川滇榿木次生代謝物對苯乙基酮為趨避雲南松小蠹的緩釋劑及方法
2023-09-10 20:05:15 1
川滇榿木次生代謝物對苯乙基酮為趨避雲南松小蠹的緩釋劑及方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於林業害蟲防治，涉及防治雲南松小蠹的藥物緩釋劑。
【背景技術】
[0002] 雲南松小蠹是雲南切梢小蠹(Tomicus yunnanensis)、橫坑切梢小蠹(T. minor)、 短毛切梢小蠹(T. brevipiIosus)等以為害雲南松為特徵的一類駐幹小蠹，新羽化成蟲喜 食健康松樹嫩梢，持續期8~9個月致使樹勢衰弱；性成熟後則選擇衰弱的雲南松樹幹作為 取食、產卵和繁殖，持續3~4個月最終使樹木死亡。但該小蠹從搜尋寄主開始，到雌雄個體 相遇、交配、產卵、胚後發育等各個過程均受到非寄主氣味的影響，對林區內存在寄主植物 具有高度的選擇和辨識能力。
[0003] 川滇梢木(Alnus ferdinandi-coburgii Schneid)隸屬於樺木科梢木屬植物，是 中國雲南、貴州、四川等地的鄉土樹種，具有較強的適生性和抗逆能力，常用作雲南松林中 低產林改造和混交林營造的優良樹種之一（陳強等，西部林業科學，2007，36，16-21;陳永 坤，雲南林業，2011，32，53-53)。研究顯示樺木科屬植物含有二芳基庚烷類化合物、綠原 酸、萜烯類等化合物，能有誘集和趨避某些森林害蟲（姜文霞等，武漢植物研究，1992，0， 391-392;楊曉珍等，大理學院學報，2013,12,9-11等）。而雲南松林套種川滇榿木證實明顯 降低雲南松小蠹的危害，這可能與川滇榿木所釋放的次生代謝物質，特別是與分子量小、沸 點低、易揮發的氣味物質存在關係。但目前尚不清楚其次生代謝物質的組成和活性成分，文 獻中僅見到尼泊爾榿木、川滇榿木果實、榿木葉片中的化合物，且這些化合物主要是高分子 次生代謝物質，並未報導較為完整的川滇榿木次生代謝物質的成分以及對這些成分的分 析。而川滇梢木成長於海拔高度1500~3000m、土層厚度大於80cm，溼潤的黃紅或紫色土壤， 且生長期至少5年，限制了套種林木預防危害的效用。相關專利文獻，如"抗雲南松小蠹混交 林模式快速篩選方法（CN201010249717.1)"是栽培非寄主林木營造混交林以實現持續控 制小蠹蟲的方法，但該方法也受限於非寄主林木的自然生長環境和撫育時間。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的首先是從雲南松小蠹非寄主植物川滇榿木眾多次生代謝物質中篩 選和鑑定活性成分，提供一種以生物學測定和嗅覺受體驗證，幹擾雲南松小蠹寄主依存和 繁殖，趨避持續期不少於8個月的川滇榿木次生代謝物趨避雲南松小蠹的緩釋劑。
[0005] 本發明的另一目的是:提供一種應用該緩釋劑的方法，該方法具有省時省力、使用 方便的優點。
[0006] 本發明的目的按以下方式實現： (一)川滇榿木次生代謝物對苯乙基酮為趨避雲南松小蠹的緩釋劑 該緩釋劑以正己烷或正戊烷或石油醚作為溶劑，以對苯乙基酮為溶質，配置 對苯乙基酮溶液，用於趨避雲南松小蠹危害程度不同的林分。
[0007] 所述的緩釋劑的對苯乙基酮濃度與雲南松小蠹對林分危害程度呈正相關。
[0008] 所述的緩釋劑:該緩釋劑以正己烷作為溶劑，以對苯乙基酮為溶質，配置濃度50~ 750 ng/uL對苯乙基酮溶液。
[0009] (二)應用上述川滇榿木次生代謝物趨避雲南松小蠹的緩釋劑的方法 將緩釋製劑盛入頂端開孔口的緩釋瓶中，以揮發物釋放量多寡確定頂端開孔口大小， 樹高塔式交叉懸掛於衰弱木枝幹和枝梢各個方位上，直至緩釋瓶內的緩釋液釋放完畢，以 顯著降低雲南松小蠹對雲南松松梢和新萌發鬆梢的危害。
[00?0] 優選的，所述的應用方法在於：緩釋劑濃度分別為50 ng/uL、100 ng/uL、500 ng/ uL，分別對應雲南松小蠹危害程度為低、中、高三種林分。
[0011] 進一步，所述的應用方法在於:緩釋瓶為20 mL的塑料瓶，緩釋瓶的頂端開孔口的 孔徑為0.05~0.10 mm。
[0012] 進一步，所述的應用方法，其特徵在於:樹高塔式交叉懸掛於衰弱木枝幹和枝梢各 個方位上，環形等距排列，每株懸掛8~50個。
[0013] 本發明與現有技術相比具有下列優點和效果： (1)本發明趨避劑所採用的對苯乙基酮是首次從非寄主植物次生代謝物質中分離鑑定 出來的，其對雲南松小蠹趨避能力未見於任何文獻報導。尤其是，該趨避劑對苯乙基酮為納 克數量級(ng)溶質，具有用量少、高效、益於環境的特徵，可為雲南松小蠹無公害治理提供 技術和產品支持。
[0014] (2)本發明趨避劑容易配製，所使用的化學試劑，包括溶劑正己烷、正戊烷或石油 醚和溶質對苯乙基酮均可直接從市場購買，價格低廉，推廣應用非常方便快捷。
[0015] (3)對苯乙基酮和正己烷、正戊烷或石油醚化學性質穩定，即使長期暴露於林間條 件下也不易分解和氧化。因而本發明所製備的緩釋劑可覆蓋雲南松小蠹取食、產卵和繁殖8 個月以上，長期、穩定的向外釋放可顯著降低雲南松小蠹對雲南松松梢和新萌發鬆梢的危 害，遏制雲南松小蠹危害和擴散蔓延。
[0016] (4)相比營造混交林和一般化學農藥試劑防治雲南松小蠹，本發明節約勞動力和 資金成本。
[0017] 應用本發明所提供的對苯乙基酮緩釋劑在雲南省曲靖市霑益縣九龍山林場、以雲 南松小蠹危害程度為中度的雲南松林分實施趨避性試驗的結果證明：從4~12月連續觀察8 個月內，本發明對雲南松小蠹具有緩釋持續時間長和高效性趨避功能，覆蓋了雲南松小蠹 的蛀梢期。
[0018] 為了便於理解，下面結合實施例及其附圖和附表，進一步對本發明做詳細地描述 和說明。
【附圖說明】
[0019] 圖1為雲南松小蠹對川滇榿木次生代謝物質的GC-EAD反應圖譜。
[0020] 圖2為雲南松小蠹對對苯乙基酮的選擇性。
[0021]圖3為氣味分子對苯乙基酮與嗅覺受體Tyun0BP6蛋白的競爭結合曲線。
[0022]圖4為緩釋瓶頂端開口方式示意圖。
[0023]圖5為緩釋瓶林間緩釋效果。
[0024]圖6為緩釋瓶林間依樹高等距塔式十字交叉懸掛示意圖。
[0025]圖7為對苯乙基酮趨避雲南松小蠹的林間測試效果。
[0026]具體實施方法 1材料與方法 1.1次生代謝物質的篩選與確定 1.1.1非寄主植物次生代謝物質的收集與分析 採用頂空動態法收集川滇榿木的次生代謝物質。將採集的葉片和枝條用無味透明的塑 料袋(PTEK)包裹起來，袋的兩端分別留有進氣口和出氣口。進氣端空氣經活性炭(0RB0TM-32)過濾，流速控制在400 mL/min;出氣端流經150 mg Porapak Q吸附劑（50-80 mesh)，流 速為300 mL/min，收集時間為1.5 h。吸附完畢後，用正己烷(HPLC)洗脫，洗脫液300 yL保存 於2 mL容量的棕色試劑瓶內。然後經唚濃縮至100 yL，加入正辛烷(0.702g/cm3)和乙酸癸酯 (0.865g/cm3)兩種內標化合物，每種內標化合物300 ng/yL。放入-20 °C冰箱內保存待用。 [0027] 氣味分析採用GC-MS (Agilent HP6890A/5975 MS)進行，取1.0 μL濃縮液從進樣 口注入，質譜柱型號極性HP-5MS型石英柱(30 m X 0.25 mm X 0.25 μπι)。升溫程序為:40 。(:保持2 min;然後2.57°C/min升溫至100°C，以後以30 °C/min升至250 °C，保持10 min。載 氣為高純的N2,柱流量1.0 ml/min，進樣口溫度250 °C，柱前壓100 kPa;進樣採用10:1的分 流模式。氣味物質的鑑定採用NIST 98 MS譜庫檢索法、保留指數法和參考相關文獻法加以 確定。
[0028] 1.1.2次生代謝物質的GC-EAD測試 首先用刀片將雲南松小蠹成蟲頭部切除，再用拉制的毛細管尖端刺破觸角端部，然後 將參比電極插入小蠹蟲頭部血腔，固定於微動操作臺上，調整距離，記錄電極端套入受損的 觸角頂端。參比電極和記錄電極玻璃管內充滿生理液，內插一根Ag/AgCl細絲用於導電。溼 潤空氣流持續吹向固定好的觸角，流速400 mL/min。將2.0 yL濃縮液從氣相色譜進樣口注 入，然後經一個四壁不鏽鋼分流裝置將濃縮液按照1:1方式分別注入GC和吹向觸角，吹向觸 角的揮發物經一加熱罩加熱，加熱溫度260°C，GC升溫程序和色譜柱型號均與GC-MS分析一 樣，但GC(氣相色譜儀)不分流。刺激信號通過接受器感應放大，經IDAC-2信號面板的記錄、 儲存、處理，通過軟體Autospike(Version 3.6，Syntech)在計算機屏幕上展示出來。雲南 切梢小蠹、橫坑切梢小蠹、短毛切梢小蠹每種各進行6次重複測試，雌雄均3次。
[0029] 1.2活性成分高效性測定 1.2.1生物學測試 採用"Y"型嗅覺儀進行生物學測定。將樣品和對照(二氯甲烷)滴在一個長形的濾紙上， 室溫放置20 min後，置於一個球形容器內，並與?'型管的兩臂相連，然後開始抽氣，氣流經 活性炭過濾後加溼吹向釋放管內的雲南松小蠹，氣流速度300 mL/min，設置反應時間為5 min，超過反應時間的小蠹蟲將其移出，記作不反應，每個濃度重複測試20-30隻。
[0030] 1.2.2嗅覺受體競爭性結合驗證 採用螢光分光光度計進行測定，首先設定發光波長357 nm，掃描波長範圍380~500 nm， 再向螢光比色皿中加入50 mmol/L Tris緩衝液(pH 7.4)，然後向比色皿中加入雲南松小蠹 嗅覺受體蛋白Tyun0BP6使其濃度為2 umol/L，待螢光強度穩定後即開始掃描，然後加入含 有苯乙基酮氣味溶液（甲醇為溶液，終濃度控制在I mmol/L)加入到比色皿中，使加入的熒 光探針I-NPN溶度從2umol/L增加到16 umol/L。每次記錄最大的螢光強度，每次試驗重複3 次。
[0031] 1.3緩釋液的製備與緩釋方法 以正己燒做溶液，將篩選確定活性次生代謝物質配置成50 ng/uL，100 ng/uL，500 ng/ uL的三種濃度液體，盛放於20 ml的塑料瓶內，瓶的頂端採用A、B、C三種方式開口（見圖4)， 空口直徑0.05~0.10 mm，分別對應雲南松小蠹危害程度為低、中、高三種林分。以中等危害 程度的林分為例，懸掛30個緩釋瓶，每月觀察一次，記錄每次剩餘體積量，以此判斷緩釋劑 的釋放量，直至緩釋瓶內的緩釋液釋放完畢。
[0032]該緩釋劑也可以用正戊烷或石油醚為溶劑。
[0033] 1.4林間測定 趨避實驗在雲南省曲靖市霑益縣九龍山林場雲南松林進行，以雲南松小蠹危害程度為 中度的林分為例，選擇兩塊，每塊隨機選擇30株雲南松，然後將配置好的對苯乙基酮溶液按 方位、塔式十字交叉懸掛於枝幹處（圖5)，從4~12月連續觀察8個月，記錄雲南松小蠹蛀梢率 (DSI)，蛀梢率=(處理後被害率-處理前被害率)/(處理後被害率+處理前被害率），蛀梢率值 位於-1和1之間，負值意味被害率降低，正值為被害率增加。以正己烷對照，隨機選取10棵樹 木懸掛。
[0034] 2結果與分析 從表1可知，共鑑定44種川滇榿木次生代謝物質，主要成分包括對苯乙基酮、Ct-薇烯、香 檜烯、β-蒎烯、月桂烯和α-石竹烯等烷烴類和萜烯類化合物，但昆蟲觸角電位記錄系統顯示 僅有對苯乙基酮能引起雲南松小蠹反應（圖1 )，〇. 5 ng即具有79.3%趨避效果，選擇性表現 顯著。且隨釋放量的增加，雲南松小蠹趨避能力也會隨之增加（圖2)，與嗅覺受體競爭性實 驗證明對苯乙基酮與受體結合能力強，且解離速度慢（圖3)。在中度危害的林分內，懸掛對 苯乙基酮可持續衡量釋放9個多月（圖6)，覆蓋雲南松小蠹的全部蛀梢期，懸掛趨避劑的雲 南松松梢的被害率DSI=-0.0547,與對照相比（DSI=O. 2952)能夠顯著降低雲南松小蠹的危 害(Ρ〈0·001，圖7)。
[0035]表1川滇榿木次生代謝物質成分及其相對含量
$標準品驗證，活性化學物質 本發明所提供的一種雲南松小蠹高效趨避劑的製備及緩釋方法，按照本方法篩選和中 度危害林分所實施趨避性試驗，結果表明對苯乙基酮對雲南松小蠹具有高效的趨避功能， 且所製備工藝簡單，緩釋持續時間長，能夠完全覆蓋雲南松小蠹的蛀梢期。
【主權項】
1. 川滇榿木次生代謝物對苯乙基酮為趨避雲南松小蠹的緩釋劑，其特徵在於：該緩釋 劑以正己烷或正戊烷或石油醚作為溶劑，以對苯乙基酮為溶質，配置對苯乙基酮溶液，用於 趨避雲南松小蠹危害程度不同的林分。2. 根據權利要求1所述的緩釋劑，其特徵在於:該緩釋劑的對苯乙基酮濃度與雲南松小 蠹對林分危害程度呈正相關。3. 根據權利要求1或2所述的緩釋劑，，其特徵在於：該緩釋劑以正己烷作為溶劑，以對 苯乙基酮為溶質，配置濃度50~750 ng/uL對苯乙基酮溶液。4. 一種應用如權利要求1所述緩釋劑的方法，其特徵在於:將緩釋製劑盛入頂端開孔口 的緩釋瓶中，以揮發物釋放量多寡確定頂端開孔口大小，樹高塔式交叉懸掛於衰弱木枝幹 和枝梢各個方位上，直至緩釋瓶內的緩釋液釋放完畢，以顯著降低雲南松小蠹對雲南松松 梢和新萌發鬆梢的危害。5. 根據權利要求4所述的應用方法，其特徵在於:緩釋劑濃度分別為50 ng/uL、100 ng/ uL、500 ng/uL，分別對應雲南松小蠹危害程度為低、中、高三種林分。6. 根據權利要求4或5所述的應用方法，其特徵在於:緩釋瓶為20 mL的塑料瓶，緩釋瓶 的頂端開孔口的孔徑為0.05~0.10 mm。7. 根據權利要求4或5所述的應用方法，其特徵在於:樹高塔式交叉懸掛於衰弱木枝幹 和枝梢各個方位上，環形等距排列，每株懸掛8~50個。8. 根據權利要求6所述的應用方法，其特徵在於:樹高塔式交叉懸掛於衰弱木枝幹和枝 梢各個方位上，環形等距排列，每株懸掛8~50個。
【專利摘要】川滇榿木次生代謝物對苯乙基酮為趨避雲南松小蠹的緩釋劑及方法。本發明以正己烷或正戊烷或石油醚為溶劑、以對苯乙基酮為溶質配置對苯乙基酮溶液，用於趨避雲南松小蠹危害程度不同的林分；對苯乙基酮濃度與雲南松小蠹對林分危害程度正相關。應用是將緩釋劑濃度設置為50~500 ng/uL置於一頂端開口的緩釋瓶內，按方位、樹高塔式交叉懸掛於衰弱木枝幹枝梢上。本發明取材於雲南松小蠹的非寄主林木次生代謝物，趨避力強、持續周期長、價格低廉、環境友好，可持續用於控制雲南松小蠹的種群數量，推廣潛力大。
【IPC分類】A01N25/02, A01N35/04, A01M1/20, A01N25/18, A01P17/00
【公開號】CN105707060
【申請號】CN201610029911
【發明人】李宗波, 趙寧, 朱家穎, 楊斌, 王大偉, 澤桑梓
【申請人】西南林業大學, 雲南省林業有害生物防治檢疫局