能夠結合轉化生長因子β1(TGF－β1)的肽的製作方法

2023-09-11 01:25:10

專利名稱：能夠結合轉化生長因子β1(TGF－β1)的肽的製作方法
技術領域：
總體上，本發明涉及一些具有結合轉化生長因子β1(TGF-β1)能力的肽及其應用。特別是，因為所述的肽直接結合到TGF-β1上，因此本發明涉及一些抑制TGF-β1的生物活性的肽，及其在與TGF-β1的過度或失調表達相關的疾病或病理變化的治療中的應用。
背景技術：
TGF-β1是屬於在結構上相關的調節蛋白(細胞因子)超家族的糖蛋白，其是哺乳動物體內所描述的三種異構體(TGF-β1，2和3)之一。最豐富的異構體是TGF-β1，它是由25kDa同型二聚體組成，該同型二聚體是由二硫鍵結合的兩個亞基組成。人的TGF-β1的胺基酸序列已經由一些作者公開，例如Derynck K等人「在正常細胞和變異細胞中人的轉化生長因子-beta互補DNA序列和表達」Nature.316(6030)，701-705(1985)。
TGF-β1是在進化過程中具有高度保護序列的分子。雖然它最初通過其誘發粘附的能力來定義，該粘附不依賴於大鼠的纖維原細胞的增殖和形態學改變，但是後來的研究顯示TGF-β1是廣泛的細胞類型增殖的普遍抑制劑。該分子可在細胞分化的全部階段中，由不同組織的各種類型的細胞生成。它具有一系列的生物效應，能產生與發育、生理和免疫應答有關的有效的和通常為相反的效應。關於TGF-β1在肝再生和分化以及肝纖維化中的作用的信息，以及該分子對細胞外基質的作用的信息可參見西班牙專利申請第ES 2146552 A1號。
為了研究TGF-β1的作用機理，已報導某些十種蛋白質(膜受體和細胞外基質蛋白)與該細胞因子相互作用。
另一方面，因為許多疾病或病理改變與TGF-β1的過度或失調表達相關，例如，與組織或器官的功能喪失相關的纖維化、或者外科的或美學上的併發症，因此引起了對尋找能抑制TGF-β1生物活性的產物的關注，因為該產物有可能應用到人或動物的治療中，阻斷因TGF-β1過度或失調表達引起的病理結果。
一些方法已用於抑制TGF-β1的生物活性中，包括下列應用(i)特異的中和抗體；(ii)編碼TGF-β1基因的反義寡核苷酸序列，它阻斷TGF-β1表達；或(iii)TGF-β1的可溶性受體，它以與抗體相似的方式作用。所述抗體的應用能夠全部和特異的阻斷該細胞因子(TGF-β1)，雖然血液中存在外源性免疫球蛋白和來源於TGF-β1全身阻斷作用的兩方面加強了其某些副作用。另外，免疫球蛋白隨時間的穩定性不允許短時間內控制該細胞因子的活性阻斷。反義寡核苷酸序列在基因表達水平上產生抑制TGF-β1-事實是產生了重要的所述細胞因子參與的所有生物過程的失調。
最近已開發另一個策略，該策略基於能抑制TGF-β1的生物活性的肽的應用。以此方式，西班牙專利公開第ES214652號公開了一些源於TGF-β1及其受體的、或者源於能結合TGF-β1的蛋白質的合成肽，該合成肽可作為TGF-β1生物活性的抑制劑使用。

發明內容
總體上，本發明解決了尋找能抑制TGF-β1生物活性的新化合物的問題。
本發明提供的技術方案是基於一個事實發明者鑑別一系列不僅能結合TGF-β1而且通過直接結合TGF-β1能抑制TGF-β1生物活性的肽。這些肽中的一部分通過應用噬菌體展示多肽庫相關技術來鑑別，該文庫允許識別具有6-15個胺基酸的典型大小、能以高度的親和性結合TGF-β1的肽，並隨後通過體外和體內試驗分析它們抑制TGF-β1生物活性的能力來定量。其它的肽通過先前應用與噬菌體庫相關的技術識別的肽的平截獲得。
能結合TGF-β1的肽、以及特別是那些通過直接結合到TGF-β1上能抑制TGF-β1生物活性的肽，能夠潛在用於對治療與TGF-β1的過度或失調表達相關的疾病和病理改變。類似地，能結合TGF-β1的肽提供了研究TGF-β1生物學作用的工具(在不同生物過程調節的許多領域中，TGF-β1的生物學作用仍然有待闡明)。
因此，本發明的一方面涉及能結合TGF-β1的肽。在具體和優選的實施方案中，這些肽也能抑制TGF-β1的生物活性。
另一方面，本發明涉及包含至少一種所述的肽的藥物組合物。
另一方面，本發明涉及所述的肽在藥物組合物製備中的應用，該藥物組合物用於治療與TGF-β1過度或失調表達相關的疾病和病理改變。與TGF-β1過度或失調表達相關的這類疾病或病理改變的代表性例子包括與組織或器官的功能喪失相關的纖維化，以及外科的和/美學上的併發症。
另一方面，本發明涉及編碼所述肽的DNA序列。
另一方面，本發明涉及包括編碼本發明所提供肽的DNA序列的DNA構建。
另一方面，本發明涉及包括所述DNA序列或DNA構建的載體。
另一方面，本發明涉及宿主細胞，例如轉化的宿主細胞，該宿主細胞包括所述DNA構建或載體。
另一方面，本發明涉及產生本發明提供的肽的方法，包括在允許所述肽表達的條件下培養所述宿主細胞，並且，如果需要，回收所獲得的肽。
另一方面，本發明涉及DNA序列和DNA構建在載體和細胞的製備中的應用，該載體和細胞通過基因治療技術治療與TGF-β1過度或失調表達相關的疾病和病理改變。
附圖簡要說明

圖1示意性地顯示所述的15-胺基酸(aa)肽在絲狀噬菌體M13表面的位置，該15-胺基酸(aa)肽遺傳學地融合於蛋白pIII。
圖2示意性地顯示所述的插入片段在M13噬菌體的基因組的基因位置，該插入片段編碼15-aa肽，以及在蛋白pIII的序列中所述的肽的位置。
圖3示意性地顯示根據所述的「生物淘選」技術選擇所述的肽。生物素醯化的TGF-β1固化在含有鏈黴抗生物素的平板上(通過生物素-鏈親和素鍵聯)。根據在TGF-β1與噬菌體展示的肽之間的相互作用，從所述的噬菌體庫中選擇噬菌體。通過洗滌排除對TGF-β1具有低親和性的噬菌體。通過降低所述的pH值洗脫留在所述的平板中的噬菌體。三個周期的強化對TGF-β1具有高度親和性的噬菌體後，分離和測序所述噬菌體(見實施例1)[對圖3的說明「a」展現15-aa肽的噬菌體庫；「b」在E.coli(K91Kan)(擴增)中感染；「c」所述噬菌體的純化；「d」減少TGF-β1濃度的所述噬菌體的孵育；「e」洗滌；「f」所述的結合噬菌體的洗脫(↓pH)；「g」在E.coli菌株中感染；「h」感染的菌落(四環素)的選擇；「i」所選擇的噬菌體的擴增；和「j」在三次「生物淘選」周期後測定DNA序列(對應所述的肽)]。
圖4表示通過噬菌體展示多肽庫識別的所述15-aa肽序列類推樹。
圖5所示為TGF-β1濃度對Mv-1-Lu細胞株生長作用的圖解說明，按照每分鐘計數(c.p.m.)的氚標記的胸苷的攝取量表示。
圖6所示為所述急性肝損傷誘導方案的圖解說明(見實施例3)。
本發明的詳細說明一方面，本發明涉及肽，下文指本發明所述的肽，該肽的胺基酸序列包括的3-15個連續胺基酸殘基的胺基酸序列選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ IDNO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQID NO20，SEQ ID NO21和SEQ ID NO22，及其藥物可接受的鹽。
本發明所述的肽能結合TGF-β1。這些肽的一些能在體外和/或體內抑制TGF-β1的生物活性。
通過任何能測定兩分子間結合的適當的方法評價本發明所述的肽結合TGF-β1的能力，例如，通過親和分析方法，該分析方法包括在使所述的肽結合到TGF-β1的條件下將TGF-β1與所測試的肽相接觸；並且評價所述的肽和TGF-β1間的結合。在具體的實施方案中，通過用放射性標記的TGF-β1完成該親和分析，例如，在專利申請ES 2146552 A1中公開的人125I-TGF-β1。可選擇地，所測試的肽可以是標記的組分。一般而言，這種親和分析包括將TGF-β1與欲測定其親和性的肽相接觸(例如，固定在用鏈黴抗生物素封閉的平板上)，孵育適當的孵育期後，分析所述的肽與TGF-β1的結合。通過洗滌排除對TGF-β1具有低親和性的所述的肽，而具有高親和性的肽仍結合到TGF-β1上，並且通過破壞所述的兩分子之間的分子相互作用(例如，通過降低pH值)游離。通過測試所述的肽對不同濃度的TGF-β1的結合，或者反之亦然，可以獲得所測試的肽對TGF-β1的親和性的概念。可以評價本發明所述的肽在體外抑制TGF-β1的生物活性的能力，並且如果需要，通過Mv-1-Lu細胞株生長抑制實驗定量化，該細胞株來源於貂的肺上皮細胞並且該細胞株的增殖被TGF-β1抑制(見實施例2)。
可被評價本發明所述的肽在體內抑制TGF-β1生物活性的能力，並且如果需要，通過急性肝損傷動物模型體內測試定量化，例如通過四氯化碳(CCl4)給藥來誘導該急性肝損傷(見實施例3)。已知，急性損傷產生效應和生理反應的級聯反應包括TGF-β1水平的增長，其因此引起I型膠原基因表達(在其它作用之中)。
本發明的範圍包括本發明所述肽的藥物可接受的鹽。術語「藥物可接受的鹽」包括慣於形成金屬鹽或酸加成鹽的那些鹽。只要所述的鹽是藥物可接受的，則該鹽的性質不是關鍵性考慮因素。本發明所述肽的藥物可接受的鹽可根據本領域的技術人員公知的常規方法，從酸或鹼(有機的或無機的)中獲得。
在具體的實施方案中，本發明提供了包含胺基酸序列的3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個連續胺基酸殘基的肽，所述胺基酸的序列選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21和SEQ ID NO22及其藥物可接受的鹽。
在其它具體的實施方案中，本發明提供了肽，該肽選自下列序列號的肽SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21和SEQ ID NO22及其藥物可接受的鹽。
在其它具體的實施方案中，本發明提供了肽，該肽選自下列序列號的肽SEQ ID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26，SEQ ID NO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ ID NO31，SEQID NO32，SEQ ID NO33，SEQ ID NO34，SEQ ID NO35和SEQ IDNO36及其藥物可接受的鹽。這些肽包括序列號為SEQ ID NO17的所述肽的9-14個胺基酸序列的連續胺基酸殘基，並且通過所述的肽的平截獲得(實施例4)。
在其它具體的實施方案中，本發明提供了肽，該肽選自下列序列號的肽SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQID NO11，SEQ ID NO14，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO33和SEQ ID NO34及其藥物可接受的鹽。序列號為SEQ ID NO4，SEQID NO6，SEQ ID NO11，SEQ ID NO14和SEQ ID NO17的肽顯示了在體外和體內抑制TGF-β1生物活性的能力；序列號為SEQ ID NO2的肽顯示只在體內抑制TGF-β1生物活性的活性；而序列號為SEQ IDNO3和SEQ ID NO18的肽顯示只在體外抑制TGF-β1生物活性的活性。序列號為SEQ ID NO33和SEQ ID NO34的肽顯示在體外抑制TGF-β1的生物活性的活性。
為了初步識別具有結合TGF-β1的能力的肽，應用涉及噬菌體展示多肽庫技術，該多肽庫能夠測定對TGF-β1具有高親和性的肽，並且隨後在體外和在體內定量化它們抑制TGF-β1生物活性的能力。結合TGF-β1並在體外或體內抑制TGF-β1生物活性的所述肽的序列可以在各種「生物淘選」周期(通常為3次)後從相應的DNA序列中導出。識別某些產物的抑制劑的噬菌體展示多肽庫的用途已經由下列作者公開，例如，Chirinos-Rojas C.L.等人.，Immunology，1999，Jan.96(1)109-113；McConnell S.J.，等人.，Gene，1994，Dec.30，151(1-2)115-118；或SmithG.P.，Sciences，1985，Jun.14，228(4705)1315-1317。
因此，本發明提供了用於識別能結合TGF-β1的肽的方法，其包括(i)應用包含多個絲狀噬菌體的噬菌體展示的多肽庫，每一個噬菌體的基因組包含編碼不同肽的核苷酸序列，該不同肽的核苷酸序列連接編碼噬菌體包膜蛋白的基因(因此每一個噬菌體包含遺傳學融合噬菌體包膜蛋白的不同的肽)；(ii)通過親和分析篩選噬菌體，該噬菌體包含以增強的親和性結合TGF-β1的肽；並且(iii)根據相應的DNA序列，測定結合TGF-β1的所述肽的序列，該DNA序列插入到在步驟(ii)中篩選的所述噬菌體並且編碼結合TGF-β1的所述肽。
在具體的實施方案中，為了獲得15-aa肽，該15-aa肽能以高親和性結合TGF-β1並且對所述的細胞因子的生物活性也具有最終的抑制活性，應用包含多個絲狀噬菌體(M13)的噬菌體展示的多肽庫，每一個噬菌體包含遺傳學融合到該噬菌體包膜蛋白的不同的15-aa肽，此時15-aa肽結合到所述包膜蛋白pIII的N-末端。這樣所述的噬菌體展現了具有在5個表面蛋白分子的每個中的15-aa肽的表面，而編碼所述肽序列的DNA包含在所述噬菌體內。在所述噬菌體庫中，編碼所述肽的序列來源於含20個天然胺基酸的15個位點的每一個中被兼併的序列，因此在不同的噬菌體中允許存在15胺基酸的1.1×1012個可能的序列。在所述的肽序列和在所述的噬菌體內編碼肽序列的DNA之間物理比例為1∶1，這允許(從廣泛的變體中)選擇特異地結合TGF-β1的那些序列。該方法通過親和分析完成。
在具體的實施方案中，所提到的親和分析包括稱為「生物淘選」的離體篩選方案。簡而言之，該技術包括，在用鏈黴抗生物素封閉的並加入生物素醯化的TGF-β1的平板中，孵育一組在實踐中代表所有15-aa肽變體(在此情況下)的噬菌體。因此通過生物素-鏈親和素結合將生物素醯化TGF-β1錨定在所述的平板中，由此正確地顯示TGF-β1與所述噬菌體攜帶的肽之間的相互作用。孵育後，通過洗滌去除非結合的噬菌體，然後通過降低pH值特異地洗脫所述特別結合的噬菌體，該降低pH值是破壞TGF-β1與所述噬菌體展示肽之間的分子相互作用的操作。被洗脫的噬菌體然後通過在菌株中感染被放大。該操作重複3個周期，因此完成了所述噬菌體的含量的富集，該噬菌體以高親和性特異地結合TGF-β1。用於封閉所述平板的生物素醯化TGF-β1的濃度在每一次周期中逐漸地減少，例如從2.5到0.01，並且最終到0.001μg/ml。因此，在此過程結束後，通過引物來測序根據對TGF-β1的親和性而篩選出噬菌體。這允許獲得所述噬菌體展現的肽序列。
實施例1顯示通過噬菌體庫篩選結合TGF-β1的肽，「生物淘選」篩選，以及序列測定以高度的親和性結合TGF-β1的肽。
本發明也提供了用於識別能結合TGF-β1的肽的技術，該技術包括能結合TGF-β1的肽的平截，隨後測試這些截短的肽結合TGF-β1的能力。該截短的肽可通過任何常規方法獲得，例如在N-末端或C-末端處截短的肽形式的化學合成法(考慮到它們的大小)。可應用表現兩分子之間結合特徵的任何恰當的方法來測定這些截短的肽結合TGF-β1的能力，例如，親和分析，該方法包括在允許所述肽結合TGF-β1的條件下將TGF-β1與所測試的肽相接觸，並且評價所述肽對TGF-β1的結合，這已在上文中提及。同樣，這些截短的肽在體外和/或在體內抑制TGF-β1生物活性的能力通過本說明書所述任何方法測試。
由於TGF-β1在許多生物過程中發揮作用，本發明所述的肽抑制TGF-β1活性導致了治療與過度的或失調的TGF-β1表達相關的疾病和病理改變的藥物的潛在開發，因為這樣的肽能阻斷被該細胞因子過度或失調表達誘導的損害。
因此本發明所述的肽能用於治療與過度的或失調的TGF-β1表達相關的疾病或病理改變，例如(i)與器官或組織功能喪失相關的纖維化，例如，肺纖維化、肝纖維化(肝硬化)、腎纖維化、角膜纖維變性等等；以及(ii)外科的和/或美學上的併發症，例如，與皮膚和腹膜外科手術相關的纖維化、與燒傷相關的纖維化、骨關節纖維化、瘢痕瘤等等。
因此，在另一方面，本發明涉及藥物組合物，該藥物組合物包括治療有效量的本發明的肽和至少一個藥物可接受的賦形劑。本發明提供的該藥物組合物包含一個或多個本發明的肽，任選地與一個或多個可選擇的抑制TGF-β1的化合物結合。該藥物組合物用於對人體或動物體的給藥和/或應用(在前者中是優選的)。
替代抗體或反義寡核苷酸序列，諸如本發明的那些肽的肽應用具有許多優點，因為它們是具有較高擴散電勢和較短半衰期的小分子。雖然它們比抗體較快地降解，所述的肽對TGF-β1顯示高的親和性，然而，副作用可通過劑量來控制。與其它類型的化合物相比，所述的肽也較容易地運輸到靶器官和組織。
本發明所述的肽可通過任何方法給藥來治療與過度或失調的TGF-β1表達相關的疾病和病理改變，所述方法將本發明所述的肽與該肽在人體內或動物體內的作用位點或靶相接觸。存在於本發明所提供的藥物組合物中的肽、衍生物或藥物可接受的鹽的量可以在相當大的範圍內改變。
應用本發明所述的肽和/或藥物組合物治療與過度或失調的TGF-β1表達相關的疾病或病理改變的劑量，依賴於很多因素-包括患者的年齡、狀態、背景病症或病理學改變的嚴重性，以及本發明包括的肽的給藥途徑和頻率。
包含本發明所述的肽的藥物組合物可以組方成任何給藥形式，例如，固體或液體，並且通過任何適當的途徑給藥，例如，口服、非腸道、直腸的或局部給藥。為了此效應，必須包括合適的給藥形式的製劑所需要的可接受的藥物賦形劑，例如藥膏(油脂凝膠、水凝膠等)、滴眼劑、噴霧氣溶膠、可注射的溶液、滲透泵系統等等。關於該效應所需要的不同藥物劑型的綜述和所述賦形劑的綜述可參見下列文件例如，「Tratado de Farmacia Galénica」，C.Faulíi Trillo，1993，Luzán 5，S.A.Ediciones，Madrid.出版物。
本發明所述的肽在所述的藥物組合物的製造中的應用構成本發明的另外部分。因此，在另一方面，本發明涉及了本發明所述的肽在藥物組合物的製造中的應用，該藥物組合物用於治療與過度或失調的TGF-β1表達相關的疾病或病理改變，例如與器官或組織功能喪失相關的纖維化，例如，肺纖維化、肝纖維化(肝硬化)、腎纖維化、角膜纖維變性等等；和外科的和/或美學上的併發症，例如，與皮膚和腹膜外科手術相關的纖維化、與燒傷相關的纖維化、骨關節纖維化、瘢痕瘤等等。
本發明所述的肽可通過常規方法獲得，例如通過固相化學合成，用高效液相色譜法(HPLC)純化，以及如果需要，通過常規技術分析，例如序列測定和質譜分析法、胺基酸分析、核磁共振技術等等。
可選擇地，本發明所述的肽可通過重組DNA技術獲得。因此，在另一方面，本發明產生編碼本發明所述的肽的DNA序列。所述的DNA序列可容易地從所述的肽的胺基酸序列中導出。
所述的DNA序列可以包含在DNA構建中。因此，本發明產生包含DNA序列的DNA構建，該DNA序列編碼本發明所述的肽。為了表達編碼本發明所述的肽的DNA序列，該DNA構建可操作性地加入調節序列。控制序列是控制和調節本發明所述的肽的轉錄和(可應用地)翻譯的序列；它們包括啟動子和終止子序列等，該序列在轉化宿主細胞中是有功能的並且包括所述的DNA序列或DNA構建。在具體的實施方案中，所述的控制表達序列在細菌中是有功能的。有利的是該DNA構建也包括標記或編碼Motif(功能片段)或表型的基因，該Motif或表型使得能夠篩選該DNA構建轉化的宿主細胞。本發明提供的DNA構建可通過本領域公知的方法獲得[Sambrook等人，「分子克隆，實驗室手冊」，第二版，美國冷泉港實驗室雜誌，紐約，1989年卷1-3]([Sambrook etal.，「Molecular cloning，a Laboratory Manual」，2nded.，Cold Spring HarborLaboratory Press，N.Y，1989 Vol.1-3])。
本發明提供的DNA序列或DNA構建可插入在適當的載體中。因此，在另一方面，本發明涉及包含所述的DNA序列或DNA構建的載體，例如表達載體。載體的選擇將依賴於它隨後要插入的宿主細胞。例如，所述的DNA序列所插入的載體可以是緊接著插入到所述細胞中的質粒或者是載體，其可以或可以不整合到所述的細胞的基因組。所述的載體可通過技術人員已知的常規方法獲得。[Sambrok等人，1989，引用上文]。
在另一方面，本發明涉及宿主細胞，例如，包含本發明所述的DNA序列或DNA構建的轉化的宿主細胞。
在另一方面，本發明涉及產生本發明所述的肽的方法，該方法包括在允許產生本發明所述的肽的條件下，使具有本發明所述的DNA序列或DNA構建的宿主細胞生長，並且如果需要，恢復本發明所述的肽。關於優化培養所述宿主細胞的條件將依賴於使用的宿主細胞的類型。如果需要，產生本發明所述的產生肽的方法包括所述肽的分離和純化。
在另一方面，本發明涉及這些DNA序列和DNA構建在載體和細胞的製造中的應用，該載體和細胞通過基因療法治療與過度或失調的TGF-β1表達相關的疾病和病理改變。根據本發明的這部分內容，將這些DNA序列或DNA構建與遺傳轉移載體(例如，病毒或非病毒載體)相接觸。為了實施本發明的這部分內容，適當的病毒載體包括但不局限於下列載體腺病毒、與腺相關、逆轉錄病毒、慢病毒屬、α病毒、皰疹病毒屬、冠狀病毒衍生的載體等等。為了實施本發明這部分內容，恰當的非病毒載體包括但不局限於裸露DNA，脂質體、多胺、樹狀聚體、陽離子的糖聚合物、脂質體-多聚陽離子複合物、蛋白質、受體介導的遺傳輸送系統等等。
以下實施例舉例說明本發明，不應理解為對本發明的限制。
實施例1應用噬菌體展示的多肽庫選擇結合TGF-β1的肽。
為了獲得能以高度的親和性結合TGF-β1並且對所述細胞因子的生物活性提供可能的抑制活性的15胺基酸的序列，應用了基於噬菌體展示多肽庫技術中開發的離體篩選技術。這些庫包含多數絲狀噬菌體(M13)，每一個噬菌體包含遺傳學融合至所述病毒包膜蛋白的肽-在此情況下該肽結合到包膜蛋白pIII的N-末端(圖1)。這樣，所述的噬菌體在每個5拷貝的表面蛋白pIII的表面上展示15-aa肽，而編碼所述肽的DNA序列包含在所述噬菌體中。在所述的噬菌體庫中，在所述噬菌體庫中，編碼所述肽的序列來源於含20個天然胺基酸的15個位點的每一個中被兼併的序列，所述肽序列和所述的噬菌體內編碼肽序列的DNA之間物理比例為1∶1，這允許(從廣泛的變體中)選擇特異地結合TGF-β1的那些序列。該方法通過被稱為「生物淘選」的體外篩選方案完成。
用於本實施例的所述的噬菌體展示庫來源於由T.Nishi，H.Tsuri和H.Saya[Exp.Med.(Japan)11，1759(1993)]公開的初級庫的第二次擴增，並且通過George P.Smith實驗室提供。該技術的其它信息可在以下網站中獲得http//www.biosci.missouri.edu/smithgp/PhageDisDlayWebsite/PhageDisplayWebsiteIndex.html篩選技術(「生物淘選」)該技術包括在用鏈黴抗生物素封閉的(在0.1M NaHCO3中有10μg/ml的鏈黴抗生物素，在室溫下持續2小時)並加入生物素醯化的TGF-β1的平板中孵育一組(在實際作用)代表所有15-aa變體的噬菌體。所述的生物素醯化的TGF-β1通過生物素-鏈親和素相互作用錨定在該平板中，因此它能夠正確展示其與所述噬菌體攜帶的肽間的相互作用。TGF-β1以3×104病毒/ml的濃度接觸所述噬菌體攜帶的肽。在大約孵育12小時後，用PBS/Tween(磷酸鹽緩衝液/去水山梨糖醇脂肪酸酯的聚氧化烯衍生物)通過5次洗滌去除非結合的噬菌體。然後通過降低pH(洗脫緩衝液)洗脫結合的噬菌體，降低pH破壞TGF-β1與所述噬菌體展示的肽之間的相互作用。然後通過在菌株(E.coli)中的感染擴增被洗脫的噬菌體。所述方法重複三個周期由此完成噬菌體量的富集，該噬菌體以高親和性特異地結合TGF-β1(圖3)。用於封閉所述平板的生物素醯化的TGF-β1的濃度在每一次周期中逐漸地減少，例如從2.5到0.01，並且最終到0.001μg/ml。因此，在每一周期中篩選的噬菌體展示了對TGF-β1越來越高的親和性。感染E.coli細胞後，通過四環素抗藥性分離遺傳學修飾的噬菌體，隨後在此方法結束後，隨後用引物測序根據TGF-β1的親和性篩選的噬菌體。這能夠獲得在所述噬菌體中展示的肽序列，從分離的菌落中獲得大量克隆的該噬菌體。在總的測序克隆中，與每一個克隆所攜帶的15胺基酸的肽相對應的序列複製的倍數是所述的15胺基酸序列對TGF-β1的相對親和性水平的一個指徵。
肽的序列在細菌抗菌素存在下通過篩選所述噬菌體感染的細菌菌落來完成從所述「生物淘選」中獲得的克隆的篩選；通過由所述噬菌體基因組編碼的四環素抗藥性基因獲得所述細菌的耐藥性。因此，只有用噬菌體感染的那些菌落能生長。這表示每一個菌落包含編碼在其表面存在的唯一的一個肽的唯一一個所述噬菌體的基因組。
從「生物淘選」的最後一次篩選周期中獲得總數為108的噬菌體感染的細菌菌落。應用序列號為SEQ ID NO23的引物來完成編碼存在於所述pIII蛋白中的肽的區域的序列。如表1所示，提供了不同的肽序列。該表也反映了攜帶所述序列的菌落(克隆)數。
表1.結合TGF-β1的噬菌體中的胺基酸序列

各序列的克隆(菌落)數顯示所述的肽對TGF-β1的親和性程度的近似指徵，也就是，越多的菌落表示越高的親和性。但是，親和性程度與所述肽阻斷TGF-β1生物活性的能力不相關。實際上，最有活性的、序列號為SEQ ID NO17的(見表2和表3)肽由3個克隆表示，然而序列號為SEQ ID NO3的通過41個克隆表示的肽在急性肝損傷分析中具有更差的活性(見表3)。由於沒有與任何具體理論相關聯，該觀察可能通過下列假設闡明最活性的肽可能阻斷TGF-β1與其受體間的結合。
肽序列的比較用CLUSTAL W程序(1.81)分析獲得的所述序列。該程序根據胺基酸序列類推產生多序列分簇。根據所述的肽序列的類推，肽因而成簇在不同的結構家族中(圖4)。根據這些類推，可能暗示較少的TGF-β1結合基序或者結合不同的TGF-β1區域的肽的簇。
實施例2通過應用Mv-1-Lu細胞增殖分析中的肽體外抑制TGF-β1的生物活性細胞株Mv-1-Lu(CCL-64，美國典型細胞培養物，Virginia，USA)來源於貂的肺上皮細胞，作為單細胞層生長，並且通過減少它的增殖來反映TGF-β1的存在(圖5)。因此，所述的肽介導的該細胞因子的抑制能恢復細胞生長並且反映不同的肽在體外抑制TGF-β1的生物活性的能力。根據常規操作通過肽合成獲得所測試的肽(Merrifield RB.美國化學會雜誌1963；852149-2154；Atherton E等人，J Chem Soc Perkin Trans1981；1538-546)。
所述的Mv-1-Lu細胞在37℃下，在有5％CO2的162cm2瓶(CostarCorporation，CA，USA)中的完全培養基[RPMI-1640，含L-穀氨醯胺、丙酮酸鈉鹽、抗生素和10％胎牛血清(FBS)]中培養成為融合單層。胰蛋白酶化後，將細胞以5000細胞/孔的起始密度接種在96孔板中的200μl完全培養液中，37℃，5％CO2培養6小時確保粘附。然後，加入不同濃度的欲測試的肽和加入起始濃度為200μg/ml、隨後濃度為200pg/ml的TGF-β1(Roche)。在孵育12小時後，加入25μl乾淨培養基(RPMI-1640)中的1μCi甲基-3H-胸苷(Amersham生命科學，Buckinghamshire，英國)到每一個孔中。在相同的條件下孵育所述平板12個多小時。最後，收穫所述細胞(Filtermate 196 Harvester，Packard)，將在DNA合成過程中摻入的氚標記的胸苷轉移到平板(UniFilter-96 GF/C，Perkin Elmer)中。接著加入閃爍液，用閃爍計數器(Top Count，微量培養板閃爍計數器，Packard)定量化放射強度。作為陽性和陰性對照，分別在TGF-β1缺乏和存在的情況下摻入氚化胸腺嘧啶。根據以下公式計算在該實驗中TGF-β1活性的抑制

該陰性對照表示在TGF-β1存在但是肽缺乏的情況下氚化胸腺嘧啶的摻入，而該陽性對照表示在TGF-β1和肽都缺乏的情況下氚化胸腺嘧啶的摻入。因此根據所述的肽逆轉該細胞因子對Mv-1-Lu細胞株增殖的抑制作用，測量所述的肽對TGF-β1生物活性的抑制百分比(表2)。
表2.通過「生物淘選」篩選獲得的肽在體外對TGF-β1生物活性抑制作用，根據Mv-1-Lu細胞株的生長分析計算。

序列號為SEQ ID NO3，11，17和18的肽在體外能夠抑制TGF-β1的生物活性，它們的抑制百分比高於20％。
另外，為了評價所述的肽逆轉TGF-β1對Mv-1-Lu細胞株的增殖的抑制劑作用的能力，將西班牙專利申請ES 2146552 A1中P144定義的肽的活性與序列號為SEQ ID NO17的肽的活性進行比較。序列號為SEQ ID NO17的肽顯示增加的能力。
實施例3應用由CCl4誘導的急性肝損傷模型評價肽在體內對TGF-β1的生物活性的抑制急性肝損傷產生效應和生理反應的級聯反應，包括TGF-β1濃度的升高。在其它方面，該升高是形成I型膠原基因表達的關鍵原因。在急性肝損傷模型中，重25到30克的雌性Balb/C系小鼠口服給藥劑量為2μl的CCl4(每克體重)，該2μl的CCl4溶於同等體積的玉米油中(體積比為1∶1)。對照組只給予同等體積的玉米油，並且治療組(單獨口服給藥在玉米油中的CCl4後)每24小時給予50μg肽，該50μg肽溶於500μl的含有1％生理鹽水溶液的DMSO(二甲基亞碸)中。在72小時後處死所有的動物，並且處理肝臟樣品。為了評價mRNA的表達，肝組織在液氮中冷凍並且在-80℃中保存直到進一步使用。其它肝組織樣品在OCT或Tissue-Tek(Sakura Finetek B.V.)中保存並且按照與用於mRNA研究的樣品的相同的處理方法處理。其它肝樣品固定在10％緩衝的福馬林溶液中，石蠟包埋並且處理成用於對其組織學評價。應用定量聚合酶鏈反應(PCR)技術對所有組中的編碼I型膠原的mRNA的量定量。圖6顯示在該急性肝損傷分析中誘導、獲得樣品和定量結果的流程圖。通過測量誘導的I型膠原mRNA的水平的評價方法，可以通過實時PCR方法定量所測試的肽阻斷該急性損傷的能力。表3顯示通過噬菌體衍生的肽對膠原I型mRNA表達的抑制程度。所測試的肽通過常規的固相的肽合成方法獲得(Merrifield RB.美國化學會雜誌1963；852149-2154；AthertonE等人J Chem Soc Perkin Trans 1981；1538-546)。
表3.通過「生物淘選」篩選獲得的肽在體內對TGF-β1生物活性的抑制作用，根據在急性肝損傷模型中I型膠原mRNA誘導作用的抑制計算。

(Neg陰性)序列號為SEQ ID NO2，4，6，11，14和17的肽在體內能夠抑制TGF-β1的生物活性，它們的抑制百分比大於35％。
另外，為了評價所述的肽抑制在先前所述的小鼠急性肝損傷模型中I型膠原mRNA誘導作用的能力，對西班牙專利申請ES 2146552 A1中稱為P144的肽的活性與序列號為SEQ ID NO17的肽的活性進行比較。在該對比分析中，觀察到序列號為SEQ ID NO17的肽比西班牙專利申請ES 2146552 A1中稱為P144的肽，以更大的程度抑制I型膠原mRNA的表達，在該分析中西班牙專利申請ES 2146552 A1中稱為P144的肽不顯示任何活性。比較試驗(實施例2和3)獲得的結果表明本發明所述的肽中的代表肽(序列號為SEQ ID NO17的肽)比西班牙專利申請ES2146552 A1中代表的肽(稱為P144的肽)相比，在所述的Mv-1-Lu細胞的增殖試驗中和在急性肝損傷模型中具有更強的活性。
實施例4在Mv-1-Lu細胞的增殖試驗中從標記為SEQ ID NO17的肽中截短的肽在體外對TGF-β1生物活性的抑制該實施例顯示一些肽的抑制活性，該肽的胺基酸序列包含本發明所述的胺基酸序列之一的3-15個連續胺基酸殘基根據逆轉TGF-β1對Mv-1-Lu細胞株增殖作用的抑制劑作用的能力，在截短的肽(來源於序列號為SEQ ID NO17的肽序列)與全序列之間進行活性比較。對於該效應並且為了測定序列號為SEQ ID NO17的肽的能在體外抑制TGF-β1的生物活性最小序列，通過在該分子的N-末端、C-末端或兩個末端處平截，合成該肽的截短形式。根據常規方法(Merrifield RB.美國化學會雜誌1963；852149-2154；Atherton E等人JChem Soc Perkin Trans 1981；1538-546)通過肽合成獲得所測試的肽。採用在實施例2中描述的相同方法學，根據所述的Mv-1-Lu細胞株的增殖分析，對截短的肽與序列號為SEQ ID NO17的肽的全序列之間的活性進行定量。
表4.從序列號為SEQ ID NO17的肽中獲得的截短的肽在體外對TGF-β1生物活性的抑制作用，根據Mv-1-Lu細胞株生長重建分析計算

如表4所示，在該比較分析中，從N-末端中去除賴氨酸(K)表明序列號為SEQ ID NO17的肽的活性從28.5％降低到9.4％。相反，從C-末端中去除最多達三個胺基酸不影響該肽的活性。並且，芳香族胺基酸酪氨酸(Y)和色氨酸(W)廢除了該肽的活性。這使得能夠將序列號為SEQID NO17的最初的肽減少到12個胺基酸序列(KRIWFIPRSSWY)[SEQID NO34]而不影響它在體外對TGF-β1的抑制活性。
序列表110醫藥申請研究基金會(FIMA)120能夠結合轉換生長因子β1(TGF-β1)的肽130FIMA02007150ES 2003020201512003-08-2216036170PatentIn version 3.1210SEQ ID NO121115212PRT213人工肽序列4001Asp Arg Arg Ile Phe Trp Trp Ser Leu Arg Ser Ala Pro Gly Ala1 5 10 15210SEQ ID NO221115212PRT213人工肽序列4002Asp Arg Arg Ile Phe Trp Trp Ser Asn Arg Ser Ala Pro Gly Ala1 5 10 15210SEQ ID NO321115212PRT213人工肽序列4003Arg Phe Phe Thr Arg Phe Pro Trp His Tyr His Ala Ser Arg Leu1 5 10 15210SEQ ID NO421115212PRT213人工肽序列4004Arg Leu Ala His Ser His Arg His Arg Ser His Val Ala Leu Thr1 5 10 15
210SEQ ID NO521115212PRT213人工肽序列4005Arg Arg Trp Val Arg Tyr Pro Val His Leu His Ser Pro Ile Val1 5 10 15210SEQ ID NO621115212PRT213人工肽序列4006Pro Pro Tyr His Arg Phe Trp Arg Gly His Arg His Ala Val Gln1 5 10 15210SEQ ID NO721115212PRT213人工肽序列4007His Arg Ile Ser His Phe Ala His Arg Tyr Leu Ala Arg Leu His1 5 10 15210SEQ ID NO821115212PRT213人工肽序列4008Trp His Trp Arg His Arg Ile Pro Leu Gln Leu Ala Ala Gly Arg1 5 10 15210SEQ ID NO921115212PRT213人工肽序列4009Gly Trp His Ser Leu Leu His Ser Arg Tyr His Arg Ile Ala Ala1 5 10 15
210SEQ ID NO1021115212PRT213人工肽序列40010Phe Val Trp Val Arg Phe His Arg Leu Pro Arg Gln Ile Tyr Thr1 5 10 15210SEQ ID NO1121115212PRT213人工肽序列40011Trp His Lys Tyr Phe Leu Arg Arg Pro Leu Ser Val Arg Thr Arg1 5 10 15210SEQ ID NO1221115212PRT213人工肽序列40012Trp His Lys Tyr Phe Leu Arg Arg Pro Leu Ser Val Gly Leu Gly1 5 10 15210SEQ ID NO1321115212PRT213人工肽序列40013Arg Lys Trp Phe Leu Gln His Arg Arg Met Pro Val Ser Val Leu1 5 10 15210SEQ ID NO1421115212PRT213人工肽序列40014Ser Gly Arg Arg His Leu His Arg His His Ile Phe Ser Leu Pro1 5 10 15210SEQ ID NO1521115212PRT213人工肽序列40015
Gly Trp Ile Thr Phe His Arg Arg His His Asp Arg Val Leu Ser1 5 10 15210SEQ ID NO1621115212PRT213人工肽序列40016Arg Leu His Gly His Arg Ser His Arg Phe Thr His Val Ala Gln1 5 10 15210SEQ ID NO1721115212PRT213人工肽序列40017Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala1 5 10 15210SEQ ID NO1821115212PRT213人工肽序列40018Met Pro Leu Ser Arg Tyr Trp Trp Leu Phe Ser His Arg Pro Arg1 5 10 15210SEQ ID NO1921115212PRT213人工肽序列40019Arg Hig Leu Ser His Phe Lys Trp Leu Arg Ser His Gly Leu Asp1 5 10 15210SEQ ID NO2021115212PRT213人工肽序列40020Arg Arg Phe His Phe His Ser Arg Met Val Ala Val Asp Asn Ser1 5 10 15210SEQ ID NO2121115
212PRT213人工肽序列40021His Val Arg Leu His His Tyr Leu Arg His Arg Ser Leu Pro Asn1 5 10 15210SEQ ID NO2221115212PRT213人工肽序列40022Val Pro Met Ala Leu Asn His Gly Val Tyr Val Met Val Ser Ser1 5 10 15210SEQ ID NO2321118212DNA213人工序列223起始寡核苷酸fdtet15-mer40023TGAATTTTCT GTATGAGG18210SEQ ID NO2421114212PRT213由肽SEQ ID NO17平截獲得的人工肽序列40024Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala1 5 10210SEQ ID NO2521113212PRT213由肽SEQ ID NO17平截獲得的人工肽序列40025Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg1 5 10210SEQ ID NO2621113212PRT213由肽SEQ ID NO17平截獲得的人工肽序列40026Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala1 5 10
210SEQ ID NO2721111212PRT213由肽SEQ ID NO17平截獲得的人工肽序列40027Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu1 5 10210SEQ ID NO282119212PRT213由肽SEQ ID NO17平截獲得的人工肽序列40028Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr1 5210SEQ ID NO2921112212PRT213由肽SEQ ID NO17平截獲得的人工肽序列40029Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala1 5 10210SEQ ID NO3021111212PRT213由肽SEQ ID NO17平截獲得的人工肽序列40030Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala1 5 10210SEQ ID NO3121110212PRT213由肽SEQ ID NO17平截獲得的人工肽序列40031Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala1 5 10210SEQ ID NO322119212PRT213由肽SEQ ID NO17平截獲得的人工肽序列40032Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala
1 5210SEQ ID NO3321114212PRT213由肽SEQ ID NO17平截獲得的人工肽序列40033Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg1 5 10210SEQ ID NO3421112212PRT213由肽SEQ ID NO17平截獲得的人工肽序列40034Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr1 5 10210SEQ ID NO3521110212PRT213由肽SEQ ID NO17平截獲得的人工肽序列40035Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser1 5 10210SEQ ID NO362119212PRT213由肽SEQ ID NO17平截獲得的人工肽序列40036Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser1 5
權利要求書(按照條約第19條的修改)根據PCT條約第19(1)條作出的聲明國際專利申請PCT/ES04、000320申請人醫藥申請研究基金會修改權利要求1，並加入權利要求3的特徵；因多餘而刪除權利要求2；因其特徵已包括在權利要求1中，因此刪除權利要求3，並由此刪除多餘的權利要求4；新權利要求2、3對應原權利要求5、6；權利要求4的依據是說明書(國際公開)第11頁第29-第12頁第7行；權利要求5-7對應原權利要求9-11；權利要求8和9對應原權利要求7和8；權利要求10-15對應原權利要求12-17；權利要求16是依據權利要求4作出的修改，因此也得到本發明說明書第11頁第29-第12頁第7行的支持；權利要求17對應原權利要求18。
修改的權利要求[國際局於2004年12月22日(22.12.04)收到；用修改的權利要求1-17替換權利要求1-18]1.具有結合TGF-β1能力的肽，其胺基酸序列選自下列中的任何一個SEQ ID NO1-SEQ ID NO6，SEQ ID NO9-SEQ ID NO22和SEQ ID NO24-SEQ ID NO36，或者包含3-15個胺基酸的所述肽的片段，以及它們的藥物可接受的鹽。
2.根據權利要求1所述的肽，其特徵是所述肽還具有體外和/或體內抑制TGF-β1的生物活性的能力。
3.根據權利要求1或2所述的肽，所述肽選自下列序列號的肽及其藥物可接受的鹽SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ IDNO6，SEQ ID NO11，SEQ ID NO14，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO33，SEQ ID NO34。
4.肽在能夠抑制TGF-β1的生物活性的藥物組合物的製造中的應用，所述肽的胺基酸序列選自SEQ ID NO1到SEQ ID NO22，SEQ IDNO24到SEQ ID NO36、或包含3到15個胺基酸的所述肽的片段，以及它們的藥物可接受的鹽中的任何一個序列。
5.根據權利要求4所述的肽在藥物製造中的應用，該藥物用於治療與過度或失調的TGF-β1表達相關的疾病或病理改變。
6.根據權利要求5所述的肽的應用，其特徵在於所述的與過度或失調的TGF-β1表達相關的疾病或病理改變包含與器官或組織功能喪失相關的纖維化，和外科的和/或美學上的併發症。
7.根據權利要求5或6中任一權利要求所述的肽的應用，其特徵在於與過度或失調的TGF-β1表達相關的疾病或病理改變選自肺纖維化、肝纖維化(肝硬化)、腎纖維化、角膜纖維變性，與皮膚和腹膜外科手術相關的纖維化、與燒傷相關的纖維化、骨關節纖維化或瘢痕瘤。
8.藥物組合物，特徵在於其包含治療有效量的權利要求1-3中任一權利要求所述的肽，和至少一個藥物可接受的賦形劑。
9.根據權利要求8所述的藥物組合物，包含至少一個權利要求1-3中任一權利要求所述的肽和一個或多個與本發明不同的其它TGF-β1抑制物。
10.編碼權利要求1-3中任一權利要求所述的肽的DNA序列。
11.包含權利要求10所述的DNA序列的DNA構建。
12.根據權利要求11所述的DNA構建，其包含可操作連接的所述DNA序列表達調節序列。
13.包含權利要求10所述的DNA序列、或者包含權利要求11或12所述的DNA構建的載體。
14.包含權利要求10所述的DNA序列、或者包含權利要求11或12所述的DNA構建、或者包含權利要求13所述的載體的宿主細胞。
15.生產權利要求1-3中任一權利要求所述的肽的方法，其特徵在於包括在允許所述的肽產生和回收的條件下使權利要求14所述的宿主細胞生長。
16.權利要求10所述的DNA序列，或權利要求11或12所述的DNA構建通過基因療法抑制TGF-β1的生物活性的應用。
17.權利要求10所述的DNA序列，或權利要求11或12所述的DNA構建在載體和細胞的製造中的應用，該載體和細胞治療與過度或失調的TGF-β1表達相關的疾病和病理改變。
權利要求
1.肽，所述肽的胺基酸序列包含的3-15個連續胺基酸殘基的胺基酸序列選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21和SEQ ID NO22及其藥物可接受的鹽。
2.根據權利要求1所述的肽，所述肽的胺基酸序列包含的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個連續胺基酸殘基的胺基酸序列選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ IDNO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21和SEQ ID NO22及其藥物可接受的鹽。
3.根據權利要求1和2中任一權利要求所述的肽，還具有結合轉化生長因子β1(TGF-β1)的能力。
4.根據權利要求3所述的肽，所述肽選自下列序列號的肽及其藥物可接受的鹽SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26，SEQ ID NO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ ID NO31，SEQ ID NO32，SEQID NO33，SEQ ID NO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36。
5.根據權利要求3所述的肽，其還在體外和/或體內具有抑制TGF-β1生物活性的能力。
6.根據權利要求5所述的肽，所述肽選自下列序列號的肽及其藥物可接受的鹽SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO11，SEQ ID NO14，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ IDNO33，SEQ ID NO34。
7.藥物組合物，包含藥物有效量的權利要求1-6中任一權利要求所述的肽和至少一個藥物可接受的賦形劑。
8.根據權利要求7所述的藥物組合物，所述組合物包含至少一個權利要求1-6中任一權利要求所述的肽、任選地和一個或多個不同的TGF-β1化合物。
9.權利要求1-6中任一權利要求所述的肽在藥物組合物的製造中的應用，所述藥物組合物用於治療與過度或失調的TGF-β1表達相關的疾病或病理變化。
1O.根據權利要求9所述的應用，其中所述的與過度或失調的TGF-β1表達相關的疾病或病理變化包括與器官或組織功能喪失相關的纖維化，和外科的和/或美學的併發症。
11.根據權利要求10所述的應用，其中所述的與過度或失調的TGF-β1表達相關的疾病或病理變還包括肺纖維化、肝纖維化(肝硬化)、腎纖維化、角膜纖維變性，與皮膚和腹膜外科手術相關的纖維化、與燒傷相關的纖維化、骨關節纖維化或瘢痕瘤。
12.編碼權利要求1-6中任一權利要求所述的肽的DNA序列。
13.包含權利要求12所述的DNA序列的DNA構建。
14.根據權利要求13所述的DNA構建，還包含調節所述DNA序列表達的可操作連接的序列。
15.包含權利要求12所述的DNA序列或者包含權利要求13和14中任一權利要求所述DNA構建的載體。
16.宿主細胞，其包含權利要求12所述的DNA序列，或者包含權利要求13和14中任一權利要求所述DNA構建，或者包含權利要求15所述的載體。
17.產生權利要求1-6中任一權利要求所述的肽的方法，所述方法包括在允許產生所述的肽的條件下使權利要求16所述的宿主細胞生長，並且如果需要，回收所述的肽。
18.權利要求12所述的DNA序列或者權利要求13和14中任一權利要求所述的DNA構建在載體和細胞的製備中的應用，所述載體和細胞通過基因療法治療與過度或失調的TGF-β1表達相關的疾病或病理變化。
全文摘要
本發明公開了能夠結合轉化生長因子TGF－β1(TGF－β1)的肽，其通過直接結合該細胞因子是TGF－β1生物活性的潛在抑制劑。這些肽能夠用於治療與過度或失調的TGF－β1表達相關的疾病或病理改變。
文檔編號A61K38/10GK1839149SQ200480024201
公開日2006年9月27日 申請日期2004年7月5日 優先權日2003年8月22日
發明者德 拉斯 埃雷裡亞斯 哈維爾·多託爾, 安娜·貝倫·洛佩斯·巴斯克斯, 胡安·何塞·拉薩爾特·薩加斯蒂韋爾薩, 赫蘇斯·普列託·巴爾圖埃納, 弗朗西斯科·博拉斯·奎斯塔 申請人:西瑪生物醫學信息公司