一種高核酸釀酒酵母菌的選育方法與流程
2023-09-10 15:40:05 1
本發明屬於生物發酵技術領域，具體涉及一種高核酸釀酒酵母菌的選育方法。
背景技術：
核苷酸來源方法眾多，迄今為止，從酵母中提取核酸再進行分解的方法仍佔主導地位。一直以來，核酸都是從普通的麵包酵母中提取獲得，但麵包酵母中核酸含量一般為6-8%，從大生產經濟效益方面來看，成本核算很高，因此，選育核酸含量高的酵母菌種就成為了核酸工業生產的關鍵。
目前對於高核酸釀酒酵母的研究是當今的研究熱點之一，中國專利申請CN1498264A公開了一種「富核糖核酸啤酒酵母菌種及其製造方法」，該方法製備的酵母菌體中含有相當於菌體重量的10重量%以上的核糖核酸，但是不超過12重量%；中國專利申請CN101760437A公開了一種「高核酸麵包酵母及其製備方法」，該方法通過控制擴大培養的培養時間等條件，製備得到了含有相當於麵包酵母菌體重量的20重量%以上的核酸，其中RNA達到了9.5%以上；中國申請專利CN102559522A公開了「一種高核酸麵包酵母及其製備方法」， 該方法製備的酵母菌體中含有相當於菌體重量的20重量%以上的核酸，其中的RNA大於12重量%。
核酸用途極為廣泛，在食品工業上，核酸是開發新型食品調味品必不可少的原料。風行世界的第二代味精(強力味精)、第三代味精(風味味精)、特鮮醬油等新型調味品，都是核酸及其衍生物應用的結果。在醫藥工業上，核酸是製造治療冠心病、腫瘤、心肌梗塞等疾病藥物的原料。在農業上，核酸及其衍生物廣泛用作農作物（如水稻、瓜果、豆類等）的生長促進物質。
目前，國內富含I+G酵母抽提物所需要的高核酸釀酒酵母菌種性能比不上歐美、日本等國家，且高核酸釀酒酵母的生產技術尚不成熟。因此，研究高核酸釀酒酵母的發酵技術是我國酵母抽提物產業升級換代的必由之路。
因此，如果通過傳統方法選育出的富含高核酸釀酒酵母菌株，由該富含酵母進一步製備的酵母抽提物核酸系列產品，並將其轉化成工業化，從而製備出滿足市場需求的核酸生產，對整個的核酸工業將帶來極大的推動作用。
技術實現要素：
為解決上述問題，本發明提供一種高核酸釀酒酵母菌的選育方法，該方法選育的釀酒酵母菌RNA含量高，非轉基因工程菌，遺傳穩定，安全、無毒的產品，可以保證國家食品藥品安全性。
本發明通過以下技術方案實現的：
一種高核酸釀酒酵母菌的選育方法，從釀酒酵母菌種中通過初篩和復篩後，經培養基的優化，再經過小試和中試發酵工藝優化進行擴大化培養，獲得高核酸釀酒酵母菌，酵母菌的RNA含量為14.6%-15.2%。
優選地，初篩和復篩菌種採用的培養基質量分數組成均為：5-10%的蔗糖、3%的酵母浸粉、0.1%的硫酸鎂、0.02%硫酸鋅、0.01%硫酸亞鐵和0.1%的磷酸二氫鉀，餘量為水，調PH至4.8。
優選地，所述的培養基優化所使用的培養基的質量分數組成為：10%的蔗糖、3%的酵母浸粉、0.1%的硫酸鎂、0.02%硫酸鋅、0.01%硫酸亞鐵和0.1%的磷酸二氫鉀，餘量為水，調PH至4.8。
優選地，所述小試和中試發酵工藝所採用的培養基配方均為（10L發酵液）為：糖蜜1.5L、硫酸銨180g、磷酸二氫銨28g、硫酸鎂5g、硫酸鋅1g，餘量為水；糖蜜的含糖量為28-32(g/dL)。
更優選地，所述的小試和中試發酵工藝中，其糖蜜、硫酸銨和磷酸二氫銨的補加方式為流加方式。
上述所述的選育方法中，小試、中試的發酵工藝：初始菌體溼重為40-60g/L；放罐溼重為180-220g/L；發酵周期為5-10小時；溫度為29-31℃；pH為4.8-5.5。
更優選地，所述的小試、中試的發酵工藝為：初始菌體溼重為50g/L；放罐溼重為200g/L；發酵周期為7小時；溫度為30℃；pH為5.2。
根據本發明的選育方法，篩選出的一株富含高核酸的酵母菌株，經培養基優化、發酵工藝優化後，製備出的高核酸釀酒酵母，其RNA含量最高達到15.2%。
菌株具有下述性質：
1、菌落形態學特徵：
在蔗糖—酵母浸粉培養基中培養，30℃，3天，細胞呈球形或者卵形，大小為3～10μm×4～20μm。在麥芽汁瓊脂上菌落為白色到奶油色，稍有光澤。培養時間長時，菌落變硬。
2、生理與生化特性：
菌株典型的兼性厭氧型單細胞真菌。在有氧的情況下，它進行有氧呼吸，排出二氧化碳；而在缺氧的條件下，其進行無氧呼吸，分解有機物（主要是葡萄糖），產生酒精和水；該菌的最佳生長溫度為 30℃，最適pH值為 5.2。
3、營養特徵：
該菌能利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖或糖蜜。
本發明的有益成果：
1.本發明中的菌株屬於釀酒酵母菌，通過傳統的選育方法從大量釀酒酵母中篩選出一株富含高核酸的酵母菌株，與傳統的輻射法及化學誘變劑相比，該酵母為非轉基因工程菌，遺傳穩定、易於獲得理想新品種，是安全、無毒的產品，可直接在醫藥、食品、農業、化妝品等方面使用。
2.本發明篩選的釀酒酵母菌，選用糖蜜為碳源，硫酸銨為氮源，磷酸二氫銨為磷源，原料易得，價格低廉，工業化生產成本低；其製備的酵母核酸含量高，利於大規模的工業化生產。
3.本發明生產的高核酸釀酒酵母，做成酵母抽提物核酸系列產品，或者直接由酵母製取高核苷酸（I+G）酵母抽提物和高蛋白飼料，並通過單細胞蛋白(飼料酵母) 生產技術消化生產過程中的廢水，屬於環境友好工程，能夠節能減排實現零排放。
4.本發明解決了目前酵母核酸含量低，工業化生產成本高的難題，通過本發明可以實現大規模工業化生產製備高核酸釀酒酵母，具有高產性狀穩定的特點，生產核糖核酸的性能保持穩定，滿足人民日益增長的生活需求的核酸生產，對整個的核酸工業將帶來極大的推動作用。
具體實施方式
為了更好地理解本發明的實質，下面通過具體實施例對本發明的技術方案進行進一步的闡述。
實施例1
從釀酒酵母中選育高核酸釀酒酵母菌株：採用優化後的培養基為（均為質量分數）：10%的蔗糖、3%的酵母浸粉、0.1%的硫酸鎂、0.02%硫酸鋅、0.01%硫酸亞鐵和0.1%的磷酸二氫鉀，餘量為水，調PH至4.8。
培養基分裝於500mL三角瓶中，裝液量100mL，經121℃，20min高壓蒸汽滅菌後，將待篩選菌株置於上述無菌培養基中，在30℃，轉速120rpm條件下培養48h，進行初篩。其結果如下表1所示。
表1：各菌株核酸含量（轉換成1g絕乾酵母中RNA的含量mg）
由初篩結果選出HN2、HN4、HN14、HN16、HN25、HN26和HN31，對這7株菌株進行復篩，復篩所用培養基和培養方法同初篩。其結果如下表2所示。
表2：各菌株核酸含量（轉換成1g絕乾酵母中RNA的含量mg）
由初篩和復篩結果顯示，RNA含量最高菌株為HN2。
實施例2
將上述經初篩和復篩所得的高核酸釀酒酵母菌株HN2進行搖瓶培養基優化：採用不同的碳源、氮源（百分含量為質量分數）。
（1）10%的蔗糖、3%的酵母浸粉、0.1%的硫酸鎂、0.02%硫酸鋅、0.01%硫酸亞鐵和0.1%的磷酸二氫鉀，PH4.8；
（2）10%的葡萄糖、3%的酵母浸粉、0.1%的硫酸鎂、0.02%硫酸鋅、0.01%硫酸亞鐵和0.1%的磷酸二氫鉀，PH4.8；
（3）10%的麥芽糖、3%的酵母浸粉、0.1%的硫酸鎂、0.02%硫酸鋅、0.01%硫酸亞鐵和0.1%的磷酸二氫鉀，PH4.8；
（4）10%的蔗糖、3%的硫酸銨、0.1%的硫酸鎂、0.02%硫酸鋅、0.01%硫酸亞鐵和0.1%的磷酸二氫鉀，PH4.8。
經實驗，酵母RNA含量結果顯示最優化培養基為：（1）：10%的蔗糖、3%的酵母浸粉、0.1%的硫酸鎂、0.02%硫酸鋅、0.01%硫酸亞鐵和0.1%的磷酸二氫鉀，PH4.8。
實施例3
30L發酵罐小試實驗
菌種擴培：斜面高核酸釀酒酵母HN2，接種於1L上述優化的無菌培養基中，於30℃，轉速120rpm，搖床培養24h，待用。先在30L發酵罐進行種子擴培，種子擴培採用傳統的酵母發酵工藝進行，將所得的菌種進行商品發酵。
發酵工藝如下：
菌種：上述擴培後的菌種1L（溼重500g/L）；發酵罐底料：9L水，15g硫酸鎂，3g硫酸鋅；碳源：糖蜜（含還原糖30g/dL）4.5L；氮源：硫酸銨540g；磷源：磷酸二氫銨84g，將氮源、磷源溶解於800mL水中。PH控制用25%碳酸鈉溶液。碳、氮、磷源和碳酸鈉溶液均在121℃，20min高壓蒸汽滅菌後使用，補料採用流加方式。其工藝參數如下表3所示：
表3：發酵工藝控制表
分別在5、6、7、8、9、10小時取樣檢測RNA含量，其結果如下表4所示：
表4：不同發酵時間RNA含量
由表4數據結果可見，本發明篩選的高核酸釀酒酵母，在小試（30L發酵罐）中，發酵7小時，RNA含量最高為15.22%。
實施例4
30L發酵罐小試工藝優化
通過改變不同的接種量、發酵周期、發酵溫度、PH等條件採用正交實驗的方法，進行小試發酵工藝優化實驗，通過檢測發酵酵母的RNA含量，得出最佳的小試發酵工藝為：初始菌體溼重為40-60g/L（優選50g/L）；放罐溼重為180-220g/L（優選200g/L）；發酵周期為6-8小時（優選7小時）；發酵溫度29-31℃（優選30℃）；發酵pH值為4.8-5.5（優選5.2）。
實施例5
高核酸釀酒酵母產業化生產工藝（300m3）
菌種擴培：斜面高核酸釀酒酵母HN2，接種於10L不鏽鋼培養罐，培養完畢後接於10M3發酵罐，其培養完畢後再接入到300m3大發酵罐中進行種子擴培，種子擴培採用傳統的酵母發酵工藝進行，將所得的菌種進行離心、溶解後進行商品發酵。碳源：糖蜜（含還原糖30g/dL）45m3；氮源：硫酸銨5400 kg；磷源：磷酸二氫銨840kg，將氮源、磷源溶解於8m3熱水中。商品發酵工藝如下表5所示：
表5：商品發酵工藝參數表
分別在5、6、7、8、9、10小時取樣檢測RNA含量，其結果如下表6所示：
表6：不同發酵時間RNA含量
由表6數據結果可見，本發明篩選的高核酸釀酒酵母，在大生產中，發酵7小時，RNA含量最高為14.62%。
實施例6
將釀酒酵母菌HN2連續培養1-5代的菌種，生產核糖核酸的性能見表7
以上是對本發明所提供的一種富含高核酸釀酒酵母的選育及其產業化技術的實施例詳細介紹。在大量釀酒酵母菌種中通過傳統選育方法獲得一株富含高核酸的酵母菌種，再經培養基的優化獲得穩定、富含核酸的工業生產用酵母菌種。在此基礎上，再經過小試、中試發酵工藝優化，將其轉化為工業化生產，上述最優化工藝，小試中RNA含量高達15.22%，大生產中RNA達到14.62%。為此，本發明所提供的一種富含高核酸釀酒酵母的選育及其產業化技術適於在生產中全面推廣。