仔豬副傷寒活疫苗的製備方法及其產品的製作方法

2023-09-11 03:41:05

專利名稱：：仔豬副傷寒活疫苗的製備方法及其產品的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種動物活疫苗的製備方法，尤其涉及一種仔豬副傷寒活疫苗的製備方法以及由該方法製備得到的產品，屬於副傷寒活疫苗領域。
背景技術：
：仔豬副傷寒是由豬霍亂沙門氏菌引起的急性、亞急性或慢性傳染病。主要發生於2-4月齡仔豬，危害性極大，急性病例主要表現為敗血症，症狀為體溫突然升高、精神不振、不食，後期間有下痢、呼吸困難、耳根、胸前和腹下皮膚有紫紅色斑點，有時出現症狀後24h內死亡，病死率很高。亞急性和慢性症狀表現為消瘦、下痢和腸炎，病情往往拖後2-3周或更長，最後極度消瘦，衰竭而死。1948年蘇聯人伊瓦諾夫因成功研製出仔豬副傷寒滅活菌苗，獲得了史達林勳章。國外很早就使用滅活菌苗，我國在五六十年代也開始使用滅活菌苗，但滅活菌苗的使用效果很不理想，I960年我國曾製造了含各種不同佐劑的滅活菌苗共52批對235頭仔豬進行免疫試驗，均免疫兩次，攻毒後保護率僅為29.9%。1961年我國開始弱毒菌株培育及弱毒菌苗的研製，於1964年選出一株毒力弱而又穩定、免疫原性良好的菌種，編號為C500。在生產C500弱毒菌苗過程中，因採用大扁瓶瓊脂培養生產菌苗，存在勞動強度大和產量低的缺點，從七十年代初開始各生物製品廠陸續改用液體通氣培養法生產。但由於通氣培養有部分菌體生命較為脆弱，容易出現菌苗凍幹後活菌率較低，而引起仔豬反應較大，並偶爾有出現不安全的情況。後經各廠家改善培養和凍幹技術以及進行菌苗口服試驗，口服試驗證明口服免疫的效果與注射的效果同樣良好，而且口服活菌率低至37%的菌苗也很安全，據此結果規定了凍幹活菌率不低於50%的用於注射或口服；凍幹活菌率低於50%的菌苗不能注射但可用於口服。此規定可保證更多的菌苗出廠使用。我國於1976年將液體通氣培養法批准列入《獸用生物製品規程》，在全國許多生物製品生產廠家投入生產，推廣應用。此方法一直延用至今，此培養方法一直存在著菌數低、凍乾死亡率高的問題，生產難度大，產量低、成本高。因市場需求量大，各生產廠家時常都有出現斷貨的現象發生，多年來一直困擾著各生產廠家。《獸用生物製品規程》對仔豬副傷寒活疫苗的生產方法進行了具體的規範，按《規程》生產方法如下1、一級菌種的製備菌種用普通肉湯稀釋或經普通肉湯培養繁殖後，接種普通瓊脂平板，37t:培養18-20h，選取菌落為圓形、邊緣整齊、突起、半透明、略溼潤的光滑型中等大小菌落5-10個，混合接種於普通瓊脂斜面若干支，37t:培養24h經純粹檢驗，並用1/500吖啶黃溶液做玻片凝集試驗檢查合格，作為一級菌種，在2-『C保存，應不超過2個月此間可移植1-2次，在培養基上繼代，不超過5代。2、二級菌種的製備3取一級菌種接種普通肉湯瓊脂扁瓶，37t:培養24h(普通瓊脂培養物用普通肉湯洗下製成濃度適宜的菌液)，純粹檢查合格後，即可作為種子。在2-『C保存，應不超過2日。3、菌液培養將二級菌種按培養基總量的1%_2%接種於含1%-1.5%蛋白腖的普通肉湯中，在37t:通氣培養18-2ih，培養過程中根據需要加入適量的消泡劑，並根據ra升高情況加入適量滅菌40%葡萄糖液以控制ra。培養結束後立即加入經過滅菌及預熱至37t:的穩定劑，使疫苗含1.5%明膠及5%蔗糖，充分混勻後按規定頭份定量分裝。每頭份活菌不少於30億個。按照上述方法生產，培養菌數一般在180-260億/ml，按每頭份活菌30億個計算配苗，最大分裝量為3.8ml/瓶，規程規定最低為20頭份/瓶，此菌凍乾死亡率在40%-60%，按最高培養菌數260億和60%死亡率計算接近《規程》規定的最低頭份標準，此培養方法一直存在著菌數低、凍乾死亡率高的問題，生產難度大，產量低、成本高，有待改進。
發明內容本發明所要解決的技術問題是克服現有的仔豬副傷寒活疫苗的生產方法所存在的菌數低、凍乾死亡率高，生產難度大，產量低，成本高等問題，提供一種新的仔豬副傷寒活疫苗的生產方法，該生產方法可使細菌培養時間縮短，培養菌數明顯提高，凍乾死亡率大幅度下降。本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的—種仔豬副傷寒活疫苗的生產方法，包括(l)一級菌種的製備豬霍亂沙門氏菌菌種用普通肉湯稀釋或經普通肉湯培養繁殖後，接種普通瓊脂平板，37t:培養18-20h，選取中等大小菌落5-10個，混合接種於普通瓊脂斜面，37t:培養24h，檢驗合格後作為一級菌種；(2)二級菌種的製備取一級菌種接種普通肉湯瓊脂扁瓶，37t:培養24h，檢查合格後，作為二級種子；(3)菌液培養將二級菌種接種到培養基中培養；培養結束後立即加入經過滅菌及預熱至37°C的穩定劑，使疫苗含1.5%明膠及5%蔗糖，充分混勻；其中，步驟(3)中所述的培養基由普通肉湯培養基和合成培養基按照2:1的體積比例所組成；所述的普通肉湯培養基組成為牛肉500g，蛋白腖10-15g，氯化鈉5g，蒸餾水或去離子水1000ml;所述的合成培養基的組成為牛肉浸粉10g，蛋白腖10g，酵母粉10g，葡萄糖2g，氯化鈉5g;加水至1000ml。本發明還通過大量的實驗發現，在上述生產方法中採用以下手段，對於縮短細菌培養時間，提高培養菌數以及降低凍乾死亡率等方法均有明顯的效果步驟(2)中取一級菌種接種普通瓊脂或普通肉湯，37t:培養24h後用40%滅菌葡萄糖溶液衝洗菌苔後接入裝量為3000ml—萬瓶中，37t:培養20-22h;檢查合格後，再作為二級種子；步驟(3)中所述的接種量優選為按培養基總重量的3%接種量將二級種子接種到培養基中；所述的培養優選為在37t:條件下通氣培養15h，其中，更優選的，在37t:溫度下逐漸加大通氣培養15h;本發明針對仔豬副傷寒活疫苗生產方法所存在的菌數低、凍乾死亡率高，生產難度大，產量低，成本高等問題，有針對性的開展了改進仔豬副傷寒活疫苗製備方法的研究，從生產工藝和培養基配方方面做了大量的探索、研究試驗。本發明方法所生產的仔豬副傷寒活疫苗，培養菌數突破500億/ml，最高達到580億/ml，凍乾死亡率降至20-40%。《獸用生物製品規程》中對仔豬副傷寒活疫苗規格為20頭份/瓶、30頭份/瓶、40頭份/瓶；按照本發明方法所生產的15個批次的活疫苗，其中11個批次達到30頭份/瓶，4個批次達到40頭份/瓶。本發明方法具有所生產的活疫苗菌數高、凍乾死亡率低，容易生產，產量高，成本低等優點。具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。—、普通肉湯的配製牛肉500g蒸餾水或去離子水1000ml蛋白腖10-15g氯化鈉5g;將上述各組分溶於蒸餾水或去離子水中，高溫高壓滅菌，即得。二、合成培養基的配製牛肉浸粉10g，蛋白腖10g，酵母粉10g，葡萄糖2g，氯化鈉5g;加水至1000ml，高溫高壓滅菌，即得。實施例11、一級菌種的製備將豬霍亂沙門氏菌菌種(購買於中國獸藥監察所)用普通肉湯稀釋或經普通肉湯培養繁殖後，接種普通瓊脂平板，37t:培養18-20h，選取菌落為圓形、邊緣整齊、突起、半透明、略溼潤的光滑型中等大小菌落5-10個，混合接種於普通瓊脂斜面若干支，37t:培養24h經純粹檢驗，並用1/500吖啶黃溶液做玻片凝集試驗檢查合格，作為一級菌種，在2-8t:保存，應不超過2個月此間可移植1-2次，在培養基上繼代，不超過5代。2、二級菌種的製備鉤取一級菌種劃線接種普通肉湯瓊脂扁瓶，37t:培養24後，用40%滅菌葡萄糖溶液衝洗菌苔後接入裝量為3000ml—萬瓶中，37t:培養20_22h，純粹檢查合格後，即可作為二級種子。在2-8t:保存，應不超過3日。3、菌液培養將二級菌種按培養基總量的3%接種於兩份含1%-1.5%蛋白腖的普通肉湯和一份合成培養基中(2:1)，用智能微生物發酵罐37t:通氣培養15h，培養過程中要採用逐漸加大通氣量進行培養，並根據PH升高情況加入適量滅菌40%葡萄糖液以控制pH值為7.4-7.6。培養結束後立即加入經過滅菌及預熱至37°C的穩定劑，使疫苗含1.5%明膠及5%蔗糖，充分混勻後按規定頭份定量分裝。每頭份活菌達到40億個。實施例21、一級菌種的製備將豬霍亂沙門氏菌菌種(請給出豬霍亂沙門氏菌菌種的商業購買途徑)用普通肉5湯稀釋或經普通肉湯培養繁殖後，接種普通瓊脂平板，37t:培養18-20h，選取菌落為圓形、邊緣整齊、突起、半透明、略溼潤的光滑型中等大小菌落5-10個，混合接種於普通瓊脂斜面若干支，37t:培養24h經純粹檢驗，並用1/500吖啶黃溶液做玻片凝集試驗檢查合格，作為一級菌種，在2-『C保存，應不超過2個月此間可移植1-2次，在培養基上繼代，不超過5代。2、二級菌種的製備鉤取一級菌種劃線接種普通肉湯瓊脂扁瓶，37t:培養24後，純粹檢查合格後，即可作為二級種子。在2-『C保存，應不超過3日。3、菌液培養將二級菌種按培養基總量的3%接種於兩份含1%-1.5%蛋白腖的普通肉湯和一份合成培養基中(2:1)，用智能微生物發酵罐37t:通氣培養15h，培養過程中採用逐漸加大通氣量進行培養，並根據PH升高情況加入適量滅菌40%葡萄糖液以控制pH值為7.4-7.6;培養結束後立即加入經過滅菌及預熱至37°C的穩定劑，使疫苗含1.5%明膠及5%蔗糖，充分混勻後按規定頭份定量分裝。每頭份活菌不少於30億個。實施例31、一級菌種的製備將豬霍亂沙門氏菌菌種(請給出豬霍亂沙門氏菌菌種的商業購買途徑)用普通肉湯稀釋或經普通肉湯培養繁殖後，接種普通瓊脂平板，37t:培養18-20h，選取菌落為圓形、邊緣整齊、突起、半透明、略溼潤的光滑型中等大小菌落5-10個，混合接種於普通瓊脂斜面若干支，37t:培養24h經純粹檢驗，並用1/500吖啶黃溶液做玻片凝集試驗檢查合格，作為一級菌種，在2-『C保存，應不超過2個月此間可移植1-2次，在培養基上繼代，不超過5代。2、二級菌種的製備鉤取一級菌種劃線接種普通肉湯瓊脂扁瓶，37t:培養24後，用40%滅菌葡萄糖溶液衝洗菌苔後接入裝量為3000ml—萬瓶中，37t:培養20_22h，純粹檢查合格後，即可作為二級種子。在2-8t:保存，應不超過3日。3、菌液培養將二級菌種按培養基總量的3%接種於兩份含1%-1.5%蛋白腖的普通肉湯和一份合成培養基中(2:1)，用智能微生物發酵罐37t:通氣培養20h，並根據pH升高情況加入適量滅菌40%葡萄糖液以控制pH值為7.4-7.6。培養結束後立即加入經過滅菌及預熱至37t:的穩定劑，使疫苗含1.5%明膠及5%蔗糖，充分混勻後按規定頭份定量分裝。每頭份活菌不少於30億個。試驗例1—、試驗材料供試疫苗實施例1-3所製備的活疫苗；共分為15個批次；對照疫苗按照《獸用生物製品規程》所生產的仔豬副傷寒活疫苗；分為9個批次；二、試驗方法及結果供試疫苗和對照疫苗採用相同凍幹曲線，凍幹曲線為-15°〇入箱，預凍-40°C4h，升華乾燥-2t:25h，解吸乾燥32t:7h。細菌計數用培養基為普通肉湯瓊脂(普通肉湯加1.5%瓊脂)，採用《獸用生物製品規程》活菌計數法，供試疫苗和對照疫苗的培養菌數和凍6乾死亡率對比見表1。表1供試疫苗和對照疫苗的培養菌數及凍乾死亡率對比表tableseeoriginaldocumentpage7從試驗結果可見，採用本發明生產方法所製備的活疫苗的培養菌數突破500億/ml，最高達到580億/ml，凍乾死亡率降至20-40%;《獸用生物製品規程》規格為20頭份/瓶、30頭份/瓶、40頭份/瓶；採用本發明方法共計生產仔豬副傷寒活疫苗15個批次，其中11個批次達到30頭份/瓶，4個批次達到40頭份/瓶。權利要求一種仔豬副傷寒活疫苗的生產方法，包括(1)一級菌種的製備將豬霍亂沙門氏菌菌種用普通肉湯稀釋或經普通肉湯培養繁殖後，接種普通瓊脂平板，37℃培養18-20h，選取菌落5-10個，混合接種於普通瓊脂斜面，37℃培養24h，檢驗合格後作為一級菌種；(2)二級菌種的製備取一級菌種接種普通肉湯瓊脂扁瓶，37℃培養24h後用40％滅菌葡萄糖溶液衝洗菌苔後接入裝量為3000ml一萬瓶中，37℃培養，檢查合格後，作為二級種子；(3)菌液培養將二級菌種接種到培養基中培養；培養結束後立即加入經過滅菌及預熱至37℃的穩定劑，使疫苗含1.5wt％明膠及5wt％蔗糖，充分混勻；其特徵在於步驟(3)中所述的培養基由普通肉湯培養基和合成培養基按照2∶1的體積比例所組成。2.按照權利要求1所述的生產方法，其特徵在於所述普通肉湯培養基組成為牛肉500g，蛋白腖10-15g，氯化鈉5g，蒸餾水或去離子水1000ml;所述的合成培養基的組成為牛肉浸粉10g，蛋白腖10g，酵母粉10g，葡萄糖2g，氯化鈉5g;加水至1000ml。3.按照權利要求1所述的生產方法，其特徵在於步驟(2)中取一級菌種接種普通肉湯瓊脂扁瓶，37t:培養24h後用40X滅菌葡萄糖溶液衝洗菌苔後接入裝量為3000ml—萬瓶中，37t:培養20-22h;檢查合格後，再作為二級種子。4.按照權利要求l所述的生產方法，其特徵在於步驟(3)中按培養基總重量的3%接種量將二級種子接種到培養基中。5.按照權利要求1所述的生產方法，其特徵在於所述的培養為在37t:條件下通氣培養15h。6.按照權利要求1所述的生產方法，其特徵在於所述的培養是在37t:溫度下逐漸加大通氣培養15h。7.權利要求1-6任何一項生產方法所生產得到的活疫苗。8.權利要求7所述的活疫苗在製備預防或治療仔豬副傷寒藥物中的用途。9.一種預防或治療仔豬副傷寒的藥物組合物，其特徵在於由權利要求7所述的活疫苗和藥學上可接受的載體或賦型劑組成。全文摘要本發明公開了一種仔豬副傷寒活疫苗的生產方法及其產品，包括(1)一級菌種的製備；(2)二級菌種的製備；(3)菌液培養將二級菌種接種到培養基中培養；培養結束後立即加入經過滅菌及預熱至37℃的穩定劑，使疫苗含1.5％明膠及5％蔗糖，充分混勻，即得；其中步驟(3)中所述的培養基由普通肉湯培養基和合成培養基按照2∶1的體積比例所組成。本發明方法所生產的仔豬副傷寒活疫苗，培養菌數突破500億/ml，最高達到580億/ml，凍乾死亡率降至20-40％。本發明生產方法具有活疫苗菌數高，凍乾死亡率低，容易生產，產量高，生產成本低等優點。文檔編號A61P31/00GK101732706SQ20091026170公開日2010年6月16日申請日期2009年12月28日優先權日2009年12月28日發明者付麗傑,劉洪斌,左穎,張繼東,李尊江,楊萬秋,王靜,鄔立權申請人:哈藥集團生物疫苗有限公司