.根據權利要求1所述的懸臂，其中所述突起是角錐形或圓錐形的。3.根據權利要求1所述的懸臂，其中所述樹枝狀大分子的所述線性官能團以IOnm的固定間隔隔開。4.根據權利要求1所述的懸臂，其中所述分支區的末端通過由_C(=O)-、-NR-、-O-、和_PR2」-組成的一組基團被共價連接於所述表面，其中R是氫或烷基、並且R」是H、烷基或烷氧基。5.根據權利要求1所述的懸臂，其中所述線性區包括間隔區。6.根據權利要求5所述的懸臂，其中通過第一官能團將所述間隔區連接於所述分支區。7.根據權利要求6所述的懸臂，其中所述官能團選自由-NH-、-O-、-PH2-,-COO-,和-S-組成的組。8.根據權利要求5所述的懸臂，其中所述間隔區包含共價結合於所述第一官能團的連接區。9.根據權利要求6所述的懸臂，其中所述連接區包括取代或未取代的亞烷基、亞烯基、亞炔基、環亞烷基、亞芳基、醚、聚醚、酯或亞氨烷基。10.根據權利要求5所述的懸臂，其中所述間隔區包括第二官能團。11.根據權利要求10所述的懸臂，其中所述第二官能團選自由-NH-、-O-、-PH2-、-C00-、和-S-組成的組。12.根據權利要求10所述的懸臂，其中所述第二官能團位於所述線性區的末端處，以使得所述第二官能團將所述線性區共價連接於所述分支區。13.根據權利要求1所述的懸臂，其中存在於所述線性區的所述末端處的所述官能團包含保護基團。14.根據權利要求13所述的懸臂，其中所述保護基團是酸不穩定的或鹼不穩定的。15.根據權利要求1所述的懸臂，其中探針核苷酸或配體結合於存在於所述樹枝狀大分子的線性區的末端處的所述官能團。16.根據權利要求15所述的懸臂，其中所述探針核苷酸或配體以0.01探針/nm2至0.5探針/nm2範圍的低密度存在。17.根據權利要求15所述的懸臂，其中所述探針核苷酸是DNA、RNA、或其組合。18.根據權利要求17所述的懸臂，其中所述探針核苷酸是寡核苷酸。19.根據權利要求17所述的懸臂，其中所述探針核苷酸是cDNA。20.一種用於製造根據權利要求1所述的懸臂的方法，包括(i)功能化所述懸臂的表面區域，使得所述懸臂的表面區域可與所述樹枝狀大分子末端起反應；以及(ii)使所述樹枝狀大分子接觸所述表面區域以便所述末端與所述表面成鍵。21.根據權利要求20所述的用於製造懸臂的方法，其中探針核苷酸或配體固定於所述樹枝狀大分子線性區的末端，包括以下步驟i)從在所述表面區域上所述樹枝狀大分子線性區的末端去除保護基團；以及ii)將所述探針核苷酸、配體或連接於所述探針核苷酸或配體的連接分子接觸所述支持物上樹枝狀大分子線性區的末端，從而使所述探針核苷酸、配體或連接分子與所述末端成鍵，其中所述連接分子是同雙官能或異雙官能連接子。22.一種利用原子力顯微鏡AFM測定單個探針核苷酸與單個靶核苷酸之間相互作用的設備，所述設備包括:權利要求1所述的懸臂，其中所述探針核苷酸連接於存在於所述樹枝狀大分子線性區的末端處的官能團；固態支持物，包含多個樹枝狀大分子的單層，其中每一個樹枝狀大分子包含分支區和單個線性區，並且其中每一個所述樹枝狀大分子的所述分支區的多個末端共價連接於所述固態支持物表面，並且其中靶核苷酸連接於存在於所述樹枝狀大分子線性區的末端處的官能團；控制器，用於調節所述懸臂相對於所述靶核苷酸支持物的位置和方向，足以引起固定於所述懸臂的所述樹枝狀大分子修飾的表面區域上的所述探針核苷酸與固定於所述支持物上的所述靶核苷酸之間的相互作用；以及檢測器，用於測定與所述探針核苷酸和所述靶核苷酸之間的相互作用相關的物理參數。23.一種分析靶核苷酸與探針核苷酸相互作用的方法，所述方法包括以下步驟:(a)提供具有固定端和自由端的懸臂，所述自由端的表面區域由樹枝狀大分子進行化學修飾，其中所述樹枝狀大分子分支區的多個末端結合於權利要求1所述的表面；(b)將靶核苷酸固定於支持物上；(C)化學修飾所述懸臂的樹枝狀大分子修飾的表面區域，以固定探針核苷酸；(d)將所述支持物和所述懸臂連接於包含控制器的設備，所述控制器用於調節所述支持物和所述懸臂的相對位置和方向，以引起固定於所述懸臂的樹枝狀大分子修飾的表面區域上的所述探針核苷酸與固定於所述樣品支持部件的支持物上的所述靶核苷酸之間的相互作用；(e)控制所述懸臂和所述支持物的相對位置和方向，以引起探針核苷酸與所述靶核苷酸之間的相互作用；以及(f)測定與所述探針核苷酸和所述靶核苷酸之間相互作用相關的物理參數。24.根據權利要求23所述的方法，其中所述探針核苷酸是單鏈DNA或RNA，所述靶核苷酸是DNA或RNA的互補鏈或鹼基錯配鏈。25.根據權利要求23所述的方法，其中在步驟(b)中，所述支持物由樹枝狀大分子進行化學修飾，以將靶核苷酸固定於其上。26.—種通過原子力顯微鏡AFM測定一個配體與一個靶受體之間相互作用的設備，所述設備包括:根據權利要求1所述的懸臂，其中，所述配體連接於存在於所述樹枝狀大分子線性區的末端處的官能團；固態支持物，包含多個樹枝狀大分子的單層，其中每一個樹枝狀大分子包含分支區和單個線性區，並且其中每一個所述樹枝狀大分子的所述分支區的多個末端共價連接於所述固態支持物表面，並且其中靶受體連接於存在於所述樹枝狀大分子的線性區的末端處的官能團；控制器，用於調節所述懸臂相對於所述靶受體支持物的位置和方向，足以引起固定於所述懸臂的樹枝狀大分子修飾的表面區域上的所述配體與固定於所述支持物上的所述靶受體之間的相互作用；以及檢測器，用於測定與所述配體和靶受體之間相互作用相關的物理參數。27.一種分析靶受體與配體相互作用的方法，所述方法包括以下步驟:(a)提供具有固定端和自由端的懸臂，所述自由端具有由樹枝狀大分子進行化學修飾的表面區域，其中所述樹枝狀大分子分支區的多個末端結合於權利要求1所述的表面；(b)將配體固定於支持物上；(C)化學修飾所述懸臂的樹枝狀大分子修飾的表面區域，以固定配體；(d)將所述支持物和所述懸臂連接於包含控制器的設備，所述控制器用於調節所述支持物和所述懸臂的相對位置和方向，以引起固定於所述懸臂的樹枝狀大分子修飾的表面區域上的所述配體與固定於所述樣品支持部件的所述支持物上的所述靶受體之間的相互作用；(e)控制所述懸臂和所述支持物的相對位置和方向，以引起配體與所述靶受體之間的相互作用；以及(f)測定與配體和所述靶受體之間相互作用相關的物理參數。專利摘要本專利申請描述了一種用於原子力顯微鏡(AFM)的懸臂，包括具有固定端和自由端的懸臂體，所述自由端具有被樹枝狀大分子化學修飾的表面區域，其中所述樹枝狀大分子的分支區的多個末端均結合於該表面，並且樹枝狀大分子的線性區的末端被功能化。文檔編號G01Q60/24GKCN101322030B發布類型授權專利申請號CN200680036706公開日2013年6月19日申請日期2006年8月14日發明者樸準遠,鄭瑜*,洪鳳振,金鎰弘,樸振圭,柳成浩,李惠映申請人:浦項工科大學,Posco公司導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan專利引用(2),