褐藻多糖及其製備方法和用途與流程
2023-09-10 13:47:10
本發明涉及藥物領域，具體地，涉及一類新穎的褐藻多糖及其製備方法和在治療神經退行性疾病的應用。
背景技術：
早老性痴呆即阿爾茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)，是一類神經退行性疾病，其症狀表現主要是病人記憶和認知能力不同程度地喪失，行為活動發生障礙。ad的發病機制還不十分清楚，可能與細胞的衰老、遺傳基因、神經遞質損傷和炎症等多種因素有關。
目前臨床應用或處於臨床研究中的抗ad藥物主要是從提高腦神經中的ach水平出發，恢復ach神經傳導，改善病人的記憶、認知和行為能力，延緩病情的發展。其中一類藥物是擬膽鹼藥物，另一類藥物是促進腦神經中ach釋放的藥物。
常用的防治藥物包括中樞興奮劑、改善膽鹼能的物質和腦血液循環改善劑等，然而這些藥物存在療效不確切、特異性不強或毒副作用大，口服吸收差，治標不治本等缺點，因而限制了它們的應用。
綜上所述，本領域迫切需要開發新的能夠有效用於改善記憶和/或治療神經退行性疾病的藥物。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種預防和/或治療神經退行性疾病的藥物。
本發明第一方面，提供了一種植物多糖，所述的植物多糖是由單糖單元組成的雜多糖，並且所述的單糖單元包括(i)巖藻糖，(ii)甘露糖，以及(iii)任選的葡萄糖和/或半乳糖。
在另一優選例中，所述的植物多糖中單糖單元包括巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。
在另一優選例中，所述的植物多糖中單糖單元包括巖藻糖、甘露糖和葡萄糖。
在另一優選例中，所述的植物多糖中單糖單元包括巖藻糖、甘露糖和半乳糖。
在另一優選例中，所述的植物多糖還含有選自下組的單糖單元：木糖、鼠李糖、或其組合。
在另一優選例中，所述的植物多糖中單糖單元包括2、3、4、5、6種單糖單元。
在另一優選例中，所述的植物多糖中單糖單元包括木糖、鼠李糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖、和半乳糖。
在另一優選例中，所述的植物多糖為褐藻多糖。
在另一優選例中，所述的褐藻包括褐藻門馬尾藻科植物。
在另一優選例中，所述的褐藻包括馬尾藻羊棲菜。
在另一優選例中，所述的植物多糖中甘露糖單元的摩爾含量≥50％,較佳地≥70％，更佳地≥80％，最佳地≥85％，按植物多糖中所有單糖單元的總量計。
在另一優選例中，所述的植物多糖中甘露糖單元的摩爾含量為60-93％,較佳地70-92％，更佳地75-91％，最佳地80-90％，按植物多糖中所有單糖單元的總量計。
在另一優選例中，所述的植物多糖選自下組：
(a)一種植物多糖，其中所含的單糖的摩爾比為，巖藻糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖＝1～2∶20～30∶0.5～2∶1；
(b)一種植物多糖，其中所含的單糖的摩爾比為，巖藻糖∶甘露糖∶半乳糖＝1～2∶20～40∶1；
(c)一種植物多糖，其中所含的單糖的摩爾比為，巖藻糖∶甘露糖∶葡萄糖＝1～2∶25～30∶0.5～2；
(d)一種植物多糖，其中所含的單糖的摩爾比為，巖藻糖∶甘露糖＝1～2∶20～30。
在另一優選例中，所述的植物多糖的分子量為100～350kda。
在另一優選例中，所述的植物多糖的分子量小於250kda的組分佔全部多糖分子的百分比≥70％(如70-90％)。
在另一優選例中，所述的植物多糖的分子量分布指數為1.2～2.0。
在另一優選例中，所述植物多糖具有選自下組的一個或多個特徵：
(1)糖殘基摩爾比為巖藻糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖＝1.96∶21.00∶1.88∶1.00；
(2)分子量為140～300kda；
(3)分子量分布指數為1.2～2.0；
(4)甘露糖的含量為25～40wt％，按植物多糖總重量計；
(5)糖醛酸8～20wt％，按植物多糖總重量計；
(6)蛋白質含量0.1～1wt％，按植物多糖總重量計；
(7)硫酸基含量10～15wt％，按植物多糖總重量計；
(8)連接方式包括選自下組的單糖連接方式：末端、1,2-、1,2,3-、1,2,3,4-和1,2,4,6-連接的甘露糖；末端、1,2,4-、1,4-、1,6-連接的半乳糖和葡萄糖；末端、1,2,4-、1,3-和1,4-連接的巖藻糖；
(9)硫酸基位置選自下組：甘露糖的4位及6位，巖藻糖的2、3、4位(部分巖藻糖可同時存在2個硫酸基)。
在本發明的第二方面，提供了一種褐藻多糖，所述褐藻多糖的分子量為100kda-350kda(較佳地，140kda-300kda，更佳地，140kda-250kda)；
並且所述褐藻多糖中含有以下單糖單元：甘露糖和巖藻糖，
其中，按褐藻多糖中所有單糖單元的總量計，所述甘露糖的摩爾含量為50％-93％(較佳地，60％-90％；更佳地，80％-90％)；以及
所述巖藻糖的摩爾含量為3％-10％(較佳地，4％-8％，更佳地，5％-6％)。
在另一優選例中，所述褐藻多糖分子量分布指數為1-4，較佳地，1.5-3或1-2，更佳地1.2-2.0。
在另一優選例中，所述褐藻多糖還包括葡萄糖和半乳糖。
在另一優選例中，所述褐藻多糖還包括木糖和鼠李糖。
在另一優選例中，所述巖藻糖和甘露糖的摩爾比為1-10：20-30，較佳地，1-5：20-30，更佳地，1-3：20-30，最佳地，1-2：20-30。
在另一優選例中，所述葡萄糖和半乳糖的摩爾比為0.2-10：1，較佳地，0.5-10：1，更佳地，0.5-5：1，最佳地，0.5-2：1。
在另一優選例中，所述巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩爾比為1-10：20-40：0.2-10：1，較佳地，1-5：20-35：0.5-6：1，更佳地，1-3：20-30：0.5-5：1，最佳地，1-2：20-30：0.5-1：1。
在另一優選例中，在所述褐藻多糖中，當巖藻糖的摩爾比率為1時，所述甘露糖的摩爾比率為2-30，較佳地，15-30，更佳地，20-30；所述半乳糖的摩爾比率為0.02-5，較佳地，0.02-4，更佳地，0.1-3，最佳地，0.5-2；所述葡萄糖的摩爾比率為1，較佳地，0.5-2，更佳地，0.5-1。
在另一優選例中，所述甘露糖在所述褐藻多糖的摩爾比為60％-93％，較佳地，70％-90％，更佳地，80％-90％。
在另一優選例中，所述褐藻多糖來自馬尾藻科植物，如羊棲菜。
在另一優選例中，所述褐藻多糖具有如下式所示的結構單元：
r2＝[→4)-α-d-glcp-(1→或→4)-α-d-glcp-(1→]
hex＝[gal、man或glc]
其中，m＝大於10的正整數。
在另一優選例中，m為50-300，更佳地為80-230。
在本發明的第三方面，提供了本發明第一方面所述的植物多糖或第二方面所述褐藻多糖的用途，它們被用於製備一組合物，所述組合物用於(a)改善記憶能力；和/或(b)用於預防和/或治療神經退行性疾病。
在另一優選例中，所述神經退行性疾病選自下組：阿爾茨海默病、帕金森氏病、原發性側索硬化或其組合。
在另一優選例中，所述的組合物包括：藥物組合物、保健品組合物、或食品組合物、或膳食補充劑組合物。
在另一優選例中，所述的組合物為藥物組合物。
在另一優選例中，所述的食品組合物包括飲料組合物。
在另一優選例中，所述的藥物組合物含有(a)本發明第一方面所述的植物多糖或第二方面所述褐藻多糖；和(b)藥學上可接受的載體。
在另一優選例中，所述組分(a)佔所述藥物組合物總重量的0.1-99.9wt％,較佳地10-99.9wt％，更佳地70％-99.9wt％。
在另一優選例中，所述組分(a)佔所述藥物組合物總重量的60.0％-99.5wt％，較佳地70.0-99.5wt％，更佳地80.0％-99.5wt％。
在另一優選例中，所述藥物組合物為液態、固體、或半固體。
在另一優選例中，所述藥物組合物的劑型包括片劑、顆粒劑、膠囊、口服液、或注射劑。
在另一優選例中，所述組合物或藥物還用於改善哺乳動物的記憶能力。
在另一優選例中，所述的記憶能力包括空間記憶能力。
在另一優選例中，所述改善哺乳動物的空間記憶能力包括(i)延長哺乳動物在在站臺周圍範圍i的路程和時間；和/或(ii)縮短哺乳動物第一次穿越平臺的時間，增加穿越平臺的次數。
在另一優選例中，所述哺乳動物包括人或非人哺乳動物。
在另一優選例中，所述非人哺乳動物包括齧齒動物，如小鼠、大鼠。
在本發明的第四方面，提供了一種藥物組合物，包括：
(a)本發明第一方面所述的植物多糖或第二方面所述褐藻多糖；和
(b)藥學上可接受的載體。
在本發明的第五方面，提供了一種治療神經退行性疾病的方法，包括：給需要的哺乳動物施用本發明第一方面所述的植物多糖、或第二方面所述褐藻多糖、或第四方面所述的藥物組合物。
在另一優選例中，所述的哺乳動物包括人或非人哺乳動物。
在另一優選例中，所述非人哺乳動物包括齧齒動物，如大鼠、小鼠。
在另一優選例中，施用劑量為100-2000mg/kg/天，較佳地，250-10000mg/kg/天，更佳地，500-10000mg/kg/天。
在另一優選例中，施用頻率為1-5次/天，較佳地1-2次/天。
在另一優選例中，施用包括一個或多個周期，各周期為2-30天，較佳地3-7天。
在本發明的第五方面，提供了一種改善哺乳動物空間記憶的方法，包括：給需要的哺乳動物施用本發明第一方面所述的植物多糖或第二方面所述褐藻多糖。
在另一優選例中，所述的方法是治療性或非治療性的。
在另一優選例中，所述的哺乳動物包括人或非人哺乳動物。
在另一優選例中，所述非人哺乳動物包括齧齒動物，如大鼠、小鼠。
在另一優選例中，施用劑量為100-2000mg/kg/天，較佳地，250-10000mg/kg/天，更佳地，500-10000mg/kg/天。
在另一優選例中，施用頻率為1-5次/天，較佳地1-2次/天。
在另一優選例中，施用包括一個或多個周期，各周期為2-30天，較佳地3-7天。
應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。
附圖說明
圖1顯示了本發明中一個實例中的褐藻多糖的高效凝膠色譜圖。
具體實施方式
本發明人經過長期而深入的研究，通過大量篩選和試驗，意外地發現，可從褐藻中分離獲得一類新穎的、水溶性高且具有改善神經系統功能的植物多糖。所述植物多糖是多種單糖單元(包括甘露糖、巖藻糖、以及葡萄糖和/或半乳糖等)按特定比例構成的褐藻多糖。試驗證明，本發明的褐藻多糖能夠顯著改善哺乳動物的空間記憶能力，並可用於預防和/或治療神經退行性疾病。在此基礎上，本發明人完成了本發明。
褐藻
適用於本發明的植物主要為褐藻。
典型的褐藻包括褐藻門馬尾藻科的植物。一種典型的褐藻為羊棲菜。
羊棲菜(sargassumfusiforme(harv.)setchel)屬於褐藻門馬尾藻科，又名海大麥、鹿角尖、海菜等。羊棲菜主要生長在北太平洋西部的暖溫帶水域，在我國分布十分廣泛，北起遼東半島，沿山東和浙江，南至福建和廣東的淺海海域均有分布。羊棲菜肉厚多汁，營養價值高，在民間早已入藥，是我國傳統常用的藥食兩用藥材，以乾燥藻體全藻入藥，性味苦、鹹、寒而無毒，主要功效為軟堅散結、消痰、清涼解毒、破血祛瘀、利水消腫，用於癭瘤、睪丸腫痛、痰飲水腫。馬尾藻科植物羊棲菜作為藥用海藻被2015版中國藥典所收載。
褐藻多糖
如本文所用，術語「本發明多糖」、「本發明植物多糖」、「本發明褐藻多糖」可互換使用，指本發明第一方面中所所述的植物多糖或褐藻多糖。本發明的植物多糖是主要由二種或多種單糖單元(如甘露糖、巖藻糖、葡萄糖、半乳糖)構成的雜多糖。
在本發明中，所述褐藻多糖的來源沒有特別限制。在一優選實施方式中，所述褐藻多糖可提取自海洋植物，如馬尾藻科植物的羊棲菜。
典型地，本發明的植物多糖是由單糖單元組成的雜多糖，並且所述的單糖單元包括(i)巖藻糖，(ii)甘露糖，以及(iii)任選的葡萄糖和/或半乳糖。此外，本發明的植物多糖還含有選自下組的其它單糖單元：木糖、鼠李糖、或其組合。
在本發明的褐藻多糖中，為甘露糖為主。典型地，甘露糖單元的摩爾含量≥50％,較佳地≥70％，更佳地≥80％，最佳地≥85％，按植物多糖中所有單糖單元的總量計。例如，所述甘露糖的摩爾含量為50％-95％，較佳地，60％-90％，更佳地，70-90％，最佳地，80％-90％。
在本發明的褐藻多糖中，巖藻糖、葡萄糖、半乳糖或其它微量單糖單元之間的比例沒有限制。
優選地，所述巖藻糖和甘露糖的摩爾比為1-10：20-30，較佳地，1-5：20-30，更佳地，1-3：20-30，最佳地，1-2：20-30。
優選地，所述葡萄糖和半乳糖的摩爾比為0.2-10：1，較佳地，0.5-10：1，更佳地，0.5-5：1，最佳地，0.5-2：1。
優選地，所述巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩爾比為1-10：20-40：0.2-10：1，較佳地，1-5：20-35：0.5-6：1，更佳地，1-3：20-30：0.5-5：1，最佳地，1-2：20-30：0.5-1：1。
在本發明所述的褐藻多糖中，當巖藻糖的摩爾比率為1時，
所述甘露糖的摩爾比率為2-30，較佳地，15-30，更佳地，20-30；
所述半乳糖的摩爾比率為0.02-5，較佳地，0.02-4，更佳地，0.1-3，最佳地，0.5-2；和/或
所述葡萄糖的摩爾比率為0.2-2，較佳地，0.5-2，更佳地，0.5-1。
在一優選實施方式中，所述褐藻多糖還包括微量或少量的其它單糖單元，例如木糖和鼠李糖。
試驗表明，本發明的褐藻多糖可顯著改善哺乳動物(如小鼠)的空間記憶能力，因此，可用於治療神經退行性疾病。
製備方法
本發明還提供了製備本發明褐藻多糖的方法。用於製備褐藻多糖的試劑和設備為常規的，可市售獲得。
在一優選實施方式中，本發明的製備方法包括：
步驟一提取-過濾：取褐藻(如羊棲菜)加水，加熱至沸騰後，提取一段時間(如1-24小時，較佳地2-12小時，更佳地3～4小時)，然後過濾。其中，該提取-過濾步驟可重複提取，如重複2次或多次(如2-6次)，並合併濾液。
步驟二濃縮-醇沉(高濃度醇沉)：取步驟一的濾液，進行濃縮(通常濃縮至濾液體積的約1/6-1/15，較佳地1/9～1/11)，得到濃縮液；在濃縮液中加入醇溶劑(如乙醇)，至溶液中醇的體積分數達到一定比例(如70％～80％(v/v)的高濃度)，並攪拌形成沉澱(如攪拌1-6小時，較佳地3～4小時)；離心並收集第一高濃度醇溶劑的醇沉沉澱物；沉澱加水溶解，溶解後再加入醇溶劑(如乙醇)至溶液中直至醇溶劑的體積分數70％～80％；本醇沉步驟一般可重複2次或多次(如2-6次，較佳地2-4次，更佳地2-3次)，並收集最後一次醇沉沉澱物。
步驟三醇沉(低濃度醇沉)-濃縮：步驟二收集沉澱物加水溶解，然後加入醇溶劑(如乙醇)，至溶液中醇溶劑的體積分數為30％～40％，攪拌一段時間(如1-12小時，較佳地3～4小時)形成沉澱後，離心並收集低濃度醇溶劑的醇沉沉澱物和上清液；低濃度醇溶劑的醇沉沉澱物加水溶解，再加入醇溶劑(如乙醇)至溶液中乙醇體積分數為30％～40％，本醇沉步驟一般可重複2次或多次(如2-6次，較佳地2-4次，更佳地2-3次)；收集各次上清液合併，然後進行濃縮(通常濃縮至上清液總體積的約1/6-1/15，較佳地1/9～1/11)，得到濃縮的上清液。
步驟四醇沉(高濃度醇沉)：向步驟三濃縮上清液中加入醇溶劑(如乙醇)，至溶液中醇溶劑的體積分數為70％～80％，攪拌3～4小時後，離心，得第二高濃度醇溶劑醇沉沉澱物，沉澱加水溶解，加入醇溶劑(如乙醇)至溶液中醇溶劑的體積分數為70％～80％；本醇沉步驟一般可重複2次或多次(如2-6次，較佳地2-4次，更佳地2-3次)；收集最後一次的第二高濃度醇溶劑醇沉的沉澱物，即得褐藻多糖。
組合物及其應用
本發明還提供了一種組合物，其中包括有效量的褐藻多糖。本發明組合物包括藥物組合物、保健品組合物、或食品組合物、或膳食補充劑組合物；優選藥物組合物。
在一優選例中，所述的組合物為液態製劑、固態製劑、半固態製劑。在一優選例中，所述的液態製劑選自下組：溶液製品或懸浮液製品。
在一優選例中，所述的組合物的劑型選自下組：粉末劑、散劑、片劑、糖衣劑、膠囊劑、顆粒劑、懸浮劑、溶液劑、糖漿劑、滴劑、和舌下含片。
本發明藥物組合物可以以藥物片劑，針劑或膠囊的任一種形式給藥，所述藥物製劑包括賦形劑、藥物允許的媒介和載體，這些物質可根據給藥途徑進行選擇。本發明中藥物製劑可進一步包含輔助的活性組份。
乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、矽酸鈣、細結晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂或礦物油等都可用作本發明中藥物組合物的載體、賦形劑或稀釋劑等。
此外，本發明的藥物組合物可進一步包括潤滑劑、潤溼劑、乳化劑、懸浮液穩定劑、防腐劑、甜味劑和香料等。本發明的藥物組合物可通過多種公知的方法以腸衣製劑生產，以便於藥物組合物的活性成分能順利通過胃而不被胃酸所破壞。
說明書中「藥物有效量」是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。比如，在本發明中，可製備含有1％-99％(特別的，可含有30％—90％；更特別地，可含有50％—80％)的褐藻多糖的製劑。
當用於製備藥物組合物時，所用的褐藻多糖的有效劑量可隨施用的模式和待治療的疾病的嚴重程度而變化。適用於內服的劑量形式，包含與固態或液態藥學上可接受的載體密切混合的約含有1％-99％(特別的，可含有30％—90％；更特別地，可含有0％—80％)的褐藻多糖。可調節此劑量方案以提供最佳治療應答。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或將劑量按比例地減少。
所述的褐藻多糖可通過口服等途徑給予。固態載體包括：澱粉、乳糖、磷酸二鈣、微晶纖維素、蔗糖和白陶土，而液態載體包括：培養基、聚乙二醇、非離子型表面活性劑和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要適合褐藻多糖的特性和所需的特定給藥方式。在製備藥物組合物中通常使用的佐劑也可有利地被包括，例如調味劑、色素、防腐劑和抗氧化劑如維生素e、維生素c、bht和bha。
從易於製備和給藥的立場看，優選的藥物組合物是固態組合物，尤其是片劑和固體填充或液體填充的膠囊。口服給藥是優選的。
將本發明組合物施用給所述個體，每天給藥1次或多次。給藥劑量單位表示其形式上能分開且適用於人類或其他所有哺乳動物個體的劑量。每一單位含有藥物允許的載體和有效治療量的本發明的褐藻多糖。給藥量隨病人病情、所包括的補充活性組份和所使用的褐藻多糖而變化。此外如可能，可分開給藥，並且如需要可連續給藥。因此，所述給藥量不會對本發明造成限制。此外，本發明中的「組合物」不僅意味著藥品而且表示可作為功能性食品和健康補充食品。在一個優選例中，所述組合物包括：食品、保健品、藥品等。在本發明的一個優選例中，還提供了一種食品組合物，它含有有效量的磷結合劑，以及餘量的食品上可接受的載體，所述的食物組合物的劑型選自固體、乳品、溶液製品、粉末製品、或懸浮液製品。
在一優選例中，所述組合物的配方如下：
0.01-95wt％(較佳地0.1-90wt％，更佳地1-50wt％)的褐藻多糖；以及食品上或藥學上可接受的載體和/或賦形劑。
在另一優選例中，所述組合物的配方如下：
10-80wt％的褐藻多糖；以及食品上或藥學上可接受的載體和/或賦形劑。
本發明褐藻多糖或含有褐藻多糖的組合物能夠顯著改善哺乳動物的記憶能力(包括空間記憶能力)。
本發明褐藻多糖或含有褐藻多糖的組合物可以用來治療和/或預防哺乳動物的神經退行性疾病。
在本發明中，哺乳動物包括齧齒動物和靈長目，尤其人。
本發明的主要優點包括：
(1)本發明首次提取了含有甘露糖、巖藻糖、葡萄糖和半乳糖的褐藻多糖，本發明的褐藻多糖可顯著改善哺乳動物的空間記憶能力，因此可以用來治療和/或預防哺乳動物的神經退行性疾病。
(2)本發明的褐藻多糖來源於海洋植物(如馬尾藻科植物的羊棲菜)，因此具有副作用小、成本低、安全性好的特點。
(3)本發明的褐藻多糖製備工藝簡單，易於工業生產。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
本發明所用的試劑若未明確指明，則均購自於西格瑪-奧德裡奇(sigma-aldrich公司)。
實施例1褐藻多糖(供試品1)
步驟一，取羊棲菜藥材(2000g)，用20倍量的水浸泡並攪拌清洗，換水三次，濾幹，加入20倍體積的水，加熱至沸騰後，提取4h，過濾，重複提取2次，合併濾液。
步驟二，取濾液，濃縮至濾液體積的1/10，得到濃縮液，在濃縮液中加入乙醇，攪拌，直至溶液中乙醇的體積分數達到80％，攪拌4h後，離心並第一次收集沉澱物，然後加水溶解，加入乙醇，至溶液中乙醇的體積分數為80％，攪拌4h後，離心並第二次收集沉澱物，然後加水溶解，加入乙醇，至溶液中的乙醇體積分數為80％，攪拌4h後，離心，第三次收集沉澱物。
步驟三，第三次收集沉澱物加水溶解，然後加入乙醇，至溶液中乙醇的體積分數為40％，攪拌4h後，離心並第四次收集沉澱物和上清液，然後第四次收集沉澱加水溶解，加入乙醇，至溶液中的乙醇體積分數為40％，攪拌4h後，離心並第五次收集沉澱物和上清液，然後第五次收集沉澱物再次加水溶解，加入乙醇，至溶液中乙醇的體積分數為40％，攪拌4h後，離心並第六次收集上清液，合併第四次、第五次和第六次收集的上清液，濃縮至上清液總體積的1/10，得到濃縮的上清液。
步驟四，向濃縮的上清液中加入乙醇，至溶液中乙醇的體積分數為80％，攪拌4h後，離心，第七次收集沉澱物，然後加水溶解，加入乙醇，至溶液中乙醇的體積分數為80％，攪拌4h後，離心，第八次收集沉澱物，然後加水溶解，加入乙醇至溶液中乙醇的體積分數為80％，攪拌4h後，離心，第九次收集沉澱物52g，即為褐藻多糖(供試品1)。
經測定(見實施例5-7)，該製得的褐藻多糖中含有巖藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖(1～2∶20～30∶0.5～2∶1)為主的部位。分子量為140kda～300kda。
供試品1的褐藻多糖的高效凝膠色譜結果如圖1所示，表明褐藻多糖的純度很高。
基於分析，該褐藻多糖中具有下式所示的結構單元：
r2＝[→4)-α-d-glcp-(1→or→4)-α-d-glcp-(1→]
hex＝[galormanorglc]
其中，m＝80-230。
實施例2褐藻多糖(供試品2)
步驟一，取羊棲菜藥材(1500g)，用20倍量的水浸泡並攪拌清洗，換水三次，濾幹，加入20倍體積的水，加熱至沸騰後，提取4h，過濾，重複提取2次，合併濾液。
步驟二，取濾液，濃縮至濾液體積的1/10，得到濃縮液，在濃縮液中加入乙醇，攪拌，直至溶液中乙醇的體積分數達到80％，攪拌4h後，離心並第一次收集沉澱物，然後加水溶解，加入乙醇，至溶液中乙醇的體積分數為80％，攪拌4h後，離心並第二次收集沉澱物。
步驟三，第二次收集沉澱物加水溶解，然後加入乙醇，至溶液中乙醇的體積分數為40％，攪拌4h後，離心並第三次收集沉澱物和上清液，然後第三次收集沉澱加水溶解，加入乙醇，至溶液中的乙醇體積分數為40％，攪拌4h後，離心並第四次收集沉澱物和上清液，合併第三次和第四次上清液並濃縮至上清液總體積的1/10，得到濃縮的上清液。
步驟四，向濃縮的上清液中加入乙醇，至溶液中乙醇的體積分數為80％，攪拌4h後，離心，第五次收集沉澱物，然後加水溶解，加入乙醇，至溶液中乙醇的體積分數為80％，攪拌4h後，離心，第六次收集沉澱物，烘乾沉澱物，得到褐藻多糖60g(供試品2)。
經測定，該製得的褐藻多糖中，含有巖藻糖、甘露糖、半乳糖(1～2∶25～30∶1)為主的單糖，以及少量葡萄糖的部位。其中，葡萄糖的比例為1％。
實施例3褐藻多糖(供試品3)的製備
步驟一，取羊棲菜藥材(1500g)，用20倍量的水浸泡並攪拌清洗，換水三次，濾幹，加入20倍體積的水，加熱至沸騰後，提取4h，過濾，重複提取2次，合併濾液。
步驟二，取濾液，濃縮至濾液體積的1/10，得到濃縮液，在濃縮液中加入乙醇，攪拌，直至溶液中乙醇的體積分數達到30％，攪拌4h後，離心並第一次收集濾液和沉澱物，沉澱物然後加水溶解，加入乙醇，至溶液中乙醇的體積分數為30％，攪拌4h後，離心並第二次收集濾液及沉澱物，沉澱物然後加水溶解，加入乙醇，至溶液中的乙醇體積分數為30％，攪拌4h後，離心，第三次收集濾液和沉澱物，合併濾液。
步驟三，取步驟二的濾液濃縮至無醇，然後加入乙醇，至溶液中乙醇的體積分數為80％，攪拌4h後，離心並第四次收集沉澱物和上清液，然後第四次收集沉澱加水溶解，加入乙醇，至溶液中的乙醇體積分數為80％，攪拌4h後，離心並第五次收集沉澱物和上清液，然後第五次收集沉澱物再次加水溶解，加入乙醇，至溶液中乙醇的體積分數為80％，攪拌4h後，離心並第六次收集沉底物和上清液，合併第四次、第五次和第六次收集的上清液，濃縮至上清液總體積的1/10，得到濃縮的上清液，蒸乾，得到褐藻多糖85g(供試品3)。
經測定，該製得的褐藻多糖中，含有巖藻糖、甘露糖、半乳糖(1～2∶20～40∶1)為主的單糖，以及少量葡萄糖的部位。其中，葡萄糖的比例為2％。
實施例4褐藻多糖(供試品4和5)
步驟一，取羊棲菜藥材(1500g)，用20倍量的水浸泡並攪拌清洗，換水三次，濾幹，加入20倍體積的水，加熱至沸騰後，提取4h，過濾，重複提取2次，合併濾液。
步驟二，取濾液，濃縮至濾液體積的1/10，得到濃縮液，在濃縮液中加入乙醇，攪拌，直至溶液中乙醇的體積分數達到30％，攪拌4h後，離心並第一次收集濾液和沉澱物，沉澱物然後加水溶解，加入乙醇，至溶液中乙醇的體積分數為30％，攪拌4h後，離心並第二次收集濾液及沉澱物，沉澱物然後加水溶解，加入乙醇，至溶液中的乙醇體積分數為30％，攪拌4h後，離心，第三次收集濾液和沉澱物，合併濾液。
步驟三，取步驟二的濾液濃縮至無醇，然後加入乙醇，至溶液中乙醇的體積分數為80％，攪拌4h後，離心並第四次收集沉澱物和上清液，然後第四次收集沉澱加水溶解，加入乙醇，至溶液中的乙醇體積分數為80％，攪拌4h後，離心並第五次收集沉澱物和上清液，然後第五次收集沉澱物再次加水溶解，加入乙醇，至溶液中乙醇的體積分數為80％，攪拌4h後，離心並第六次收集沉底物和上清液，第六次沉澱物烘乾，然後用0.2mnacl水溶，經sepharcryls300凝膠柱進行分離，洗脫液為0.2mnacl，分離得到兩個流份，分別透析，濃縮至幹，得到褐藻多糖15g(供試品4)和褐藻多糖24g(供試品5)。
經測定，該製得的褐藻多糖(供試品4)中，含有巖藻糖，甘露糖，半乳糖(1～2∶25～30∶1)為主、以及少量葡萄糖的部位。
經測定，該製得的褐藻多糖(供試品5)中，含有巖藻糖，甘露糖，葡萄糖(1～2∶25～30∶1)為主、以及少量半乳糖的部位。
實施例5褐藻多糖的分子量表徵
以供試品1為例，採用凝膠色譜法，以標準多糖(葡聚糖)為對照品，通過gpc軟體計算獲得。
檢測條件：agilent1100高效液相色譜儀，配備示差檢測器，ks-802和ks-804串聯柱(shodex公司)，流動相為0.2mol/l氯化鈉溶液，柱溫40℃，流速0.8ml/min。
具體方法如下：
1mg～2mg標準多糖(葡聚糖)和褐藻多糖樣品，用流動相配成2mg/ml溶液，12,000rpm離心10min，吸取上清液轉入液相樣品瓶。將標準多糖和褐藻多糖樣品溶液依次進樣，進樣體積20μl，測定保留時間，用gpc軟體計算褐藻多糖的分子量。
測得褐藻多糖的分子量分布範圍為140kda～300kda。
實施例6褐藻多糖的糖組成和連接方式分析
以供試品1為例，取0.1mg～1mg樣品，置10ml安瓿中，加1ml2mol/ltfa溶液，封口，120℃烘箱中水解反應1.5h～2h，取出，放冷至室溫後，將水解液轉入25ml梨形燒瓶，60℃水浴減壓蒸乾，加200μl水溶解，然後加1ml0.5mol/lnabh4的dmso溶液，混勻，於40℃水浴還原反應90min。再逐滴加入100μl冰醋酸，混勻，然後加入200μl1-甲基咪唑和1ml乙酸酐，混勻，於40℃水浴乙醯化反應10min。反應結束即加入2ml蒸餾水，混勻，再加入2ml氯仿，充分混勻萃取乙醯化產物，小心吸出並棄去大部分上層水液，下層溶液加2ml水洗滌一次，吸取下層溶液，用1g無水硫酸鈉乾燥，置樣品瓶中備用。採用gc分析。
標準品不水解，其餘操作同樣品。
採用如下氣相色譜條件對糖組成進行分析：hp-5(agilent)色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm)；程序升溫條件為：起始溫度140℃，以10℃/min升溫至170℃，保持4min；再以0.5℃/min升溫至175℃；然後以10℃/min升溫至190℃；然後以0.5℃/min升溫至200℃；最後以10℃/min升溫至250℃。進樣口溫度為250℃；載氣為n2，流速為1ml/min。
經分析，所製得的褐藻多糖含有巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等四種單糖，按摩爾比巖藻糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖＝1～2∶20～30∶0.5～2∶1。並且，所製得的褐藻多糖還含有微量的木糖和鼠李糖。
實施例7褐藻多糖的糖連接方式分析
在本實施例中，對供試品1-5分別進行分析。
甲基化分析：參照文獻方法(carbohydrres.1993,245,1～10)將褐藻多糖進行甲基化，甲基化後的產物用90％甲酸解聚，2mol/ltfa全水解，nabh4還原和醋酐乙醯化製成部分甲基化的阿爾迪醇乙酸酯衍生物，然後進行gc-ms分析。
供試品1-5的糖連接方式基本相同。結合標準圖譜，確定組成褐藻多糖的單糖具有如下幾種連接方式：
甘露糖：位於糖鏈末端，或其上1,2位羥基成糖苷，3位及6位或被取代；其上1,4位羥基成糖苷，或2位，3位和6位被取代；
巖藻糖：位於糖鏈末端，或其上1,3位羥基成糖苷，4位或被取代；或其上1,4位羥基成糖苷，2，3位或被取代；
半乳糖：其上1,4位羥基成糖苷或6位被取代，或其上1,2位羥基成糖苷或4位被取代；
葡萄糖：其上1,4位羥基成糖苷或6位被取代，或其上1,2位羥基成糖苷或4位被取代。
基於上述分析，得出褐藻多糖的結構式：
r2＝[→4)-α-d-glcp-(1→or→4)-α-d-glcp-(1→]
hex＝[galormanorglc]
其中，m＝80-230。
實施例8褐藻多糖對app/ps1雙轉基因小鼠空間記憶障礙的影響
本實施例中，使用的褐藻多糖為實施例1中製備供試品1。
app/ps1雙轉基因小鼠單只單籠飼養致20周齡時，各組小鼠以10ml/kg體重的藥液容積按應給予藥液經口灌胃(i.g)給藥，每天1次，連續60天。野生對照及模型組給予等體積溶媒，給藥組分別給予200mg/kg(低劑量)和300mg/kg(高劑量)供試品1，陽性藥組給予1.6mg/kg鹽酸多奈哌齊，每組10隻。隨後進行morris水迷宮訓練，連續5天。每次均為口服給藥1h後訓練。
訓練方式：先將小鼠放在位於第iv象限的平臺上使其熟悉30秒(sec)。然後再將小鼠於第iv象限面朝壁投入水中，使其尋找平臺，遊泳時間為60sec。若在60sec內找不到平臺，則將小鼠放到平臺上，停留10sec。休息2min後，再次將小鼠放入第i象限遊泳以尋找平臺，其餘過程同上。依次再將小鼠分別投入ii、iii象限。每日按上述方法進行訓練，連續4天。
第5天進行撤臺實驗。將位於第iv象限的平臺撤除。給藥後1h將小鼠從水池的任意一點貼壁放入水中，遊泳尋找平臺1min。morris水迷宮統計軟體將記錄每隻小鼠穿越平臺的次數，分別在4個象限的活動時間和路程，以及在平臺中心區域及外圍區域的活動時間及路程等，並進行統計處理。
表1第5天撤臺後供試品1對小鼠在站臺周圍範圍i的活動路程和時間的影響
*p<0.05，**p<0.01與模型組相比
表2第5天撤臺後供試品1對小鼠第一次穿越平臺時間和平臺穿越次數的影響
*p<0.05，**p<0.01與模型組相比
在撤臺試驗中，模型組動物在站臺(平臺所在區域)周圍範圍i的活動路程和時間明顯短於陰性對照組的小鼠，第一次穿越平臺的時間和平臺的穿越次數也明顯少於陰性對照組的小鼠(p值均小於0.01)，說明app/ps1雙轉基因小鼠飼養至8個月時，其空間記憶能力明顯降低。
多奈哌齊連續口服給藥2個月，明顯延長了小鼠在站臺周圍範圍i的活動路程和時間，明顯縮短了小鼠第一次穿越平臺的時間，增加了穿越平臺的次數，說明多奈哌齊連續口服給藥2個月明顯改善了app/ps1雙轉基因小鼠的空間記憶障礙。300mg/kg和200mg/kg的供試品1均明顯延長了動物在站臺周圍範圍i的活動路程和時間，明顯縮短了小鼠第一次穿越平臺的時間，增加了穿越平臺的次數，說明供試品1在200mg/kg劑量下連續口服給藥2個月就可明顯改善app/ps1雙轉基因小鼠的空間記憶障礙。
實施例9供試品1對乙醇誘導的小鼠記憶再現障礙影響
乙醇為中樞抑制劑，可抑制大腦皮層的神經功能活動，抑制動物的條件反射過程，使腦內蛋白質和rna合成受阻，膽鹼能和多巴胺等系統發生改變。在重測前給予，可明顯幹擾記憶的再現。乙醇價廉易得，在適宜的濃度下，結果穩定，易於重複，對中樞和一般運動功能無明顯影響。有改善學習記憶的藥物可減少乙醇所致記憶再現障礙小鼠24h後由明室到暗室的潛伏期及錯誤次數。
雄性icr小鼠(上海西普爾-畢凱實驗動物有限公司，動物合格證號：scxk(滬)2008-0016)，經口灌胃(i.g.)給藥，其中空白對照組和模型組均給予等體積0.5％羧甲基纖維素鈉(cmc-na)，給藥組分別給予150mg/kg供試品1，陽性藥組給予1.6mg/kg鹽酸多奈哌齊，每組10隻，1次/天，10ml/kg體重，連續給藥3周。末次給藥後1h，以避暗法訓練一次。將小鼠放入避暗箱內，背朝洞口放入明室，同時啟動視屏分析裝置，動物穿過洞口進入暗室受到電擊，計時自動停止。取出小鼠，視屏分析將記錄每鼠從放入明室至進入暗室遇到電擊所需的時間，此即潛伏期。24h後進行測試，測試前30min經口灌胃給予45％的乙醇溶液(0.1ml/10g)，空白對照組給予等體積生理鹽水。視屏分析系統將攝製並自動記錄動物所有相關數據，實驗結果參見表3。
表3供試品1對乙醇所致小鼠記憶再現障礙的影響
註：「*」表示p<0.05，「**」表示p<0.01，均為與模型組相比。
由表3可見，記憶再現障礙模型組在記憶受損後動物由明室進入暗室的潛伏期明顯縮短，其受電擊的動物數和5min內出現的錯誤總次數也顯著多於陰性對照組(p<0.01/0.05)，顯示了記憶再現障礙。
多奈哌齊延長了小鼠由明室進入暗室的潛伏期(p<0.01)，受電擊的動物數和5分鐘內錯誤次數也顯著少於模型組(p<0.01)，顯示了改善記憶障礙的作用。供試品1明顯延長了小鼠由明室進入暗室的潛伏期(p<0.05)，並顯著降低了受電擊的動物數和5min內出現的錯誤總次數(p<0.01/0.05)，顯示出良好的改善記憶再現障礙的作用。
實施例10供試品2對乙醇誘導的小鼠記憶再現障礙影響
乙醇為中樞抑制劑，可抑制大腦皮層的神經功能活動，抑制動物的條件反射過程，使腦內蛋白質和rna合成受阻，膽鹼能和多巴胺等系統發生改變。在重測前給予，可明顯幹擾記憶的再現。乙醇價廉易得，在適宜的濃度下，結果穩定，易於重複，對中樞和一般運動功能無明顯影響。有改善學習記憶的藥物可減少乙醇所致記憶再現障礙小鼠24h後由明室到暗室的潛伏期及錯誤次數。
雄性icr小鼠(上海西普爾-畢凱實驗動物有限公司，動物合格證號：scxk(滬)2008-0016)，經口灌胃(i.g.)給藥，其中空白對照組和模型組均給予等體積0.5％羧甲基纖維素鈉(cmc-na)，給藥組給予250mg/kg供試品3，陽性藥組給予1.6mg/kg鹽酸多奈哌齊，每組10隻，1次/天，10ml/kg體重，連續給藥3周。末次給藥後1h，以避暗法訓練一次。將小鼠放入避暗箱內，背朝洞口放入明室，同時啟動視屏分析裝置，動物穿過洞口進入暗室受到電擊，計時自動停止。取出小鼠，視屏分析將記錄每鼠從放入明室至進入暗室遇到電擊所需的時間，此即潛伏期。24h後進行測試，測試前30min經口灌胃給予45％的乙醇溶液(0.1ml/10g)，空白對照組給予等體積生理鹽水。視屏分析系統將攝製並自動記錄動物所有相關數據，實驗結果參見表4。
表4供試品2對乙醇所致小鼠記憶再現障礙的影響
註：「*」表示p<0.05，「**」表示p<0.01，均為與模型組相比。
由表4可見，記憶再現障礙模型組在記憶受損後動物由明室進入暗室的潛伏期明顯縮短，其受電擊的動物數和5min內出現的錯誤總次數也顯著多於陰性對照組(p<0.01)，顯示了記憶再現障礙。
多奈哌齊延長了小鼠由明室進入暗室的潛伏期(p<0.01)，受電擊的動物數也顯著少於模型組(p<0.05)，顯示了改善記憶障礙的作用。供試品2明顯延長了小鼠由明室進入暗室的潛伏期(p<0.05)，並顯著降低了受電擊的動物數和5min內出現的錯誤總次數(p<0.01/0.05)，顯示出良好的改善記憶再現障礙的作用。
實施例11供試品3對東莨菪鹼誘導的小鼠記憶獲得障礙影響
東莨菪鹼為m膽鹼受體阻斷劑，從而引發受試動物膽鹼能神經受損型的記憶障礙。有改善學習記憶的藥物可減少東莨菪鹼造成記憶獲得障礙小鼠24h後受電擊的動物數，降低3min內的錯誤次數，以及縮短第一次跳下平臺的潛伏期。訓練前數小時至幾分鐘內給藥可觀察對學習成績和記憶獲得的影響。
雄性icr小鼠(上海西普爾-畢凱實驗動物有限公司，動物合格證號：scxk(滬)2008-0016)，經口灌胃(i.g.)給藥，其中空白對照組和模型組均給予等體積0.5％羧甲基纖維素鈉(cmc-na)，給藥組分別給予150mg/kg供試品3，陽性藥組給予1.6mg/kg鹽酸多奈哌齊，每組10隻，1次/天，10ml/kg體重，連續給藥3周。末次給藥後1h，以避暗法訓練一次。將小鼠放入避暗箱內，背朝洞口放入明室，同時啟動視屏分析裝置，動物穿過洞口進入暗室受到電擊，計時自動停止。取出小鼠，視屏分析將記錄每鼠從放入明室至進入暗室遇到電擊所需的時間，此即潛伏期。24h後進行測試，測試前30min經口灌胃給予45％的乙醇溶液(0.1ml/10g)，空白對照組給予等體積生理鹽水。視屏分析系統將攝製並自動記錄動物所有相關數據，實驗結果參見表5。
表5供試品3對東莨菪鹼誘導的小鼠記憶獲得障礙的影響
註：「*」表示p<0.05，「**」表示p<0.01，均為與模型組相比。
由表5可見，模型組記憶受損24小時後第一次跳下平臺的潛伏期明顯縮短，受電擊的動物總數和5min內動物的錯誤總次數均比陰性對照組明顯增多(p<0.01/0.05)，顯示了記憶障礙。
多奈哌齊明顯延長了小鼠第一次跳下平臺的潛伏期，並減少了受電擊的動物總數和5min內的錯誤總次數，與模型組相比，p值小於0.01/0.05，顯示了促進記憶障礙的改善。供試品3明顯延長了小鼠第一次跳下平臺的潛伏期，並顯著減少了5min內的錯誤總次數，與模型組相比，p值小於0.05，提示供試品3具有記憶獲得障礙改善作用。
實施例12供試品4和供試品5對乙醇誘導的小鼠記憶再現障礙影響
乙醇為中樞抑制劑，可抑制大腦皮層的神經功能活動，抑制動物的條件反射過程，使腦內蛋白質和rna合成受阻，膽鹼能和多巴胺等系統發生改變。在重測前給予，可明顯幹擾記憶的再現。乙醇價廉易得，在適宜的濃度下，結果穩定，易於重複，對中樞和一般運動功能無明顯影響。有改善學習記憶的藥物可減少乙醇所致記憶再現障礙小鼠24h後由明室到暗室的潛伏期及錯誤次數。
雄性icr小鼠(上海西普爾-畢凱實驗動物有限公司，動物合格證號：scxk(滬)2008-0016)，經口灌胃(i.g.)給藥，其中空白對照組和模型組均給予等體積0.5％羧甲基纖維素鈉(cmc-na)，給藥組分別給予150mg/kg及300mg/kg供試品4，或300mg/kg供試品5，陽性藥組給予1.6mg/kg鹽酸多奈哌齊，每組10隻，1次/天，10ml/kg體重，連續給藥3周。末次給藥後1h，以避暗法訓練一次。將小鼠放入避暗箱內，背朝洞口放入明室，同時啟動視屏分析裝置，動物穿過洞口進入暗室受到電擊，計時自動停止。取出小鼠，視屏分析將記錄每鼠從放入明室至進入暗室遇到電擊所需的時間，此即潛伏期。24h後進行測試，測試前30min經口灌胃給予45％的乙醇溶液(0.1ml/10g)，空白對照組給予等體積生理鹽水。視屏分析系統將攝製並自動記錄動物所有相關數據，實驗結果參見表6。
表6供試品4和供試品5對乙醇所致小鼠記憶再現障礙的影響
註：「*」表示p<0.05，「**」表示p<0.01，均為與模型組相比。
由表6可見，記憶再現障礙模型組在記憶受損後動物由明室進入暗室的潛伏期明顯縮短，其受電擊的動物數和5min內出現的錯誤總次數也顯著多於陰性對照組(p<0.01/0.05)，顯示了記憶再現障礙。
多奈哌齊延長了小鼠由明室進入暗室的潛伏期(p<0.01)，受電擊的動物數和5分鐘內錯誤次數也顯著少於模型組(p<0.05)，顯示了改善記憶障礙的作用。供試品4明顯延長了小鼠由明室進入暗室的潛伏期(p<0.05)，並顯著降低了受電擊的動物數和5min內出現的錯誤總次數(p<0.01/0.05)，顯示出良好的改善記憶再現障礙的作用。供試品5明顯延長了小鼠由明室進入暗室的潛伏期(p<0.05)，並顯著降低了受電擊的動物數和5min內出現的錯誤總次數(p<0.05)，顯示出良好的改善記憶再現障礙的作用。
上述試驗結果表明，本發明新穎的褐藻多糖可顯著顯著改善哺乳動物空間記憶能力並可用於預防和/或治療神經退行性疾病。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。