一株具有延緩後酸化作用保加利亞乳桿菌菌株及其應用的製作方法

2023-09-10 13:15:15 2

專利名稱：一株具有延緩後酸化作用保加利亞乳桿菌菌株及其應用的製作方法
一株具有延緩後酸化作用保加利亞乳桿菌菌株及其應用
技術領域：
本發明涉及一株利用硫酸新黴素誘變、篩選得到的具有延緩後酸化作用的保加利亞乳桿菌菌株，以及該菌株的篩選方法及其在發酵工業中的應用，屬於生物發酵技術領域。
背景技術：
乳酸菌在發酵乳糖過程中能產生多種代謝產物，這些乳酸菌及其生產的代謝產物不僅具有平衡腸道菌群、降低膽固醇、抗腫瘤、免疫以及延緩衰老等生理功能，還賦予產品良好的口感和風味。我國使用的酸奶發酵劑主要有嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌。一般認為，保加利亞乳桿菌在低PH環境下能繼續發酵乳糖，是引起酸奶後酸化現象的主要菌株。目前，控制酸奶後酸化的方法主要有:調整酸奶發酵劑保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的比例；在發酵乳中添加nisin等細菌素控制保加利亞乳桿菌的生長和代謝能力；改變細胞膜的通透性，抑制保加利亞乳桿菌的代謝等。其中，降低保加利亞乳桿菌的生長和能量代謝是控制後酸化現象的有效方法。H+-ATPase酶是控制乳酸菌能量代謝的一個關鍵酶。H+-ATPase位於乳酸菌細胞膜上，既能催化ATP的合成與水解也能調節跨膜的質子梯度，其活性隨pH的降低而增強，其數量也隨著pH值的下降而增多。當外界環境中pH降低時，H+-ATPase能通過水解ATP釋放出自由能，推動細胞內的質子泵出胞外，形成膜PH梯度差，從而使細胞內pH維持在中性附近，使細胞內酶的活力不受影響。很多乳酸菌含有H+-ATPase,如短乳桿菌、乳酸乳球菌、乳酸鏈球菌和嗜熱鏈球菌等。 硫酸新黴素(neomycin)是一種能抑制細菌生長的抗生素,利用硫酸新黴素能篩選出具有低H+-ATPase活力的菌株。其原理在於硫酸新黴素進入細胞是一個耗能的過程，需要H+-ATPase的協助，因此只有低H+-ATPase活力的菌株才能在含有硫酸新黴素的篩選培養基上生長。目前，已有一些關於利用硫酸新黴素篩選具有低H+-ATPase活力菌株的報導，包括乳酸乳球菌、瑞士乳桿菌、酒類酒球菌等，這些誘變菌株對低PH環境敏感，具有改變的細胞膜通透性以及降低生長和能量代謝能力。本發明針對「酸奶後酸化」這一乳品加工業的關鍵技術問題，以從我國青海的傳統發酵乳製品中分離篩選出來的德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06為出發菌株，利用硫酸新黴素誘變、篩選出一株具有弱H+-ATPase活性的菌株，並進一步研究了其在脫脂乳培養基中的產酸能力，可從根本上解決產品後酸化問題。

發明內容為了解決保加利亞乳桿菌在酸奶儲存期間引起的後酸化現象，本發明使用硫酸新黴素誘變、篩選出一株H+-ATPase缺陷型保加利亞乳桿菌，該菌株在脫脂乳培養基中具有弱的產酸能力，作為弱後酸化酸奶發酵劑使用。本發明所述的具有弱H+-ATPase活性的保加利亞乳桿菌菌株是利用硫酸新黴素誘變德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06 (L.delbrueckii subsp.bulgaricus ND06)後篩選獲得的，其中原始的德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06 (Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ND06)該菌株已於2013年I月15日保存在北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號為CGMCCN0.7133，篩選獲得的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種的分類命名為 Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ND06-2,德氏乳桿菌保加利亞亞種 NDO6-2 (Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ND06-2)已於 2Ol3 年 I 月15日保存於北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號為CGMCCN0.7134。本發明還涉及所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株在製備發酵乳、發酵食品中的應用，所述菌株在42°C培養72h後，發酵乳pH值從6.44降至4，發酵乳PH值的下降幅度明顯低於出發菌株pH值的下降幅度，具有弱後酸化作用。所述菌株在42°C發酵後，在室溫25°C儲藏21d期間，pH值的變化範圍在4.57 4.07的範圍內。所述菌株在42 °C發酵後，在室溫儲藏21d期間，pH值下降了 0.5pH單位。本發明還涉及所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株菌作為酸奶發酵劑的用途。另一方面，本發明還涉及包含權利要求2所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株菌的發酵乳、發酵食品，所述發酵食品可以是酸奶。本發明提供了一種控制酸奶後酸化的方法，該方法是利用硫酸新黴素誘變出具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種。本發明通過改變野生菌株的H+-ATPase活性來改變菌種生理特性，降低菌株的生長、代謝和產酸能力，同時避免了基因工程改良菌種帶來的外緣DNA問題，具有一定的安全性，能緩解酸奶的後酸化現象，提高產品的穩定性。根據本發明的實施方案，利用硫酸新黴素誘變具有弱H+-ATPase活性的保加利亞乳桿菌的方法是向MRS培養基中添加硫酸新黴素，硫酸新黴素在MRS培養基中的添加濃度為50-500 μ g/mL。硫酸新黴素的濃度對於控制酸奶後酸化起著非常重要作用，當MRS培養基中硫酸新黴素的濃度過低時，對控制平板上的耐硫酸新黴素菌落的數量不明顯，當硫酸新黴素濃度過高時，會抑制耐硫酸新黴素菌落的生長。利用硫酸新黴素篩選出的具有弱H+-ATPas e活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06-2，其在MRS培養基中培養18h後，H+-ATPase活性為0.44 μ mol/mg.min，和出發菌株相比H+-ATPase活力降低了 44%，具有弱的H+-ATPase活性。利用硫酸新黴素篩選出的具有弱H+-ATPas e活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06-2作為發酵劑使用時，421:培養0、4、8、12、16、20、24、36、48和72h後，發酵乳的pH值高於出發菌株ND06發酵乳的pH值。利用硫酸新黴素篩選出的具有弱H+-ATPas e活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06-2作為發酵劑使用時，42°C培養0、4、8、12、16、20、24、36、48和72h後，發酵乳的乳酸、乳糖和和半乳糖的代謝能力均低於出發菌株ND06。利用硫酸新黴素篩選出的具有弱H+-ATPase活性的保加利亞乳桿菌作為發酵劑使用時，42°C發酵後，在室溫(25°C)儲藏期間，發酵乳的pH值高於出發菌株ND06發酵乳的pH值。利用硫酸新黴 素篩選出的具有弱H+-ATPase活性的保加利亞乳桿菌作為發酵劑使用時，42°C發酵後，在室溫(25°C)儲藏期間，發酵乳的乳酸含量明顯低於出發菌株發酵乳的乳酸含量。一種具有弱H+-ATPase活力的德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06-2的製備方法:①菌種活化將_70°C保存的ND06菌株接種於脫脂乳培養基中，37°C培養24h後，在MRS培養基中傳代2 3次。②硫酸新黴素溶液的配製硫酸新黴素溶液配製濃度為0.1 g/mL,經0.22 μ m膜過濾滅菌後，_20°C儲存。③硫酸新黴素誘變將活化後的ND06菌株接種於MRS培養基中，37°C培養8h，使用PBS緩衝液(pH7.2)稀釋後，取100 μ L塗布於含有硫酸新黴素的MRS平板上，其中，硫酸新黴素的濃度為50、100、150、200、250、300、350、400、450 和 500 μ g/mL。37°C培養 72h 後，選取菌落數在 30 300之間的平板，挑選單個菌落接種於MRS液體培養基，繼續培養24h，檢測OD66tl和pH值，挑選OD660〈l和pH > 4.8的菌株。④硫酸新黴素誘變菌株的純化將挑選出的誘變菌株接種於MRS液體培養基中，37°C培養24h，適當稀釋後，塗布於MRS平板上，繼續培養48h，挑選單個菌落，-80°C保存。⑤ND06-2菌株的低溫冷凍真空保存

將步驟④篩選出的具有弱H+-ATPase活性的ND06-2菌株接種到MRS培養基中培養18h後，離心收集菌體，用PBS緩衝液洗2遍後，加入凍幹保護劑低溫凍幹保存。另一方面，本發明提供了一種酸奶的製備方法，該方法的具體操作步驟如下:①均質:以牛奶為主要原料，將牛奶升溫至60°C，20MPa條件下均質；②殺菌:95°C條件下滅菌IOmin;③接種，發酵:殺菌後的原料降溫至42°C，發酵劑的接種量為1.0X107cfU/mL，發酵時間為4 5h，待發酵乳的pH值降至4.5時，終止發酵，將發酵乳降溫灌裝，然後在常溫儲藏。綜上所述，本發明利用含有硫酸新黴素的MRS培養基篩選得到的可以作為弱後酸化發酵劑使用的德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06-2,分類命名為Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricusND06-2,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心保藏登記號為CGMCCN0.7134。該菌株的H+-ATPase活力只有出發菌株的44%，在脫脂乳培養基中乳酸、乳糖和半乳糖的代謝能力明顯低於出發菌株，可以作為弱後酸化的酸奶發酵劑使用。在我國的許多地區，酸奶在運輸、存儲和銷售過程中的冷鏈系統並不完備，因此在市場終端常出現後酸化等質量問題。使用具有弱tf-ATPase活性的保加利亞乳桿菌作為酸奶發酵劑，可以使酸奶的後酸化程度弱化，延長產品的貨架期。


圖1磷標準曲線。參考實施例2圖2蛋白標準曲線。參考實施例2圖3ND06及其誘變菌株ND06-2的H+-ATPase活性。參考實施例2
圖4ND06及其誘變菌株ND06-2在42 °C條件下發酵乳中半乳糖含量的變化。參考實施例5圖5ND06及其誘變菌株ND06-2在42°C條件下發酵乳中乳酸含量變化。參考實施例5圖6ND06及其誘變菌株ND06-2在42°C條件下發酵乳中乳糖含量變化。參考實施例5圖7ND06及其誘變菌株ND06-2在室溫(25°C )儲藏期間乳酸含量的變化。參考實施例具體實施方式
:下面結合附圖和實施例對 本發明作進一步描述。實施例1:一種具有弱H+-ATPase活力的德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06-2的篩選方法所述具有弱H+-ATPase活力的德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06-2菌株是利用硫酸新黴素誘變保加利亞乳桿菌ND06 (L.delbrueckiisubsp.bulgaricusND06)後篩選獲得的，該菌株已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCN0.7134，篩選獲得該菌株的方法如下:1.菌種活化將_70°C保存的保加利亞ND06菌株接種於脫脂乳培養基中，37°C培養24h後，在MRS培養基中傳代2 3次。2.硫酸新黴素溶液的配製硫酸新黴素溶液配製濃度為0.1 g/mL,經0.22 μ m膜過濾滅菌後，_20°C儲存。3.硫酸新黴素誘變將活化後的ND06菌株接種於MRS培養基中，37°C培養8h，使用PBS緩衝液(pH7.2)稀釋後，取100 μ L塗布於含有硫酸新黴素的MRS平板上，其中，硫酸新黴素的濃度為50、100、150、200、250、300、350、400、450 和 500 μ g/mL。37°C培養 72h 後，選取菌落數在 30 300之間的平板，挑選單個菌落接種於MRS液體培養基，繼續培養24h，檢測OD66tl和pH值，挑選OD660〈l和pH > 4.8的菌株。4.硫酸新黴素誘變菌株的純化將挑選出的誘變菌株接種於MRS液體培養基中，37°C培養24h，適當稀釋後，塗布於MRS平板上，繼續培養48h，挑選單個菌落，-80°C保存。5.ND06-2菌株的低溫冷凍真空保存將步驟4篩選出的具有弱H+-ATPase活性的ND06-2菌株接種到MRS培養基中培養18h後，離心收集菌體，用PBS緩衝液洗2遍後，加入凍幹保護劑在低溫凍幹保存，所述的凍幹保護劑的配方為:脫脂乳10%，穀氨酸鈉0.1%，無菌水90%。實施例2:具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06-2的H+-ATPase活性檢測測定本申請說明書實施例1所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06-2的H+-ATPase活性，具體檢測方法及檢測結果如下:
1.建立磷含量標準曲線參考Ongol等報導的方法建立了磷含量標準曲線。使用KH2PO4分別配製成PO43-濃度為 0mol/mL、0.2mol/mL、0.4mol/mL、0.6mol/mL、0.8mol/mL、L Omol/mL、L 2 μ mol/mL 的標準溶液系列。從上述標準溶液中分別量取350 μ L溶液，加入815 μ L染料，混合後在18°C培養15min，測定OD66tl值，建立磷含量標準曲線(圖1)。其中，染料由5N硫酸、25g/L鑰酸銨、10g/L甲氨基苯酚硫酸鹽、30g/L亞硫酸鈉以及蒸餾水(I:1:1:1:4)混合而成。2.H+-ATPase 酶粗提將出發菌株ND06及其誘變菌株接種於MRS液體培養基中，37°C培養18h，離心收集菌體(3500 X g, IOmin, 4°C )，加入 250 μ L 濃度為 75mMTris_HCl 緩衝液(IOmMMgSO4, pH7.0),混勻後加入25 μ L甲苯，37°C水浴5min。細胞的凍融是在_80°C的乙醇和37°C水浴鍋中進行的，凍融循環反覆進行2次後，12，000 Xg離心lOmin，棄去上清液，加入上述含有MgSOJATris-HCl緩衝液200 μ L後，震蕩混勻，用液氮迅速凍結，_80°C保存。3.H+-ATPase 活性測定從上述細胞粗提取物中取出25 μ L，添加到ImL濃度為50mMTris-maleate緩衝液(IOmMMgSO4, pH6.0)中。該混合液在37°C水浴鍋中水浴5min後，添加50 μ LATP (TaKaRa,
0.1Μ)，在水浴鍋中繼續反應15min，然後加入600 μ L的0.1NHCl終止反應，反應物置冰上迅速冷卻後，離心(5000 X g，IOmin, 4°C )，收集上清液。吸取350 μ L上清液中加入815 μ L染料中，18°C反應15min後,測定反應物的OD66c!值,根據磷含量標準曲線計算反應物中無機磷酸鹽的含量。採用Bradford方法測定蛋白質的含量。吸取270 μ LTris-maleate緩衝液與酶粗提物的混合液，加入15 μ L10%SDS和15 μ LlONNaOH,煮沸lOmin，在冰上迅速冷卻後，測定反應溶液中蛋白質的含 量。H+-ATPase的活性用μ mol/mg.η η來表示,其中每個活力單位定義為ImgH+-ATPase的粗提取物在Imin內分解ATP形成I μ mo I的無機磷酸鹽。4.H+-ATPase活性的測定結果在pH6的條件下測定的ND06及其誘變菌株ND06-2的H+-ATPase酶活，結果如圖3(ρ〈0.05)所示。ND06及其誘變菌株ND06-2的H+-ATPase活力分別為0.99和0.44 μ mol/mg.π η，誘變菌株ND06-2的H+-ATPase活力和出發菌株相比降低了 44%，和出發菌株相比，誘變菌株ND06-2具有明顯較弱的H+-ATPase活性。實施例3-6說明實施例1所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06-2菌株在乳品加工業中的應用，尤其是其在脫脂乳培養基中的弱後酸化作用。實施例3:ND06及其誘變菌株ND06-2在42°C培養時發酵乳pH值的變化將ND06 及其誘變菌株 ND06-2 在 42°C培養 0、4、8、12、16、20、24、36、48 和 72h 後，對比發酵乳PH值的變化。具體步驟如下:1.主要操作步驟:將ND06和誘變菌株ND06-2以1.0 X 107cfu/mL分別接種於12%的脫脂乳培養基中，42°C培養0、4、8、12、16、20、24、36、48和72h後發酵後，檢測發酵乳pH值的變化。2.發酵乳pH值的測定ND06及其誘變菌株ND06-2在42°C培養0_72h時發酵乳pH值的變化如表I所示。ND06-2及其出發菌株ND06在42°C發酵16h時，pH值均降到4.5左右，在發酵20、24、36、48和72h時，ND06-2發酵乳的pH值分別為4.4、4.13、4.1、4.08和4，和出發菌株ND06發酵乳的PH值相比，分別高出0.1,0.12,0.3,0.43和0.49，誘變菌株發酵乳pH值的下降幅度明顯低於出發菌株發酵乳PH值的下降幅度，可見誘變菌株ND06-2在發酵乳中的產酸能力要低於出發菌株。表1ND06及其誘變菌株ND06-2在42 V培養0_72h時發酵乳的pH值
權利要求
1.一種具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種，其特徵在於所述具有弱H+-ATPase活性的保加利亞乳桿菌菌株是利用硫酸新黴素誘變德氏乳桿菌保加利亞亞種 ND06 (LactobaciIlusdelbrueckiisubsp.bulgaricusND06)後篩選獲得的，德氏乳桿菌保加利亞亞種ND06，於2013年01月15日保藏在北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCN0.7133。
2.一種具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株，其特徵在於所述具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株的分類命名為(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricusND06_2),該菌株已於 2013 年 01 月 15 日保存於北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCN0.7134。
3.權利要求2所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株在製備發酵乳、發酵食品中的應用。
4.權利要求3所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株在製備發酵乳、發酵食品中的應用，其特徵在於:所述菌株在42 V培養72h後，發酵乳pH值從6.44降至4，發酵乳pH值的下降幅度明顯低於出發菌株pH值的下降幅度，具有弱後酸化作用。
5.權利要求3所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株在製備發酵乳、發酵食品中的應用，其特徵在於:所述菌株在42°C發酵後，在室溫25°C儲藏21d期間，pH值的變化範圍在4.57 4.07的範圍內。
6.權利要求3所述的具有弱H +-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株在製備發酵乳、發酵食品中的應用，其特徵在於:所述菌株在42 °C發酵後，在室溫儲藏21d期間，pH值下降了 0.5pH單位。
7.權利要求2所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株菌作為酸奶發酵劑的用途。
8.包含權利要求2所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株菌的發酵乳、發酵食品。
9.權利要求6所述的包含權利要求1所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株菌的發酵乳、發酵食品，其特徵在於所述發酵食品是酸奶。
10.利用權利要求2所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株ND006-2製備酸奶的方法，該方法的具體操作步驟如下: ①均質:以牛奶為主要原料,將牛奶升溫至60°C，20MPa條件下均質； ②殺菌:95°C條件下滅菌IOmin; ③接種，發酵:殺菌後的原料降溫至42°C，發酵劑的接種量為1.0X107cfU/mL，發酵時間為4 5h，待發酵乳的pH值降至4.5時，終止發酵。
全文摘要
本發明涉及一株具有弱H+-ATPase活性的保加利亞乳桿菌及其篩選方法和應用，所述的保加利亞乳桿菌分類命名為Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ND06-2，保藏登記號為CGMCC No.7134，可以作為弱後酸化發酵劑使用。本發明利用含有硫酸新黴的MRS平板篩選，得到一株具有弱H+-ATPase活性的菌株，該菌株在脫脂乳中乳酸、乳糖和半乳糖的代謝能力明顯低於出發菌株，可以作為弱後酸化的酸奶發酵劑在工業生產中使用。
文檔編號C12N1/20GK103215199SQ20131007932
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月13日 優先權日2013年3月13日
發明者張和平, 丹彤 申請人:內蒙古農業大學