馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的液相晶片檢測引物及檢測方法

2023-09-10 15:50:10

馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的液相晶片檢測引物及檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的液相晶片檢測引物及檢測方法。本發明提供了用於液相晶片檢測或輔助檢測馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的試劑盒，由引物組和探針，所述引物組由引物1和引物2組成。本發明的實驗證明，本發明的檢測方法能夠對樣品進行快速檢測，從樣品處理到出結果僅需4小時左右；本發明設計的引物與番茄上常見的幾種植物病毒不發生交叉反應，可降低非特異性擴增造成的假陰性結果。
【專利說明】馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的液相晶片檢測引物及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於植物病毒檢測【技術領域】，具體涉及一種馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的液相晶片檢測引物及檢測方 法。
【背景技術】
[0002]馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(Potato spindle tuber viroid, PSTVd)屬於馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科(Pospiviroidae)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒屬(Pospiviroid)。目前我國已將該類病毒列入禁止進境的植物檢疫性有害生物名錄(參見《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》)。
[0003]馬鈴薯紡錘塊莖類病毒在馬鈴薯生產中造成20%_70%的產量損失，如果與馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯Y病毒等其他馬鈴薯病毒混合侵染，會造成更為嚴重的產量損失。該類病毒還會導致馬鈴薯塊莖的紡錘狀畸形和開裂，造成品質嚴重下降。目前防治馬鈴薯病毒類病害的唯一方法是通過組織培養脫毒生產無毒種薯，由於不能通過莖尖剝離技術脫除馬鈴薯紡錘塊莖類病毒，只能選用不帶有馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的薯塊生產脫毒馬鈴薯種薯，因此到目前，淘汰除掉感病馬鈴薯，再用未感染馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的健康薯塊生產脫毒種薯是預防和控制馬鈴薯紡錘塊莖類病毒病發生和傳播擴散的有效方法。類病毒的檢測技術和檢疫鑑定方法是對外來種薯實施有效檢疫、健康種薯生產、阻止傳播和擴散的關鍵性技術環節。
[0004]為防止馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(特別是強毒株系S株系)傳入我國和阻止國內M株系的擴散，必須加強內外檢疫措施；採用快速便捷、靈敏、高效、準確的檢測技術和可操作的檢疫鑑定方法就是實施有效植物檢疫的關鍵技術保障。目前在該病毒的檢測上，較常用的方法有兩種，一種是聚丙烯醯胺凝膠電泳(Return-Polyacrylamide GelElectrophoresis, R-PAGE)，常見的有DAS-ELISA ;另一種是分子生物學檢測方法，其中以RT-PCR最為常見。
[0005]液相晶片檢測技術是一種快速高通量檢測技術，是對生物晶片技術的繼承和發展，該技術集多種生化技術於一體，具有獨特的優點:可通過不同螢光編碼微球同時檢測上百種不同的病原分子，滿足高通量檢測需要；相對於固相晶片，反應在液態體系中進行，可大大縮短檢測時間；檢測所需樣本少(最少可至Iu L)。該技術已用於李痘病毒(Plum poxvirus, PPV)的檢測；到目前為止，國內外還未見應用該技術檢測馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的報導。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的液相晶片檢測引物及檢測方法，即一種操作簡單、結果準確的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒液相晶片檢測方法及其所用到的引物，從而彌補現有技術的不足。
[0007]本發明的一個目的是提供用於液相晶片檢測或輔助檢測馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的試劑盒。
[0008]本發明提供的試劑盒，包括引物組和探針，所述引物組由引物I和引物2組成；
[0009]所述引物I的核苷酸序列為序列表中序列I ;
[0010]所述引物2的核苷酸序列為序列表中序列2 ；
[0011]所述探針的序列為NH3-C12-T1，所述Tl的核苷酸序列為序列表中序列3。
[0012]上述C12與所述Tl的5』末端連接，C12為12個C原子；NH3_為氨基修飾。
[0013]上述試劑盒中，所述引物組的各條引物及所述探針均為獨立包裝。
[0014]本發明的另一個目的是提供用於液相晶片檢測或輔助檢測馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的引物組或探針。
[0015]本發明提供的引物組由引物I和引物2組成；
[0016]所述引物I的核苷酸序列為序列表中序列I ;
[0017]所述引物2的核苷酸序列為序列表中序列2 ；
[0018]本發明提供的所述探針的序列為NH3-C12-T1，所述Tl的核苷酸序列為序列表中序列3。
[0019]上述的試劑盒或上述的引物組或探針中，所述引物2的5』末端標記生物素。
[0020]上述的引物組或探針在製備用於液相晶片檢測或輔助檢測馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的試劑盒中的應用也是本發明保護的範圍。
[0021]本發明的第三個目的是提供用於液相晶片檢測或輔助檢測馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的試劑盒。
[0022]本發明提供的試劑盒，包括上述的引物組或探針。
[0023]上述試劑盒中，所述試劑盒中的引物組的各條引物或所述探針均為獨立包裝。
[0024]上述的試劑盒或所述的引物組或探針在用液相晶片檢測或輔助檢測馬鈴薯紡錘塊莖類病毒或用液相晶片檢測或輔助檢測待測樣品中是否攜帶馬鈴薯紡錘塊莖類病毒中的應用也是本發明保護的範圍。
[0025]本發明第四個目的是提供一種用液相晶片檢測或輔助檢測待測樣品中是否攜帶馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的方法。
[0026]本發明提供的方法，包括如下步驟:
[0027]I)提取待測樣品中的RNA作為模板，反轉錄得到cDNA ；
[0028]2)生物素化的擴增產物和交聯探針的微球的獲得:
[0029]所述生物素化的擴增產物按照如下方法製備:以所述cDNA為模板，用上述的試劑盒中的引物組進行RT-PCR擴增，得到生物素化的擴增產物；
[0030]所述交聯探針的微球按照如下方法製備:上述的試劑盒中的探針與微球(此微球為液相晶片檢測中常用的微球)進行共價偶聯(探針的氨基和微球表面的羧基通過醯胺鍵連接)，得到交聯探針的微球；具體採用BIO-RAD公司的Bio-Plex COOH Bead28試劑盒進行，產品目錄號為:171-506028 ;或者按照實施例2的一的3中記載的方法製備。
[0031]3)將所述生物素化的擴增產物與所述交聯探針的微球雜交，得到的雜交產物再進行液相晶片檢測，·
[0032]若液相晶片定性比值(樣品螢光強度中位值平均值與空白對照MFI的平均值的比值)大於等於2，則待測樣品中攜帶或候選攜帶馬鈴薯紡錘塊莖類病毒；[0033]若液相晶片定性比值(樣品螢光強度中位值平均值與空白對照MFI的平均值的比值)小於2，則待測樣品中不攜帶或候選不攜帶馬鈴薯紡錘塊莖類病毒。
[0034]上述方法中，所述RT-PCR擴增的體系中，所述引物組中的各條引物按照等摩爾比配置；
[0035]所述RT-PCR 擴增程序:95 °C 5min ；94 °C 30s, 50 °C 30s, 72 °C 20s, 30 個循環；72 °C 5min。
[0036]本發明為實現上述目的，採用了液相晶片技術。該技術是在核酸水平上的一種檢測技術，具有準確性好和靈敏度高的特點。其原理是將編碼微球單個逐一通過檢測通道時受到雙色雷射同時照射，第一束雷射激發微球的分類螢光，根據螢光編碼確定微球的類別，即微球內部的兩種螢光物質受激發後可發射兩種不同波長的螢光，不同類別微球內部這兩種螢光物質比例不同，則螢光強度比例也不同，從而將不同的特異性反應區分開來；第二束雷射激發報告分子上的突光素，根據突光強度確定微球上結合的報告分子的數量從而確定目標分子的數量。各種螢光信號經分析軟體進行數位化處理，可獲得檢測物的種類和數量。
[0037]本發明的實驗證明，本發明的引物和探針能夠對樣品進行快速檢測，從樣品處理到出結果僅需4小時左右；本發明設計的引物與番茄上常見的幾種植物病毒不發生交叉反應，可降低非特異性擴增造成的假陰性結果。由於液相晶片檢測技術具有特異性強、通量高及快速的特點，適合在進境種苗量較大的口岸應用，可以在保障安全的情況下有效的提高通關速度，從而促進國際貿易的發展。該方法還適用於經常發生複合侵染的塊莖類種苗的口岸檢疫及田間監測，可以大幅提高檢測效率。這為防止馬鈴薯紡錘塊莖類病毒進入我國提供了技術儲備，也為其 他同類病毒的快速高通量檢測提供了借鑑和經驗。
【具體實施方式】
[0038]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0039]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0040]番茄斑萎病毒(TSWV):記載在「3種番茄斑萎病毒屬病毒多重RT-PCR檢測方法的建立.上海農業學報，2012，(28) 3:32-36.」 一文上，公眾可從黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心獲得，用該病毒感染番爺(Lycopersicon.esculentum)葉片。
[0041]番茄黑環病毒(TBRV):記載在「番茄黑環病毒分子生物學檢測方法及分離物序列分析.植物檢疫，2006,20 (5):275-278.」 一文上，公眾可從黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心獲得，用該病毒感染番爺(Lycopersicon.esculentum)葉片。
[0042]馬鈴薯A病毒(PVA):記載在「雙引物探針RT-Real timePCR檢測馬鈴薯A病毒.植物檢疫,2009，26 (1):26-28.」 一文上，公眾可從黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心獲得，用該病毒感染本生煙(Nicotiana benthamiana)葉片。
[0043]馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTVd):記載在「烏魯木齊地區馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的檢測與序列分析.西北農業學報，2010，19 (9):38-42.」 一文上，公眾可從黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心獲得，用該病毒感染馬鈴薯(Solanum tuberosum)葉片。
[0044]金魚花潛隱類病毒(CLVd):記載在「Columnea latent viroid(CLVd) intomato:the first report in the United Kingdom.New Disease Reports(2009)19, 30.」一文上，公眾可從黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心獲得，用該病毒感染番茄(Lycopersicon.esculentum)葉片。
[0045]實施例1、馬鈴薯紡錘塊莖類病毒液相晶片檢測引物、探針及試劑盒的製備
[0046]根據NCBI已報導的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的核苷酸序列，利用PrimerPremier5.0軟體設計引物和探針，最終篩選出一對具有高特異性的引物和探針並進行人工合成，序列如表1所示。
[0047]表1設計的引物和預期目的片段長度
[0048]
【權利要求】
1.用於液相晶片檢測或輔助檢測馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的試劑盒，包括引物組和探針，所述引物組由引物I和引物2組成； 所述引物I的核苷酸序列為序列表中序列I ; 所述引物2的核苷酸序列為序列表中序列2 ； 所述探針的序列為NH3-C12-T1，所述Tl的核苷酸序列為序列表中序列3。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於:所述引物組的各條引物及所述探針均為獨立包裝。
3.用於液相晶片檢測或輔助檢測馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的引物組或探針: 所述引物組由引物I和引物2組成； 所述引物I的核苷酸序列為序列表中序列I ; 所述引物2的核苷酸序列為序列表中序列2 ； 所述探針的序列為NH3-C12-T1，所述Tl的核苷酸序列為序列表中序列3。
4.根據權利要求1或2所述的試劑盒或權利要求3所述的引物組或探針，其特徵在於:所述引物2的5』末端標記生物素。
5.權利要求3或4所述的引物組或探針在製備用於液相晶片檢測或輔助檢測馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的試劑盒中的應用。`
6.用於液相晶片檢測或輔助檢測馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的試劑盒，包括權利要求3或4所述的引物組或探針。
7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特徵在於:所述引物組的各條引物或所述探針均為獨立包裝。
8.權利要求1或2或6或7所述的試劑盒或權利要求3或4所述的引物組或探針在用液相晶片檢測或輔助檢測馬鈴薯紡錘塊莖類病毒或用液相晶片檢測或輔助檢測待測樣品中是否攜帶馬鈴薯紡錘塊莖類病毒中的應用。
9.用液相晶片檢測或輔助檢測待測樣品中是否攜帶馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的方法，包括如下步驟: 1)提取待測樣品中的RNA作為模板，反轉錄得到cDNA； 2)生物素化的擴增產物和交聯探針的微球的獲得: 所述生物素化的擴增產物按照如下方法製備:以所述cDNA為模板，用權利要求1或2所述的試劑盒中的引物組進行RT-PCR擴增，得到生物素化的擴增產物； 所述交聯探針的微球按照如下方法製備:權利要求1或2所述的試劑盒中的探針與微球進行共價偶聯，得到交聯探針的微球； 3)將所述生物素化的擴增產物與所述交聯探針的微球雜交，得到的雜交產物再進行液相晶片檢測， 若液相晶片定性比值大於等於2，則待測樣品中攜帶或候選攜帶馬鈴薯紡錘塊莖類病毒；若液相晶片定性比值小於2，則待測樣品中不攜帶或候選不攜帶馬鈴薯紡錘塊莖類病毒。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於:所述RT-PCR擴增的體系中，所述引物組中的各條引物按照等摩爾比配置；
所述 RT-PCR擴增程序:95V 5min ；94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 20s，30 個循環；72°C 5min。
【文檔編號】C12N15/11GK103667527SQ201310642994
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月3日 優先權日:2013年12月3日
【發明者】劉洪義, 張永江, 張洪祥, 劉忠梅, 辛言言, 朱水芳 申請人:黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心