脂質體的製作方法

2023-09-10 21:43:45

專利名稱：脂質體的製作方法
技術領域：
本發明涉及在血液中具有優良滯留性的脂質體。
背景技術：
脂質體是一種包含脂質雙層膜的脂質囊泡並且主要作為各種注射藥物的載體進行了研究。近來，也積極研究了其在基因治療中作為基因載體的應用。作為抗真菌藥物的兩性黴素B、作為抗癌劑的阿黴素和道諾紅菌素以及作為造影劑的銦已經作為脂質體製劑投放市場(TroyO.Harasym，Marcel B.Bally，Paul Tardi，″參與結合蛋白靶向的脂質體的清除性能″，Advanced Drug Delivery Reviews，1998，vol.32，p.99-118)。
儘管脂質體由生物相容性脂質組成，但是已知它從血液中迅速消失，因為在它靜脈內給藥後被免疫系統識別為異物。因此，給藥後該藥物不能長效作用是它的最大缺點。為了解決這種缺點，已經報導了在脂質體的表面化學修飾糖蛋白或糖脂的方法，將葡萄糖醛酸衍生物與其結合的方法等，但是其中均未實際用於藥物製劑。
同時，自從1990年，已經普遍公知的技術方法是通過用親水聚乙二醇化學修飾脂質體表面來避免免疫系統的識別並且通過提高脂質體在血液中的滯留性維持藥物的作用。這種技術方法也應用於上述市售的脂質體製劑中。此外，也廣泛研究了這種方法應用於抗癌藥物，諸如順氯氨鉑、長春花新鹼和喜樹鹼(Naoto Oku，Yoshihiro Tokudome，Tomohiro Asai and Hideo Tsukada，「參與結合蛋白靶向的脂質體的清除性能」，Current PharmaceuticalDesign，2000，vol.6，p.1669-1691)。
此外，脂質體表面修飾已經被積極用於癌細胞或肝細胞的藥物靶向研究中，並且已經報導了通過結合抗體(Troy O.Harasym，MarcelB.Bally，Paul Tardi，「參與結合蛋白靶向的脂質體的清除性能」，Advanced Drug Delivery Reviews，1998，vol.32，p.99-118)或轉鐵蛋白而識別癌細胞的方法，通過結合各種糖鏈而摻入肝細胞的方法，等。在這樣的化學修飾中，已經報導了利用白蛋白作為間隔物(Shuji Kojima，Yusuke Sogawa，Yoshika Tajiri和Noboru Yamaki，「用唾液酸修飾的結合糖蛋白的脂質體摻入網狀內皮系統的抑制和促進研究」，DrugDelivery System，2002，vol.17-1，p.63-68)。

發明內容
本發明的目的是提供在血液中滯留性顯著提高的脂質體。
為了達到上述目的，本發明人進行了深入研究並發現，當聚乙二醇(以下可以縮寫為PEG)和白蛋白同時與脂質體結合時，脂質體在血液中的滯留性協同提高。還發現，甚至PEG以修飾量與白蛋白一起進行修飾時觀察到明顯的效果，只以所述修飾量的PEG進行修飾時對於在血液中的滯留性幾乎沒有影響。順便提及，尚未有PEG和白蛋白與脂質體表面結合的報導。
因此，本發明涉及以下條款。
(1)結合聚亞烷基二醇和白蛋白的脂質體。
(2)根據上述(1)的脂質體，其中進一步含有生理活性成分。
(3)根據上述(2)的脂質體，其中生理活性成分是藥物活性成分。
(4)根據上述(3)的脂質體，其中藥物活性成分是抗腫瘤劑。
(5)含有上述(2)至(4)任一項提及的脂質體的藥物組合物。
(6)根據上述(5)的藥物組合物，其是注射劑。
(7)治療癌症的方法，包括施用包含結合了聚亞烷基二醇和白蛋白並且其中含有抗腫瘤劑的脂質體的藥物組合物。
(8)結合了聚亞烷基二醇和白蛋白並且其中含有生理活性成分的脂質體在延長該生理活性成分體內滯留時間中的應用。
(9)上述(1)中所述的脂質體的製備方法，其特徵在於，具有下式(1)代表的化合物作為脂質成分的脂質體與白蛋白結合 (其中R是來自具有2至35個碳原子的脂肪酸的醯基)；具有下式(2)代表的化合物作為脂質成分的脂質體與下式(3)代表的化合物結合 (其中R與上面定義的相同)(Alb-NH)-CO-CH2-CH2-SH(3)(其中Alb-NH是從Alb-NH2代表的白蛋白分子除去氨基的一個氫原子形成的基團)；
具有下式(4)代表的化合物作為脂質成分的脂質體與下式(5)代表的化合物結合 (其中n是5至100,000的整數，R與上面定義的相同)(Alb-NH)-CO-CH2-SH(5)(其中Alb-NH與上面定義的意思相同)；由下式(6)代表的化合物插入脂質體 (其中n、R和Alb-NH每個與上面定義的相同)；具有上式(1)代表的化合物作為脂質成分的脂質體與下式(7)代表的化合物結合
(其中-NH-Alb-NH2是從H2N-Alb-NH2代表的白蛋白分子的一個氨基除去一個氫原子形成的基團，並且n與上面定義的相同)；或具有上式(2)代表的化合物作為脂質成分的脂質體與下式(8)代表的化合物結合 (其中-NH-Alb-NH是從式H2N-Alb-NH2代表的白蛋白分子的兩個氨基各除去一個氫原子形成的基團，並且n與上面定義的相同)。
上述化合物(1)、(2)、(4)和(6)中的R是來自具有2至35個碳原子的飽和或不飽和脂肪酸的醯基。上述脂肪酸更優選具有6至18個碳原子，並且最優選具有8至16個碳原子。這種脂肪酸的具體實例是八烷酸(優選辛酸)、十烷酸(優選癸酸)、十二烷酸(優選月桂酸)、十六烷酸(優選棕櫚酸)、十八烷酸(優選硬脂酸)和單烯酸或其多烯脂肪酸(優選油酸)。這種來自脂肪酸的醯基的具體實例是八烷醯基(優選辛醯基)、十烷醯基(優選癸醯基)、十二烷醯基(優選月桂醯基)、十六烷醯基(優選棕櫚醯基)和十八烷醯基(優選硬脂醯基)並且其中可能有一個或多個雙鍵(諸如油醯基)。


圖1是顯示測試實施例中測定的隨時間推移脂質體在血液中濃度改變的圖。
圖2是顯示了根據實施例1的方法1製備脂質體的方法的示意圖。(a)是PEG修飾的含有NGPE的脂質體的示意圖。圖中的R′代表油醯基。脂質體中僅一個這樣的NGPE用化學式顯示。在實施例1的方法1的步驟(2)中，WSC與NGPE的箭頭所示羧基結合，由此獲得示意圖(b)所示的脂質體。在(b)中，儘管NGPE與WSC結合的鍵中僅一個鍵用化學式詳細顯示，但是其它鍵也是一樣。在那之後，人血清白蛋白(rHSA)的氨基與箭頭所示的羰氧(cabonyloxy)基結合，由此製備了示意圖(c)所示的脂質體。在(c)中，儘管NGPE與rHSA結合的鍵中僅一個鍵用化學式詳細顯示，但是其它鍵也是一樣。此外，儘管DSPE與PEG結合的鍵中僅一個鍵用化學式詳細顯示，但是其它鍵也是一樣。順便提及，R代表硬脂醯基。
圖3是顯示根據實施例1的方法2製備脂質體的方法示意圖。在實施例1的方法2的步驟(1)中，DOPE和SPDP結合製備DTP-DOPE，並且在步驟(2)中，用這種DTP-DOPE和結合PEG的DSPE作為脂質成分製備示意圖(a)所示的脂質體。圖中的R′代表油醯基。脂質體中僅一個這樣的DTP-DOPE用化學式顯示。當步驟(3)製備的硫醇化人血清白蛋白(rHSA)(圖中的(b))的巰基與所述脂質體中DTP-DOPE的二硫基反應時，製備了示意圖(c)所示的目標脂質體。在(c)中，儘管DTP-DOPE與rHSA結合的鍵中僅一個鍵用化學式詳細顯示，但是其它鍵也是一樣。此外，儘管DSPE與PEG結合的鍵中僅一個鍵用化學式詳細顯示，但是其它鍵也是一樣。順便提及，圖中的R代表硬脂醯基。
圖4是顯示根據實施例2的方法1製備脂質體的方法示意圖。(a)是根據實施例2的方法1(2)製備的硫醇化rHSA的示意圖。(b)是根據實施例2的方法1(1)製備的馬來醯亞胺-PEG-修飾的脂質體的示意圖。在(b)中，脂質體中僅一個馬來醯亞胺-PEG-DSPE用化學式顯示。當示意圖(a)所示的硫醇化rHSA與示意圖(b)所示的脂質體反應時，獲得示意圖(c)所示的目標脂質體。這裡，儘管通過馬來醯亞胺基將PEG與rHSA結合的鍵中僅一個鍵用化學式詳細顯示，但是其它鍵也是一樣。順便提及，圖中的R代表硬脂醯基。
圖5是顯示了根據實施例2的方法2製備脂質體的方法示意圖。(a)顯示了馬來醯亞胺-PEG-修飾的DSPE的化學式。(b)是根據實施例2的方法2(2)的步驟製備的硫醇化rHSA的示意圖。當示意圖(b)所示的硫醇化rHSA與示意圖(a)所示的脂質反應時，可以製備示意圖(c)所示的rHSA-PEG-DSPE複合體。當這種rHSA-PEG-DSPE複合體插入前面製備的脂質體時，可以獲得示意圖(d)所示的目標脂質體。這裡，儘管通過馬來醯亞胺基將PEG與rHSA結合的鍵和上述PEG與脂質體結合的鍵中僅一個鍵用化學式詳細顯示，但是其它鍵也是一樣。順便提及，圖中的R代表硬脂醯基。
圖6是顯示根據實施例3的方法1製備脂質體的方法示意圖。(a)是PEG修飾的含有NGPE的脂質體的示意圖。圖中的R′顯示油醯基。這種脂質體中僅一個NGPEs用化學式顯示。在實施例3方法1的步驟(4)中，WSC與NGPE的箭頭所示羧基結合，由此可以製備示意圖(b)所示的脂質體。在(b)中，儘管NGPE與WSC結合的鍵中僅一個鍵用化學式詳細顯示，但是其它鍵也是一樣。(c)是根據實施例3的方法1(2)製備的硫醇化rHSA的示意圖。當示意圖(c)所示硫醇化rHSA與示意圖(d)所示的馬來醯亞胺-PEG-修飾的DSPE反應時，可以製備示意圖(c)所示的通過馬來醯亞胺基結合聚乙二醇的白蛋白。當示意圖(b)所示的脂質體與示意圖(e)所示的白蛋白反應時，可以獲得示意圖(f)所示的目標脂質體，其中rHSA中的氨基與箭頭所示的羰氧(cabonyloxy)基結合。這裡，儘管通過馬來醯亞胺基與PEGrHSA結合的鍵和上述rHSA與脂質體結合的鍵中僅一個鍵用化學式詳細顯示，但是其它鍵也是一樣。
圖7是顯示根據實施例3的方法2製備脂質體的方法。在實施例3的方法2的步驟(1)中，DOPE和SPDP結合製備DTP-DOPE，並且在步驟(2)中，用這種DTP-DOPE作為脂質成分製備示意圖(a)所示的脂質體。圖中的R′顯示油醯基。(b)是根據實施例3的方法1，步驟(3)中製備的硫醇化rHSA的示意圖。當示意圖(b)所示硫醇化rHSA與示意圖(c)所示的馬來醯亞胺-PEG-修飾的DSPE反應時，可以製備示意圖(d)所示的通過馬來醯亞胺基結合聚乙二醇的白蛋白。在步驟(5)中，當上述白蛋白的氨基轉變為巰基時，可以製備示意圖(e)所示的白蛋白。當示意圖(a)所示的脂質體與示意圖(e)所示的白蛋白反應時，可以獲得示意圖(f)所示的目標脂質體，其中巰基與箭頭表示的二硫基結合。
本發明的最佳實施方式「脂質體」通常是指由以膜形式裝配的脂質和內部水相組成的脂質體，並且內部水相(參照D.D.Lasic「脂質體從基礎到應用」，ElsevierScience Publishers，pp.1-171(1933))和在本發明中指整個微泡，其中脂質的聚集無論是否含有內部水相。對本發明脂質體的結構也沒有特殊的限制，它可以是多層脂質體或單層脂質體。
儘管對本發明脂質體的尺寸沒有特殊限制，但是它的囊泡平均體積是大約10至5,000nm或，優選大約50至500nm。脂質體的囊泡平均體積可以根據動力學光散射法的原理進行確定。(參照D.D.Lasic的「脂質體從基礎到應用」，Elsevier Science Publishers，pp.1-171(1933))。
對於構成本發明脂質體的脂質也沒有特殊限制，它可以是任一種已知脂質。這樣的脂質實例是磷脂、糖脂、脂肪酸、二烷基二甲基銨兩性分子、聚甘油烷基醚、聚氧乙烯烷基醚等。(Liposome Technology，第2版，vol.1，141，1993)、烷基糖苷、烷基甲基葡萄糖胺(alkylmethylglucamides)、烷基蔗糖酯、二烷基聚氧乙烯醚、二烷基聚甘油醚等(Liposome Technology，第2版，vol.1，141，1993)、兩性分子嵌段共聚物等，諸如聚氧化乙烯-聚乳酸(日本專利公開號06/508,831)、長鏈烷基胺(十四烷胺、十六烷胺、十八烷胺等)或長鏈脂肪酸醯肼(肉豆蔻酸醯肼、棕櫚酸醯肼或硬脂酸醯肼等)等。
上述磷脂的實例是天然或合成的磷脂，諸如卵磷脂(大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、二月桂醯卵磷脂、二肉豆蔻醯卵磷脂、二棕櫚醯卵磷脂或二硬脂醯卵磷脂等等)、磷脂醯乙醇胺(二月桂醯磷脂醯乙醇胺、二肉豆蔻醯磷脂醯乙醇胺、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺或二硬脂醯磷脂醯乙醇胺等)、磷脂醯絲氨酸(二月桂醯磷脂醯絲氨酸、二肉豆蔻醯磷脂醯絲氨酸、二棕櫚醯磷脂醯絲氨酸或二硬脂醯磷脂醯絲氨酸等等)、磷脂酸、磷脂醯甘油(二月桂醯磷脂醯甘油、二肉豆蔻醯磷脂醯甘油、二棕櫚醯磷脂醯甘油或二硬脂醯磷脂醯甘油等)、磷脂醯肌醇(二月桂醯磷脂醯肌醇、二肉豆蔻醯磷脂醯肌醇、二棕櫚醯磷脂醯肌醇或二硬脂醯磷脂醯肌醇等)、溶血卵磷脂、鞘磷脂、蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂或氫化磷脂等。
上述糖脂的實例是甘油糖脂、鞘糖脂和甾醇等。上述甘油糖脂的實例是雙半乳糖甘油二酯(雙半乳糖二月桂醯甘油二酯、雙半乳糖二肉豆蔻醯甘油酯、雙半乳糖二棕櫚醯甘油酯或雙半乳糖二硬脂醯甘油酯等)或半乳糖甘油二酯(半乳糖二月桂醯甘油酯、半乳糖二肉豆蔻醯甘油酯、半乳糖二棕櫚醯甘油酯或半乳糖二硬脂醯甘油酯等)等等。上述鞘糖脂的實例是半乳糖苷腦苷脂、乳糖腦苷脂或神經節苷脂等。上述甾醇的實例是膽固醇、膽固醇半琥珀酸酯、3β-[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)甲氨醯]膽固醇、麥角固醇或羊毛甾醇等。
在本發明中，這樣的脂質可以單獨或通過組合其中兩種或更多種聯合使用。
儘管對本發明中使用的聚亞烷基二醇沒有特殊限制，但是優選具有1至6個碳原子的亞烷基鏈。亞烷基鏈可以用不影響本發明的取代基取代，諸如羥基、羧基、氨基和烷氧基等。更具體地，可以使用聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇等，，並且尤其優選使用聚乙二醇。儘管對聚亞烷基二醇的分子量沒有特殊限制，但是可以採用具有大約200至4,000,000分子量的聚亞烷基二醇，優選大約1,000至50,000。當使用聚乙二醇時，尤其優選具有上述分子量的分子。
儘管對聚亞烷基二醇的量沒有特殊限制，但是優選佔構成脂質體的脂質總量的大約0.5至30摩爾％。
對本發明中使用的白蛋白沒有特殊限制，並且其實例是動物白蛋白，諸如卵白蛋白、血清白蛋白、乳白蛋白或肌肉白蛋白(肌漿蛋白)和植物白蛋白，如谷白蛋白、豆白蛋白或蓖麻子白蛋白。其中，本發明優選使用作為給藥對象的同一動物的血清白蛋白。本發明中使用的白蛋白也可以是重組基因技術製備的白蛋白。上述白蛋白可以與野生型白蛋白具有相同的胺基酸序列或可以是突變型白蛋白，其中一個或多個，優選一個到幾個胺基酸缺失、取代或插入，只要不違背本發明的目的。用已知技術可以容易地製備這樣的白蛋白。在本發明中，優選使用基因重組白蛋白，因為沒有感染的風險。
在本發明中，儘管對白蛋白的量沒有特殊限制，但是優選佔構成脂質體的脂質總量的大約0.0001至10摩爾％。
本發明的脂質體可以是任何結構，只要它含有上述聚亞烷基二醇和白蛋白。聚亞烷基二醇與白蛋白結合的方式和位置可以是這種鍵形成的任何方式和任何位置。然而優選本發明的脂質體在其表面具有聚亞烷基二醇和白蛋白。此外，儘管聚亞烷基二醇和白蛋白可以任何形式與脂質體結合，諸如吸附、電結合、物理鍵(例如，範德華力)和化學鍵，但是優選通過化學鍵結合。
關於本發明脂質體的優選實施方案，可以列舉每一個聚亞烷基二醇和白蛋白與脂質體結合的例子(a)。以及，也可以列舉脂質體和白蛋白通過聚亞烷基二醇結合的例子(b)例證。因此，其是脂質體與聚亞烷基二醇結合，並且在與上述結合位點不同的位點，白蛋白與聚亞烷基二醇結合的情況。仍有另一種脂質體和聚亞烷基二醇通過白蛋白結合的情況(c)。因此，其是脂質體與白蛋白結合，並且在與上述結合位點不同的位點，聚亞烷基二醇與白蛋白結合的情況。在本發明中，上述實施方案(a)至(c)提及的脂質體可以混合狀態存在。
本發明的脂質體可以使用已知技術製備。下面將闡述以上面提及的三個實施方案中每個製備本發明脂質體的優選方法。
(a)聚亞烷基二醇和白蛋白與脂質體結合的情況中，製備本發明的脂質體的方法實例包括(i)將白蛋白與結合了聚亞烷基二醇的脂質體結合的方法，(ii)將聚亞烷基二醇與結合了白蛋白的脂質體結合的方法，以及(iii)使用結合了聚亞烷基二醇的脂質和結合了白蛋白的脂質製備脂質體的方法。
在上述方法(i)中，結合聚亞烷基二醇的脂質體可以使用已知方法容易地製備。一個實例是使用結合了聚亞烷基二醇的脂質製備脂質體的方法。上述「結合聚亞烷基二醇的脂質」的實例是聚亞烷基二醇修飾的磷脂、聚亞烷基二醇烷基醚、聚亞烷基二醇蓖麻油衍生物和聚亞烷基二醇山梨糖醇脂肪酸酯。對於這種脂質的「聚亞烷基二醇」部分，優選聚乙二醇。對於「結合聚亞烷基二醇的脂質」，優選聚乙二醇修飾的磷脂，並且更優選其中的磷脂是磷脂醯乙醇胺。
更具體地，例如為PEG-DSPE[1，2-二硬脂醯-sn-甘油基-3-磷脂醯乙醇胺-N-(聚乙二醇)]，下列公式(11)代表的N-單甲氧基聚乙二醇琥珀醯基磷脂醯乙醇胺CH3O-(CH2CH2O)n-CO-CH2CH2-CO-NH-PE (11)(其中n是5至100,000的整數，優選10至1,200的整數，並且-NH-PE是磷脂醯氨基)，下式(12)表示的N-單甲氧聚乙二醇(2-氯-1，3，5-三嗪-4，6-二基)琥珀醯基磷脂醯乙醇胺 (其中n和-NH-PE與上面定義的意思相同)，下式(13)代表的N-單甲氧聚乙二醇羰基磷脂醯乙醇胺CH3O-(CH2CH2O)n-1-CO-NH-PE (13)(在該式中，n和-NH-PE與上面定義的相同)以及下式(14)代表的N-單甲氧聚乙二醇乙烯磷脂醯乙醇胺CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-NH-PE(14)(其中n和-NH-PE與上面定義的相同)。
上述「結合聚亞烷基二醇的脂質」可以使用已知方法容易地製備或可以使用可以市售獲得的產品。對於使用這種脂質作為構成脂質製備脂質體的方法沒有特殊限制，但是可以使用已知方法。例如，使用上述脂質和水相通過薄膜法、反相蒸發法、乙醇注射法、醚注射法、脫水-再水化方法等等可以製備脂質體，並且可以通過超聲波照射方法、凍/融後超聲波照射、擠壓法、弗氏衝壓法、勻化法等來調節囊泡平均體積。(參照D.D.Lasic，」LiposomesFrom Basic to Applications」，Elsevier Science Publishers，pp.1-171(1933))。這裡，「水相」是指構成脂質體內部面積的水溶液，並且，儘管對其沒有特殊限制，只要其普遍應用於相關技術領域，優選氯化鈉水溶液、緩衝液諸如磷酸鹽緩衝液或醋酸鹽緩衝液、糖水溶液諸如葡萄糖水溶液或海藻糖水溶液或其混合物。為了保持脂質體結構的穩定，當施用於活體時，通常優選用於製備脂質體的水相幾乎與脂質體的外部等滲，換言之，與體液等滲並且施加到脂質體內部與外部的滲透壓很小。
為了將白蛋白與結合了聚亞烷基二醇而產生的脂質體結合，可以使用已知方法容易地實施這種結合，諸如巰基-馬來醯亞胺結合技術(Derksen，J.T.P.和Scherphof，G.L.(1985)，Biochem.Biophys.Acta，814，p.151-155)。尤其是，可以有利地採用上述脂質體和白蛋白通過活性摻入基團結合的方法。對於活性摻入基團沒有特殊限制，它可以是相關技術領域中已知的基團。
對於優選實施方案，可以列舉下列方法。因此，在結合聚亞烷基二醇的脂質體的製備中，除了結合聚亞烷基二醇的脂質外，具有活性摻入基團的脂質用作脂質成分。對於具有活性摻入基團的脂質，優選1，2-二油基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(戊二醯)(以下它將縮寫為「NGPE」)。使用這種脂質成分如上所述製備結合聚亞烷基二醇的脂質體，然後將白蛋白通過上述脂質體中的活性摻入基團與其結合。當使用NGPE時，優選白蛋白的氨基與NGPE的末端羧基結合。在那時，也可以預先結合提高上述脂質體活性摻入基團的反應性的功能基團，然後白蛋白可以與這樣結合取代功能基團。例如，當使用NGPE時，使用水溶性碳二亞胺，使碳二亞胺基與NGPE預先結合，然後白蛋白與這樣的NGPE結合取代碳二二亞胺基。
另一個優選實施方案是3-(2-吡啶硫代)丙酸酯(以下它將縮寫為「DTP」)與1，2-二油基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(以下它將縮寫為「DOPE」)的氨基結合的脂質(以下它將縮寫為「DTP-DOPE」)用作具有活性摻入基團的脂質的方法。更具體地，使用DTP-DOPE作為除了結合聚亞烷基二醇的脂質之外的脂質成分如上所述製備結合聚亞烷基二醇的脂質體。同時，巰基被引入白蛋白中。對於引入巰基的方法沒有特別限制，而是可以使用已知方法。優選地，將DTP引入白蛋白，接著進行與二硫蘇糖醇的反應以獲得引入巰基的白蛋白。當上述脂質體與白蛋白反應時，白蛋白可以與結合聚亞烷基二醇的脂質體結合。
上述(ii)和(iii)中提及的方法可以容易地根據上面提及的描述實施。
(b)在脂質體和白蛋白通過聚亞烷基二醇結合的情況中，製備本發明脂質體的方法實例為(i)製備結合了聚亞烷基二醇的脂質體，以及白蛋白與上述脂質體的聚亞烷基二醇結合的方法以及(ii)結合了白蛋白的聚亞烷基二醇在不同於白蛋白與其結合的位點與脂質體結合的方法。
在上面提及的方法(i)中，製備結合聚亞烷基二醇的脂質體的方法與上面提及的相同。對於白蛋白與脂質體的聚亞烷基二醇結合，可以使用已知方法。尤其可以採用聚亞烷基二醇通過活性摻入基團與白蛋白結合的方法。對於活性摻入基團沒有特殊限制，而是可以使用相關領域已知的任何基團，並且馬來醯亞胺基可以作為合適的實例示例。
更具體地，可以採用下列方法。因此，在結合了聚亞烷基二醇的脂質中，反應性功能基團與聚亞烷基二醇結合。例如，優選馬來醯亞胺基與聚亞烷基二醇的羥基結合。所產生的脂質以與上面提及相同的方法用於製備脂質體。當所產生的脂質體與白蛋白反應時，白蛋白通過聚亞烷基二醇結合的反應性功能基團與脂質體結合，因此獲得目標脂質體。在那時，可以實施已知的處理，諸如將對應於反應性功能基團的取代基引入白蛋白，使得反應性功能基團易於與白蛋白結合。當反應性的功能基團是馬來醯亞胺基時，優選巰基預先引入白蛋白。對於引入巰基的方法沒有特殊限制，而是可以使用已知方法。更具體地，將白蛋白與乙醯基硫代醋酸酯酯反應，使得乙醯基硫代醋酸酯酯與白蛋白的氨基結合，然後除去乙醯基，由此將巰基引入白蛋白。
在上面提及的方法(ii)中，對於其中聚亞烷基二醇和白蛋白結合的方法沒有特殊限制，而是可以使用已知方法，並且優選通過活性摻入基團進行結合。對於活性摻入基團沒有特殊限制，而是可以使用相關技術領域已知的基團，並且馬來醯亞胺基可以作為合適的實例示例。然後，在不同於白蛋白結合的位點，脂質體與所產生的結合白蛋白的聚亞烷基二醇結合。而且，對於其方法沒有特殊限制，而是可以使用已知方法。優選實例是預先結合脂質的聚亞烷基二醇用作聚亞烷基二醇並且上述步驟中製備的白蛋白-聚亞烷基二醇脂質複合體被插入脂質體中。
更具體地，如上所述將聚亞烷基二醇與脂質結合。然後，將反應性的功能基團與所產生脂質的聚亞烷基二醇結合。例如，優選馬來醯亞胺基與聚亞烷基二醇的羥基結合。然後，白蛋白通過反應性的功能基團與所產生脂質的聚亞烷基二醇結合。在那時，白蛋白可以接受已知處理，諸如將對應於上述反應性的功能基團的取代基引入白蛋白，使得上述反應性的功能基團易於與白蛋白結合。當上述反應性的功能基團是馬來醯亞胺基時，優選將巰基預先引入白蛋白。對於引入巰基的方法沒有特殊限制，而是可以使用已知方法。更具體地，白蛋白與乙醯基硫代醋酸酯酯反應，使得乙醯基硫代醋酸酯酯與白蛋白的氨基結合，然後除去乙醯基，由此產生引入巰基的白蛋白。另一方面，用已知方法製備脂質體並且將所產生的白蛋白-聚亞烷基二醇-脂質複合體插入脂質體而製備目標脂質體。
(c)在脂質體和聚亞烷基二醇通過白蛋白結合的情況中，製備本發明脂質體的方法實例為(i)在不同於聚亞烷基二醇結合的位點，將脂質體與結合聚亞烷基二醇的白蛋白結合的方法以及(ii)製備結合白蛋白的脂質體，然後將聚亞烷基二醇與上述脂質體的白蛋白結合的方法。
在上面提及的方法(i)中，對於聚亞烷基二醇和白蛋白結合的方法沒有特殊限制，而是可以使用已知方法，並且優選通過活性摻入基團進行這種結合。對於活性摻入基團沒有特殊限制，而是可以使用相關領域已知的基團，並且馬來醯亞胺基是合適的實例。更具體地，將反應性的功能基團與聚亞烷基二醇結合。例如，優選馬來醯亞胺基與聚亞烷基二醇的羥基結合。然後，白蛋白通過反應性的功能基團與所聚亞烷基二醇結合。在那時，白蛋白可以接受已知處理，諸如將對應於上述反應性的功能基團的取代基引入白蛋白，使得上述反應性的功能基團易於與白蛋白結合。當上述反應性的功能基團是馬來醯亞胺基時，優選將巰基預先引入白蛋白。對於引入巰基的方法沒有特殊限制，而是可以使用已知方法。更具體地，將白蛋白與乙醯基硫代醋酸酯反應，使得乙醯基硫代醋酸酯與白蛋白的氨基結合，然後除去乙醯基而產生引入巰基的白蛋白。
然後，脂質體與所產生的結合聚亞烷基二醇的白蛋白結合。其方法如上所述。
在上面提及的方法(ii)中，白蛋白與脂質體結合的這種方法如上所述。然後，聚亞烷基二醇與上述白蛋白結合。其方法也可以與上述相同。
上面提及的製備方法中產生的下列中間體是新的物質。
下式(3)代表的化合物(Alb-NH)-CO-CH2-CH2-SH(3)(其中Alb-NH是由從Alb-NH2代表的白蛋白分子的氨基除去一個氫原子形成的基團)，下式(5)代表的化合物(Alb-NH)-CO-CH2-SH(5)(其中Alb-NH與上面定義的意思相同)，下式(6)代表的化合物
(其中Alb-NH與上面定義的相同；n是5至100,000的整數，優選10至1,200的整數；R是來自具有2至35個碳原子的飽和或不飽和脂肪酸的醯基。更優選地，上述脂肪酸具有6至18個碳原子，並且最優選8至16個碳原子。這種脂肪酸的具體實例是八烷酸(優選辛酸)、十烷酸(優選癸酸)、十二烷酸(優選月桂酸)、十六烷酸(優選棕櫚酸)、十八烷酸(優選硬脂酸)和單烯酸或其多烯脂肪酸(優選油酸)。來自這種脂肪酸的醯基的具體實例是八烷醯基(優選辛醯基)、十烷醯基(優選癸醯基)、十二烷醯基(優選月桂醯基)、十六烷醯基(優選棕櫚醯基)和十八烷醯基(優選硬脂醯基)並且其中可能有一個或多個雙鍵(諸如油醯基)，下式(7)代表的化合物 (其中-NH-Alb-NH2是由從H2N-Alb-NH2代表的白蛋白分子的一個氨基除去一個氫原子形成的基團，並且n與上面定義的相同)，以及下式(8)代表的化合物 (其中-NH-Alb-NH是從式H2N-Alb-NH2代表的白蛋白分子的兩個氨基各除去一個氫原子形成的基團，並且n與上面定義的相同)。
優選地，本發明的脂質體以攜帶生理活性成分的形式使用。對於攜帶生理活性成分的方式沒有特殊限制。例如，生理活性成分可以包含入脂質體或可以吸附在脂質體上面或與其表面結合。此外，生理活性成分可以吸附在白蛋白或聚亞烷基二醇上面或與其結合。
對於生理活性成分沒有特殊限制，只要它是能夠施用於動物或優選人的化合物或物質組合物。例如，該生理活性成分包括發揮生理活性和有效預防或治療疾病的化合物或組合物，用於診斷的化合物或組合物(例如，造影劑)，和用於基因治療的基因。生理活性成分的具體實例是抗病毒劑如無環鳥苷、疊氮胸苷和幹擾素；抗菌劑如氨基糖苷、頭孢菌素和四環素；抗真菌劑如多烯抗生素、咪唑和三唑；抗代謝劑如葉酸、嘌呤和嘧啶類似物；抗腫瘤劑如蒽環黴素抗生素和植物鹼；甾醇如膽固醇；碳水化合物糖和澱粉；胺基酸，肽和蛋白諸如細胞受體蛋白、免疫球蛋白、酶、激素、神經遞質和糖蛋白；染料；放射性標記試劑諸如放射性同位素和放射性同位素標記的化合物；輻射不能透過的試劑；螢光化合物；散瞳化合物；支氣管擴張劑和局部麻醉劑。
在本發明中，尤其優選使用抗腫瘤劑作為生理活性成分。儘管對於抗腫瘤劑沒有特殊限制，但是其實例是烷化劑、各種代謝拮抗劑、抗腫瘤抗生素、其它抗腫瘤劑、抗癌植物成分、BRM(生物反應調節物)、血管生成抑制劑、細胞粘附抑制劑、基質金屬蛋白酶抑制劑和激素。
更具體地，烷化劑的實例是如氮芥、氮芥N-氧化物和苯丁酸氮芥；氮丙啶型烷化劑如卡波醌(carboquone)和硫替派(thiotepa )；環氧化物型烷化劑如二溴甘露醇和二溴衛矛醇；亞硝基脲型烷化劑如亞硝脲氮芥、環己亞硝脲(lomustine)、甲基環己亞硝脲(semustine)、鹽酸尼莫司汀(nimustine hydrochloride)、鏈脲黴素、吡葡亞硝脲(chlorozotocin)和雷諾氮芥(ranimustine)；白消安；improsulfantosylate；和氮烯唑胺(dacarbazine)。各種代謝拮抗劑的實例是嘌呤代謝拮抗劑如6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤和硫代肌苷；嘧啶代謝拮抗劑如氟尿嘧啶、喃氟啶(tegafur)、喃氟啶尿嘧啶、氟基嘧啶(carmofur)、去氧氟尿苷、broxiuridine、阿糖胞苷(cytarabine)和依諾他賓；葉酸代謝拮抗劑如氨甲喋呤和三甲曲沙；及其鹽和複合物。
抗腫瘤抗生素的實例是蒽環黴素型抗生素抗腫瘤劑如絲裂黴素A、博萊黴素、培洛黴素、道諾紅菌素、阿克拉黴素A(aclarubicin)、阿黴素、吡柔比星(Pirarubicin)、THP-阿黴素、4′-表阿黴素(4』-epidoxorubicin)和表柔比星(epirubicin)；色黴素A3；放線菌素D；及其鹽或複合物。其它抗腫瘤劑的實例是順氯氨鉑、卡波鉑(carboplatin)、三苯氧胺、喜樹鹼、異環磷醯胺(ifosfamide)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、苯丙氨酸氮芥(melfalan)、L-天冬醯胺酶、乙醯葡醛酯(aceglatone)、西索菲蘭(sizofiran)、picibanil、烏苯美司(ubenimex)、雲芝多糖(Krestin)及其鹽或複合物。其它實例是甲基苄肼(Procarbazine)、雙溴丙基哌嗪(pipobroman)、新制癌菌素(neocarzinostatin)和羥基脲。
抗癌植物成分的實例是長春花生物鹼諸如去乙醯長春醯胺(vindesine)、長春新鹼和長春花鹼；表鬼臼脂素(epipodophyllotoxin)諸如足葉乙甙(etoposide)和替尼泊甙(teniposide)；及其鹽或複合物。BRM的實例是腫瘤壞死因子、消炎痛(indomethacin)及其鹽或複合物。血管生成抑制劑的實例是煙麴黴素(fumagillol)衍生物及其鹽或複合物。細胞粘附抑制劑的實例是具有RGD序列(Arg-Gly-Asp)的物質及其鹽或複合物。基質金屬蛋白酶抑制劑的實例是馬馬司他(marimastat)、巴馬司他(batimastat)及其鹽或複合物。激素的實例是氫化可的松、地塞米松、甲基脫氫皮質甾醇、脫氫皮質甾醇、普拉雄酮(prasterone)、倍他米松(betamethasone)、氟羥脫氫皮質甾醇(triamcinolone)、康復龍(oxymetholone)、諾龍(nandrolone)、美替諾龍(metenolone)、磷雌酚(fosfestrol)、乙炔基雌二醇(Ethynylestradiol)、氯地孕酮(chlormadinone)、甲羥孕酮(medroxyprogesterone)及其鹽或複合物。
儘管本發明的藥物組合物可以僅包含攜帶上述生理活性成分的本發明的脂質體，但是它通常是用前述已知方法[在藥物製劑領域普遍使用的方法，如日本藥典(如第13版)中提及的方法]將脂質體與藥用載體混合製備的。對於藥用載體而言，可以使用已經普遍作為藥物製劑原料的各種類型有機或無機載體。這種載體的實例是固體製劑中的賦形劑、潤滑劑、粘合劑和崩解劑；以及溶劑、增溶劑、懸浮劑、等滲劑、緩衝液和光滑劑(soothing agents)。如果必要，也可以使用藥物製劑的添加劑，諸如表面活性劑、起泡劑、染料、酸化劑、防腐劑、抗氧化劑、著色劑、甜味劑和矯正劑。
對於藥用載體而言，更具體的實例是無機鹽的賦形劑諸如檸檬酸鉀和磷酸鈣；潤滑劑諸如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、輕矽酸酐和含水二氧化矽；粘合劑諸如羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、α-澱粉、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯膠、明膠和支鏈澱粉；以及崩解劑諸如纖維素(例如取代度低的羥丙基纖維素和結晶纖維素)、各種澱粉或澱粉衍生物(例如，玉米澱粉、部分α-澱粉和羥丙基澱粉)、聚乙烯聚吡咯烷酮和膨潤土。
其它實例是溶劑諸如鹽溶液、葡萄糖溶液以及鹽溶液和葡萄糖溶液的混合物；增溶劑諸如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、苯甲酸鈉、乙二胺、水楊醯胺、尼克醯胺和聚氧化乙烯氫化蓖麻油；緩衝液諸如硼酸鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、酒石酸鹽緩衝液和醋酸鹽緩衝液；白蛋白；多元醇諸如甘油和丙二醇；以及光滑劑(soothingagents)諸如鹽酸利多卡因(lidocaine hydrochloride)和苯甲醇。
更多實例是表面活性劑，諸如失水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、磷脂、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚氧化乙烯氫化蓖麻油、聚氧乙烯烷基醚和蔗糖脂肪酸酯；起泡劑諸如碳酸氫鈉、碳酸鈉和碳酸鈣；酸化劑諸如檸檬酸、酒石酸和蘋果酸；染料諸如三氧化二鐵、黃色三氧化二鐵和焦油染料；香料如檸檬、檸檬酸橙、桔子、菠蘿、薄荷和薄荷醇；甜味劑如糖精鈉、甘草甜素二鉀、阿斯巴甜(aspartame)、甜菊糖甙(stevia)和索馬甜(thaumatin)；和矯正劑如檸檬酸、檸檬酸鈉、琥珀酸、酒石酸、延胡索酸和穀氨酸。
此外，對於穩定劑而言，例如為糖和亞硫酸鈉。糖的實例是單糖諸如葡萄糖、果糖、木糖醇、巖藻糖和半乳糖；二糖諸如麥芽糖、蔗糖、乳糖、乳果糖和蜜二糖；寡糖諸如果糖寡糖、半乳糖寡糖和乳寡糖；以及多糖諸如葡聚糖。防腐劑的實例是p-苯甲酸酯、苯甲醇、氯甲酚、苯乙醇和苯索氯銨。螯合劑的實例是乙二胺四乙酸鈉和檸檬酸鈉。抗氧化劑的實例是亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、抗壞血酸鈉和硫代硫酸鈉。
本發明的藥物劑型是口服製劑如片劑、膠囊(包括軟膠囊、微膠囊和腸溶膠囊)、稀釋粉劑、粒劑和糖漿；以及腸胃外製劑諸如注射製劑(例如，皮下注射製劑、靜脈注射製劑、肌肉注射製劑和腹膜內注射液)、外用劑(例如，鼻製劑、經皮製劑和油膏)、栓劑(例如直腸栓劑和陰道栓劑)、丸劑、輸注製劑和緩釋製劑(例如，緩釋微膠囊)。尤其優選的本發明的藥物為注射製劑的劑型。
儘管本發明藥物的劑量不能明確確定，因為它依賴於脂質體中生理活性成分的種類、藥物劑型、待治療的疾病種類、待治療的症狀和疾病的嚴重性、患者的年齡、性別或體重、給藥途徑等等而變化，但是通過醫生對上面提及因素的總體判斷可以確定。
對於本發明藥物的給藥途徑沒有特殊限制，根據上面提及的本發明的劑型，它可以口服或腸胃外施用。例如，當本發明的藥物是注射製劑時，例如可以採用醫學上合適的給藥形式如靜脈注射、皮下注射、皮內注射、肌肉注射或腹膜內注射。
本發明的藥物可以預防或治療各種疾病，依賴於本發明脂質體攜帶的生理活性物質的種類。例如，當生理活性物質是抗腫瘤劑時，本發明的藥物可用於預防或治療腫瘤，諸如結腸直腸癌、腦腫瘤、頭部和頸部癌症、乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽囊癌、膽管癌、胰腺癌、胰島細胞癌、絨毛膜癌、結腸癌、腎細胞癌、腎上腺皮質癌、膀胱癌、睪丸癌、前列腺癌、睪丸腫瘤、卵巢癌、子宮癌、絨毛膜癌、甲狀腺癌、惡性類癌、皮膚癌、惡性黑色素瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤、成神經細胞瘤、維爾姆斯氏瘤、成視網膜細胞瘤、黑素瘤和鱗狀細胞癌。
實施例如下所示，將通過實施例的方式詳細闡明本發明，儘管不言而喻本發明不限於下列實施例。下列實施例中使用的rHSA購自Bifa Co。實施例中提及的縮寫的定義如下rHSA重組人血清白蛋白PEG；聚乙二醇DSPE1，2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺NGPE1，2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(戊二醯)NHSN-羥基琥珀醯亞胺WSC水溶性碳二亞胺SPDPN-琥珀醯亞胺基3-(2-吡啶二硫)丙酸酯DTP3-(2-吡啶二硫)丙酸酯DOPE；1，2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺DTT二硫蘇糖醇SATAN-琥珀醯亞胺基-S-乙醯硫代醋酸酯HEPESN-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸EDTA乙二胺四乙酸鈉鹽PBSpH 7.4的磷酸鹽緩衝液(包含氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉)實施例1脂質體的製備，其中PEG和rHSA與其表面結合方法1使用WSC進行製備(1)PEG修飾的含有NGPE的脂質體的製備溶解了脂質(總脂質100μmol；以蛋黃卵磷脂∶膽固醇∶NGPE∶結合PEG的DSPE(Shearwater Co製造)的摩爾比＝59∶20∶10∶1溶解)的大約8mL的氯仿溶液添加到茄型燒瓶酯。然後，添加2,000,000dpm的[3H(氚)]膽固醇基十六烷基醚(由日本放射性同位素協會製造)。添加氯仿製成總體積10mL，使用旋轉蒸發器在氮氣下真空蒸發溶劑，隨後乾燥一夜。向所產生的脂質薄膜中添加約2mL的PBS，混合物在55℃加熱攪拌混合15分鐘或更長時間，使得脂質薄膜懸浮。用裝有200nm聚碳酸酯膜的擠壓機使懸浮液的顆粒大小統一。
(2)rHSA-PEG修飾的脂質體的製備向上述PEG修飾的脂質體中添加100μmol的NHS和10μmol的WSC，並且攪拌混合物15分鐘使得NGPE和WSC與其結合，在此時間後添加500μmol的2-巰基乙醇。為了除去沒有與脂質體結合的NHS和WSC，通過凝膠過濾從脂質體餾分分離低分子量物質而回收脂質體餾分。向該脂質體餾分中立即添加1μmol的rHSA，混合物振蕩過夜使得rHSA與脂質體結合。為了除去未反應的rHSA，進行凝膠過濾以分離結合rHSA的脂質體餾分和單獨的rHSA餾分，結果回收結合rHSA的脂質體餾分(10mL)。
方法2使用SPDP進行製備(1)DTP-DOPE的製備向DOPE的氯仿溶液(10μmol)中添加SPDP(12μmol)，並攪拌該溶液。向反應溶液中添加大約2mL的PBS，並用力攪拌混合物5分鐘，然後在3,000rpm離心10分鐘。除去PBS層後，添加純水並用力振蕩混合物3分鐘，再次離心除去水層。再次實施照這樣的純水洗滌。用蒸發器對留在下層的白色半固體進行溶劑蒸發並乾燥。殘餘物中添加1.0mL的氯仿並再次溶解製備DTP-DOPE。
(2)PEG修飾的含有DTP-DOPE的脂質體的製備溶解了脂質(總脂質100μmol；以蛋黃卵磷脂∶膽固醇∶結合PEG的DSPE(Shearwater Co製造)的摩爾比率＝59∶30∶1溶解)的大約8mL氯仿溶液添加到茄型燒瓶。然後，添加1Oμmol的DTP-DOPE和2,000,000dpm的[3H(氚)]膽固醇基十六烷基醚(由日本放射性同位素協會製造)。添加氯仿製成10mL總體積，並使用旋轉蒸發器在氮氣下真空蒸發溶劑，並乾燥過夜。向所產生的脂質薄膜中添加大約2mL的PBS，將混合物在55℃加熱攪拌混合15分鐘或更長時間，使得脂質薄膜懸浮。用裝有200nm聚碳酸酯膜的擠壓機使懸浮液的顆粒大小統一。
(3)硫醇化rHSA的製備將SPDP(20μmol)添加到1μmol的rHSA水溶液中，隨後攪拌製備DTP-rHSA。為了除去未反應的SPDP，進行凝膠過濾收集PD-rHSA餾分。將DTT添加到DTP-rHSA中以形成50mM的終濃度，混合物攪拌20分鐘使rHSA被硫醇化。為了除去未反應的DTT，進行凝膠過濾收集硫醇化rHSA餾分。
(4)含有DTP-DOPE的脂質體與硫醇化rHSA的反應向PEG修飾的含有DTP-DOPE的脂質體中添加硫醇化rHSA溶液，在室溫下攪拌混合物24小時或更長時間。然後，反應溶液接受凝膠過濾使脂質體和未反應的rHSA分離，回收脂質體餾分得到rHSA-PEG修飾的脂質體。
實施例2製備脂質體的方法，其中將PEG與其表面結合併且將rHSA與PEG末端結合方法1製備PEG修飾的脂質體，然後rHSA與PEG結合的製備方法(1)馬來醯亞胺-PEG-修飾的脂質體的製備將溶解了脂質(總脂質100μmol；以蛋黃卵磷脂∶膽固醇∶結合馬來醯亞胺-PEG的DSPE(Shearwater Co製造)的摩爾比率＝63∶32∶5溶解)的大約8mL氯仿溶液添加到茄型燒瓶。向其中添加[3H(氚)]膽固醇基十六烷基醚(由日本放射性同位素協會製造)(2,000,000dpm)。添加氯仿使製成10mL總體積，然後使用旋轉蒸發器在氮氣下真空蒸發該溶劑，隨後乾燥過夜。向所產生的脂質薄膜中添加大約2mL的PBS，混合物在55℃加熱攪拌混合15分鐘或更長時間，使得脂質薄膜懸浮。用裝有200nm聚碳酸酯膜的擠壓機使懸浮液的顆粒大小統一。
(2)使用SATA製備硫醇化rHSA將溶於二甲基甲醯胺的8μmol SATA以使二甲基甲醯胺濃度不達到1％或更高的方式添加到rHSA水溶液(1μmol)中，混合物在室溫下振蕩30分鐘使乙醯基硫代醋酸酯與rHSA的氨基結合。為了除去未反應的SATA，進行凝膠過濾收集結合乙醯基硫代醋酸酯的rHSA餾分。添加溶於0.5M HEPES和25mM EDTA的羥胺(50μmol)以除去乙醯基，由此製備硫醇化rHSA。
(3)修飾的PEG和rHSA與脂質體的結合馬來醯亞胺-PEG修飾的脂質體溶液和硫醇化rHSA溶液混合併在4℃或更低溫度下反應18小時。最後，進行凝膠過濾除去未反應的硫醇化rHSA餾分，由此回收PEG修飾的結合rHSA的脂質體。
方法2rHSA與PEG-DSPE結合，隨後插入脂質體的製備方法(1)脂質體的製備將溶解了脂質(總脂質95μmol；以蛋黃卵磷脂∶膽固醇的摩爾比率＝63∶32溶解)的大約8mL氯仿溶液添加到茄型燒瓶中。[添加[3H(氚)]膽固醇基十六烷基醚(由日本放射性同位素協會製造)(2,000,000dpm)。向其中添加氯仿製成10mL總體積，然後使用旋轉蒸發器在氮氣下真空蒸發該溶劑，並乾燥過夜。向所產生的脂質薄膜中添加大約2mL的PBS，混合物在55℃加熱攪拌混合15分鐘或更長時間，使得脂質薄膜懸浮。用裝有200nm聚碳酸酯膜的擠壓機使懸浮液的顆粒大小統一。
(2)使用SATA製備硫醇化rHSA將溶於二甲基甲醯胺的8μmol SATA以使二甲基甲醯胺濃度不達到1％或更高的方式添加到rHSA水溶液(1μmol)中，並且混合物在室溫下振蕩30分鐘使得乙醯基硫代醋酸酯與rHSA的氨基結合。為了除去未反應的SATA，進行凝膠過濾收集結合乙醯基硫代醋酸酯的rHSA餾分。添加溶於0.5M HEPES和25mM EDTA的羥胺(50μmol)以除去乙醯基，由此製備硫醇化rHSA。
(3)rHSA與馬來醯亞胺-PEG的結合將結合馬來醯亞胺-PEG的DSPE(由Shearwater Co製造)(5μmol)和硫醇化rHSA溶液在4℃或更低溫度混合併允許反應18小時。進行凝膠過濾收集結合rHSA-PEG的DSPE餾分。
(4)將結合rHSA-PEG的DSPE插入脂質體中將結合了r-HAS-PEG的DSPE溶液添加到上述(1)製備的脂質體中，並且振蕩混合物以插入脂質體，由此用rHSA-PEG修飾脂質體表面。
實施例3脂質體的製備方法，其中rHSA結合在其表面，並且此外，PEG與rHSA結合方法1使用SATA和WSC的製備(1)含有NGPE的脂質體的製備溶解了脂質的大約8mL氯仿溶液(總脂質100umol；以蛋黃卵磷脂∶膽固醇∶NGPE的摩爾比率＝60∶30∶10溶解)添加到茄型燒瓶中。[添加[3H(氚)]膽固醇基十六烷基醚(由日本同位素協會製造)(2,000,000dpm)。向其中添加氯仿使製成10mL總體積，然後使用旋轉蒸發器在氮氣下真空蒸發該溶劑，並乾燥過夜。向所產生的脂質薄膜中添加大約2mL的PBS，並且混合物在55℃加熱攪拌混合15分鐘或更長時間，使得脂質薄膜懸浮。用裝有200nm聚碳酸酯膜的擠壓機使懸浮液的顆粒大小統一。
(2)使用SATA製備硫醇化rHSA將溶於二甲基甲醯胺的8μmol SATA以使二甲基甲醯胺濃度不達到1％或更高的方式添加到rHSA水溶液(1μmol)中，並在室溫下振蕩混合物30分鐘使乙醯基硫代乙酸酯與rHSA的氨基結合。為了除去未反應的SATA，進行凝膠過濾收集結合乙醯基硫代醋酸酯的rHSA餾分。添加溶於0.5M HEPES和25mM EDTA的羥胺(50μmol)以除去乙醯基，由此製備硫醇化HSA。
(3)rHSA對馬來醯亞胺-PEG的修飾馬來醯亞胺-PEG(Shearwater Co製造)(5μmol)和硫醇化rHSA溶液在4℃或更低溫度混合併反應18小時。進行凝膠過濾收集rHSA-PEG餾分。
(4)rHSA-PEG與含有NGPE的脂質體的結合將100μmol的NHS和10μmol的WSC添加到上述含有NGPE的脂質體中，混合物振蕩15分鐘使NGPE和WSC與其結合。向溶液中添加500μmol的2-巰基乙醇。為了除去沒有與脂質體結合的NHS和WSC，凝膠過濾進行分離並回收脂質體餾分。立即添加rHSA-PEG(相當於1μmolrHSA)，隨後振蕩過夜使rHSA PEG與脂質體結合。進行凝膠過濾除去未反應的rHSA-PEG以回收結合rHSA-PEG的脂質體餾分。
方法2使用SATA和SPDP的製備(1)DTP-DOPE的製備向DOPE的10μmol氯仿溶液中添加SPDP(12μmol)，並攪拌該混合物。向反應中添加大約2mL的PBS，並用力攪拌混合物5分鐘，並以3,000rpm離心10分鐘。除去PBS層後，添加純水並用力振蕩混合物3分鐘，並離心除去水層。再次實施這樣的純水洗滌。用蒸發器將留在下層的白色半固體進行溶劑蒸發，然後乾燥。將1.0mL的氯仿添加到殘餘物中再次溶解，產生DTP-DOPE。
(2)含有DTP-DOPE的脂質體的製備溶解了脂質(總脂質90μmol；以蛋黃卵磷脂∶膽固醇的摩爾比率＝60∶30溶解)的大約8mL氯仿溶液添加到茄型燒瓶中。然後，向其中添加10μmol的DTP-DOPE，和2,000,000dpm的[3H(氚)]膽固醇基十六烷基醚(由日本放射性同位素協會製造)添加到混合物中。添加氯仿製成10mL總體積，然後使用旋轉蒸發器在氮氣下真空蒸發溶劑並乾燥過夜。向所產生的脂質薄膜中添加大約2mL PBS，混合物在55℃加熱攪拌混合15分鐘或更長時間，使脂質薄膜懸浮。用裝有200nm聚碳酸酯膜的擠壓機使懸浮液的顆粒大小統一。
(3)使用SATA製備硫醇化rHSA向rHSA水溶液(1μmol)中以使二甲基甲醯胺濃度不達到1％或更高的程度添加溶於二甲基甲醯胺的8μmol SATA，並在室溫下振蕩混合物30分鐘使乙醯基硫代乙酸酯與rHSA的氨基結合。為了除去未反應的SATA，進行凝膠過濾收集結合乙醯基硫代醋酸酯的rHSA餾分。添加溶於0.5M HEPES和25mM EDTA的羥胺(50umhepesol)以除去乙醯基，由此製備硫醇化rHSA。
(4)rHSA對馬來醯亞胺-PEG的修飾馬來醯亞胺-PEG(5μmol)和硫醇化rHSA溶液在4℃或更低溫度下混合併反應18小時。進行凝膠過濾收集rHSA-PEG餾分。
(5)硫醇化rHSA-PEG的製備將SPDP(200μmol)添加到rHSA-PEG水溶液(相當於1μmol的rHSA)中，並攪拌混合物以製備DTP-rHSA-PEG。進行凝膠過濾除去未反應的SPDP，收集DTP-rHSA-PEG餾分。將DTT添加到DTP-rHSA-PEG餾分酯以形成50mM的終濃度，並混合物攪拌20分鐘使得一部分rHSA被硫醇化。為了除去未反應的DTT，進行凝膠過濾收集硫醇化rHSA-PEG的餾分。
(6)含有DTP-DOPE的脂質體與硫醇化rHSA-PEG的反應向含有DTP-DOPE的脂質體中添加硫醇化rHSA-PEG溶液，並在室溫下攪拌混合物24小時或更長時間，因此脂質體被rHSA-PEG修飾。然後，將反應溶液進行凝膠過濾使脂質體和未反應的rHSA-PEG分離，由此回收脂質體餾分並製備rHSA-PEG-修飾的脂質體。
試驗實施例.脂質體樣品對大鼠的給藥實驗(1)血液水平的研究將實施例1製備的脂質體樣品(20μmol/kg)施用於三隻大鼠中的每一隻。從施用後立即到其後24小時，每隔4小時從頸動脈收集約300μl的血液並立即進行離心分離(以1500×g，4℃，3分鐘)。回收上清液(100μl)，向其中添加10mL的Clearsol(液體閃爍混合物)，並充分混合該混合物。使用液體閃爍計數器對液體定量測定。每個樣品測定5分鐘。
作為比較，用在其表面沒有進行修飾的脂質體和表面用PEG修飾的脂質體進行相同測試。
結果顯示在圖1中。圖1中顯示的數據是三隻大鼠血液水平的平均值。
工業實用性當聚乙二醇鏈和白蛋白分子與脂質體表面結合時，脂質體施用於人和動物後提高了其在血液中的滯留性，並提高了包含入脂質體或與之結合的藥物的療效和診斷效果。通過使用基因重組人血清白蛋白作為白蛋白，可以製備沒有感染風險，並且與單獨PEG的情況相比，在代謝方面生物適合性提高的脂質體。
權利要求
1.結合聚亞烷基二醇和白蛋白的脂質體。
2.根據權利要求1的脂質體，其中進一步含有生理活性成分。
3.根據權利要求2的脂質體，其中的生理活性成分是藥物活性成分。
4.根據權利要求3的脂質體，其中的藥物活性成分是抗腫瘤劑。
5.含有權利要求2至4任一項所述的脂質體的藥物組合物。
6.根據權利要求5的藥物組合物，其是注射劑。
7.治療癌症的方法，包括施用含有結合聚亞烷基二醇和白蛋白並且其中含有抗腫瘤劑的脂質體的藥物組合物。
8.結合聚亞烷基二醇和白蛋白並且其中含有生理活性成分的脂質體在延長生理活性成分在體內滯留時間中的應用。
9.權利要求1中所述脂質體的製備方法，其特徵在於，具有下式(1)代表的化合物作為脂質成分的脂質體與白蛋白結合 (其中R是來自具有2至35個碳原子的脂肪酸的醯基)；具有下式(2)代表的化合物作為脂質成分的脂質體與下式(3)代表的化合物結合 (其中R與上面定義的相同)(Alb-NH)-CO-CH2-CH2-SH (3)(其中Alb-NH是從Alb-NH2代表的白蛋白分子除去氨基的一個氫原子形成的基團)；具有下式(4)代表的化合物作為脂質成分的脂質體與下式(5)代表的化合物結合 (其中n是5至100,000的整數，並且R與上面定義的相同)(Alb-NH)-CO-CH2-SH (5)(其中Alb-NH與上面定義的意思相同)；由下式(6)代表的化合物插入脂質體 (其中n、R和Alb-NH每個與上面定義的相同)；具有上式(1)代表的化合物作為脂質成分的脂質體與下式(7)代表的化合物結合 (其中-NH-Alb-NH2是從H2N-Alb-NH2代表的白蛋白分子的一個氨基除去一個氫原子形成的基團，並且n與上面定義的相同)；或具有上式(2)代表的化合物作為脂質成分的脂質體與下式(8)代表的化合物結合 (其中-NH-Alb-NH是從式H2N-Alb-NH2代表的白蛋白分子的兩個氨基各除去一個氫原子形成的基團，並且n與上面定義的相同)。
全文摘要
本發明提供了與聚亞烷基二醇和白蛋白結合的在血液中具有良好滯留性的脂質體。
文檔編號A61P35/00GK1711074SQ20038010323
公開日2005年12月21日 申請日期2003年11月12日 優先權日2002年11月15日
發明者甲斐俊哉, 橫江淳一, 東由子, 佐藤誠, 木村聰城朗, 檜垣和孝 申請人:尼普洛株式會社