一種實時螢光rt-pcr檢測人偏肺病毒的試劑盒及其應用的製作方法

2023-09-15 19:49:50

一種實時螢光rt-pcr檢測人偏肺病毒的試劑盒及其應用的製作方法
【專利摘要】一種實時螢光RT-PCR檢測人偏肺病毒的試劑盒及其應用，屬於基因檢測領域。本發明的試劑盒靈敏度和特異性非常高。通過本發明試劑盒實現了對痰液、鼻咽拭子等樣品中的人偏肺病毒的快速早期檢測和定量分析。本發明檢測周期短、效率高；檢測病毒特異性強，準確率高；病毒定性分析的同時還能定量分析；可檢測出的病毒的最低濃度為1.0×102copies/mL，靈敏度比普通PCR和免疫學檢測方法高；操作簡單、易於推廣；實驗結果重複性好。
【專利說明】—種實時螢光RT-PCR檢測人偏肺病毒的試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於基因檢測領域，涉及一種實時螢光RT-PCR檢測人偏肺病毒的試劑盒及其應用。本發明的試劑盒中包含有篩選獲得的一對寡核苷酸引物和一條寡核苷酸探針，本發明試劑盒具有早期、快速、靈敏、特異的特點，還可用於人偏肺病毒的定量分析。
【背景技術】
[0002]人偏肺病毒(human metapneumovirus,hMPV)是新近發現的一種呼吸道致病病毒，2001年首次在荷蘭一嬰兒的鼻咽部抽吸物中被分離得到，根據它的形態學、生物化學以及基因學特點，hMPV 一開始被分類為禽偏肺病毒，禽偏肺病毒可以引起火雞和其他鳥類的上呼吸道感染，現在普遍認為hMPV屬於肺病毒亞科的副黏病毒。
[0003]hMPV是一個有包膜的大約13 kb單股負鏈RNA病毒，序列與禽偏肺病毒相似，hMPV基因3』?5』的序列為N-P-MF-M2-SH-G-L。M基因mRNA編碼兩個重疊的開放性閱讀框M2-1和M2-2,與人合胞病毒(respiratorysyncytial virus, RSV) 一樣。hMPV的傳播途徑是通過呼吸道飛沫、或者手一口、手一眼接觸汙染的物體表面傳播。全世界各國的感染率變化範圍很大，在1.5%?41%之間，hMPV初次·感染一般發生在小於2歲的兒童，尤其是小於12個月的幼兒為主。對於大齡兒童和成人來說，感染人群主要是免疫抑制劑使用者和器官移植者，或者有慢性肺部疾病的患者。hMPV感染被認為是器官移植者的主要致病因子。
[0004]hMPV感染可以引起上呼吸道或者下呼吸道感染，呈現比較典型的副黏病毒感染症狀，主要表現為咳嗽、咳痰、喘息、氣促、流涕以及發熱、肌痛、頭痛、乏力等全身症狀，部分可出現低氧血症，但是感染症狀不特異，單獨從症狀無法與其他呼吸道病毒感染相區別。hMPV感染在成人中引起流感樣疾病，在老人中更多表現為呼吸困難和喘息，有心肺基礎性疾病的老年患者發病率更要高出一倍，而且身體比較虛弱的患者可以導致嚴重的疾病，如肺炎、呼吸衰竭等。
[0005]常用的檢測人偏肺病毒感染的方法主要有四種:
[0006](I)組織培養病毒分離:從鼻咽分泌物及咽拭子中分離病毒接種於原代人胚腎細胞、人胚肺成纖維細胞或猴腎細胞及HeLa細胞等，經培養2?3d後用中和抗體做中和試驗和空斑形成試驗，進行特異的血清型鑑定。
[0007](2)血清學檢測:包括補體結合試驗、血凝抑制試驗、間接免疫螢光及酶聯免疫試驗等，但由於缺乏合適的交叉反應抗原以覆蓋眾多hMPV血清型，使得這些方法的應用受到很大限制。
[0008](3)分子生物學檢測:近來RT-PCR的方法已廣泛用於hMPV的檢測，其對hMPV檢測較組織培養更敏感更快捷。
[0009](4)螢光定量PCR技術(FQ-PCR)是近年來發展起來的一種快速直接的核酸的檢測技術。螢光定量PCR技術是在普通PCR的基礎上發展起來的實時核算定量檢測技術，是指在PCR反應體系中加入螢光基因，利用螢光信號累積實時監測整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。一步法實時螢光RT-PCR技術是實時螢光定量PCR技術的一種也稱為逆轉錄實時PCR，這是一種直接快速檢測RNA的方法，它與螢光定量PCR技術的不同之處是多加了逆轉錄酶，同時多加了一個逆轉錄反應的步驟。實時螢光定量PCR法最大的優點是克服了終點PCR法進入平臺期或叫飽和期後定量的較大誤差，實現DNA/RNA的精確定量。該技術不僅實現了對DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實現多重反應、自動化程度高、無汙染、實時和準確等特點，該技術在醫學臨床檢驗及臨床醫學研究方面有著重要的意義。

【發明內容】

[0010]本發明的目的是提供一種螢光實時RT-PCR檢測試劑盒，特別是涉及以一步法實時螢光逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術早期、快速、靈敏、特異診斷人偏肺病毒感染的試劑盒。
[0011]本試劑盒檢測的基本原理是利用一對特異性的寡核苷酸引物和一條特異性寡聚核苷酸探針，在逆轉錄酶、耐熱DNA聚合酶、高品質的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、RNA酶抑制劑以及Mg2+等RT-PCR反應緩衝液，通過螢光PCR擴增儀實現靶核苷酸的擴增，從而實現分別快速、高效、特異、實時定量檢測人偏肺病毒寡核苷酸的目的。
[0012]為了高效、特異、靈敏的檢測出人偏肺病毒，本發明在對GeneBank中所有的現有的人偏肺病毒基因序列進行生物信息學分析，找出了人偏肺病毒的特異性保守區，並對這個保守區域設計了多對引物、探針。通過對人偏肺病毒標準株的檢測，篩選出靈敏度高、特異性好、且針對人偏肺病毒的一對引物(用於擴增人偏肺病毒靶多核苷酸)和一條探針，即:能與雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈特異性結合的寡核苷酸正向引物hMPV-F、能與雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈特異性結合的寡核苷酸反向引物hMPV-R、能與靶多核苷酸特異性結合併且兩末端分別結合有突光報告集團和突光粹滅集團的寡核苷酸探針hMPV-P,其中突光報告基團任選自FAM、TET、JOE、HEX、VIC ;螢光猝滅基團任選自:TAMRA、DABCYL, BHQ。
[0013]其中:正向引物hMPV-F. 的序列為:5' -ATGCGCAGGACTAAAGCTAT-3' (SEQ ID NO:I);反向引物 hMPV-R 的序列為:5' -GTCCATTGGCTAATCGGTTC-3 ' (SEQ ID NO:2);寡核苷酸探針 hMPV-P 的序列為:5' -TGCATTGGACTGTACTCGATGT-3' (SEQ ID NO:3)，優選的，該寡核苷酸探針5』端連接有FAM(5』羧基螢光素)，3』端連接有TAMRA(N，N，N』，N』 -四甲基-6-羧基羅丹明)。
[0014]本發明提供了一種用於檢測人偏肺病毒的寡核苷酸組合物，所述組合物包含
I)-4)中任一個:
[0015]I)寡核苷酸正向引物hMPV-F ;2)寡核苷酸反向引物hMPV-R ;3)寡核苷酸探針hMPV-P ；4) I)-3)中一個或多個序列的組合，或包含有上述序列的向5』端和/或3』端延長的序列；或與上述序列同源性大於85%的序列；或上述序列的鹼基互補序列；或使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。本發明還提供了上述寡核苷酸組合物在製備檢測人偏肺病毒的試劑中的應用，其中所述試劑為用於實時螢光PCR的試劑。
[0016]本發明的目的之一是提供一種人偏肺病毒的實時螢光PCR檢測試劑盒，該試劑盒包含I)?4)中任一個:I)能與人偏肺病毒雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈特異性結合的寡核苷酸正向引物hMPV-F ；2)能與人偏肺病毒雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈特異性結合的寡核苷酸反向引物hMPV-R ；3)能與人偏肺病毒靶多核苷酸特異性結合併且兩末端分別結合有螢光報告集團和螢光猝滅集團的寡核苷酸探針hMPV-P ;4) I)?3)中一個或多個序列的組合，或包含有上述序列的向5』端和/或3』端延長的序列；或與上述序列同源性大於85%的序列；或上述序列的鹼基互補序列；或使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組
入
口 ο
[0017]本發明的目的之一是提供一種人偏肺病毒的實時螢光PCR檢測試劑盒，該試劑盒包括:RNA提取液、RT-PCR擴增反應液，陰性質控品，陽性質控品，人偏肺病毒陽性標準品等。其中，所述的RT-PCR擴增反應液還包括DNA聚合酶、逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs和PCR buffer ;所述RT-PCR擴增反應液還包含有能與雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈特異性結合的寡核苷酸正向引物hMPV-F、能與雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈特異性結合的寡核苷酸反向引物hMPV-R、能與靶多核苷酸特異性結合併且兩末端分別結合有螢光報告集團和螢光猝滅集團的寡核苷酸探針hMPV-P中任意一種或一種以上的組合。
[0018]其中:所述正向引物hMPV-F 的序列為:5 ' -ATGCGCAGGACTAAAGCTAT-3 ' (SEQID NO:1);所述反向引物 hMPV-R 的序列為:5 ' -GTCCATTGGCTAATCGGTTC-3 ' (SEQ IDNO: 2 );所述寡核苷酸探針 hMPV-P 的序列為:5 ' -TGCATTGGACTGTACTCGATGT-3 ' (SEQID NO:3)，優選的，該寡核苷酸探針5』端連接有FAM(5』羧基螢光素)，3』端連接有TAMRA(N, N，N』，N』 -四甲基-6-羧基羅丹明);或包含有上述序列的向5』端和/或3』端延長的序列；或與上述序列同源性大於85%的序列；或上述序列的鹼基互補序列；或使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
[0019]本發明所提供的試劑盒還包含:(I)分別裝有RNA提取液、RT-PCR擴增反應液，陰性質控品，陽性質控品，人偏肺病毒陽性標準品的加蓋密封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔併集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。
[0020]根據本發明的一個優選實施方法是:所述的試劑盒中，正向引物濃度為
0.5-lumol/L、反向引物的濃度為0.5-lumol/L、寡核苷酸探針的濃度為0.25-0.5umol/L ；優選為:正向引物濃度為lumol/L、反向引物的濃度為lumol/L、寡核苷酸探針的濃度為
0.5umol/L。
[0021]根據本發明的一個優選實施方法是:所述的試劑盒中，Taq DNA聚合酶的濃度為1-8U/反應；優選為:Taq DNA聚合酶的濃度為5U/反應。
[0022]根據本發明的另一個優選實施方案，其中用於RT-PCR擴增反應液中Mg2+最佳濃度為2.0mmol/L、Taq DNA聚合酶最佳用量為5U/反應、RT酶最佳用量為100U/反應、RNasin最佳用量為20U/反應、高品質的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)最佳濃度為0.2mmol/L。
[0023]本發明所提供的檢測樣品中人人偏肺病毒的試劑盒可以檢測出的hMPV的最低濃度為1.0X102COpieS/mL，說明本試劑盒具有非常好的靈敏度。
[0024]根據本發明的另一個優選實施方案是,逆轉錄條件為:37°C 60min,94°C 5min ；PCR 反應條件為 94°C 5min ；94°C 10s,60°C 30s, 72°C Is 共 30 個循環。
[0025]根據本發明的另一個優選實施方案，其中陰性質控品為生理鹽水。
[0026]根據本發明的另一個優 選實施方案，其中陽性質控品為hMPV體外轉錄RNA。其中，建立hMPV體外轉錄RNA的技術路線如下:使用hMPV特異性正、反向引物定性擴增病毒核酸，擴增產物純化後克隆入PGEM-T載體中，陽性克隆經測序確定目的片段是否正確插入並確定插入方向。提取重組質粒pGEM-T-hMPV質粒進行酶切反應，割膠回收後得到其模板，用於體外轉錄。體外轉錄後消化DNA模板，進行RNA純化，得到hMPV-RNA。其中陽性質控品的濃度為 103copies/ml。
[0027]根據本發明的另一個優選實施方案，本發明試劑盒中定量參考品為104-107copies/ml hMPV體外轉錄RNA。其中體外轉錄步驟同上,體外轉錄後的RNA用紫外分光光度計測定A260進行定量，根據定量結果，用DEPC處理水將體外轉錄的hMPV RNA分別稀釋至104-107COpieS/ml作為本試劑盒中定量參考品。所有定量參考品與標本中提取中提取的RNA同時進行擴增，螢光定量PCR儀會根據定量參考品繪製出標準曲線，並依此對檢測標本中人偏肺病毒的感染量進行自動測定。
[0028]根據本發明的一個優選實施方法是:使用所述的試劑盒時，檢測樣本選自痰液、鼻咽拭子、含痰液或鼻咽拭子的抽提液或培養上清液。
[0029]本發明所提供的檢測樣品中人偏肺病毒的試劑盒是針對人偏肺病毒基因組保守基因片段設計特異引物和探針，可檢測出人偏肺病毒，但不能檢測出非人偏肺病毒病原體，如流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等，說明本試劑盒具有很好的特異性。
[0030]本發明所提供的檢測樣品中人偏肺病毒的試劑盒可以檢測痰液、鼻咽拭子等樣本中的人偏肺病毒；可為靈敏、快速、特異早期診斷人偏肺病毒感染提供可靠的實驗證據，並且能夠準確定量，所以可對療效進行有效檢測。
[0031]本發明與現有技·術相比，具有以下優點:(1)同時檢測待檢測樣本中人偏肺病毒感染量，可真實的反映出患者體內病原體類型、拷貝數的高低和複製情況，有助於判斷疾病，選擇治療方案及監測治療效果；(2)與ELISA技術相比，具有更高的靈敏性，適用於痰液、鼻咽拭子等多種樣本的檢測；(3)針對病毒特異性保守序列設計引物和探針，具有更高的特異性，避免了與其他如流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等呼吸道感染病毒的交叉反應；(4)將PCR的敏感性與探針雜交的特異性相結合，在很大程度上改變了普通PCR的缺陷，降低了反應時間，簡化了操作步驟；(5)閉管檢測不需要PCR後處理，避免了由於樣本間的交叉汙染引起的假陽性和環境汙染；實時的檢測技術可以連續的檢測PCR反應中螢光信號的變化，避免了普通PCR的「平臺期效應」，而且模板的定量不通過終產物，而是有Ct值計算，準確性和靈敏性均有很大的提高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1是hMPV病毒標準品擴增曲線；
[0033]圖2是hMPV病毒標準品濃度標準曲線；
[0034]圖3是4例hMPV陽性標本擴增曲線。
【具體實施方式】
[0035]以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次或以上重複實驗，結果取平均值。
[0036]實施例1:人偏肺病毒一步法實時螢光定量PCR試劑的研製
[0037]1、引物和探針的設計:通過對Genebank資料庫中已有的人偏肺病毒核酸序列利用DNAman軟體進行序列比對分析，以人偏肺病毒基因組開放閱讀框M2-1和M2-2連接區的保守片段為擴增靶位點，根據引物探針設計的基本原則，利用軟體人工設計多對引物和探針。
[0038]2、樣本的選擇:根據國內外相關的文獻報導表明，可以選擇痰液、鼻咽拭子等樣
品O
[0039]3、反應體系的建立與優化
[0040]樣本的準備:以病毒鑑定為人偏肺病毒陽性的10份樣品作為hMPV陽性參考品，分別為 hMPV-1、hMPV-2、hMPV-3、hMPV-4、hMPV-5、hMPV-6、hMPV-7、hMPV-8、hMPV-9、hMPV-10 ；以病毒鑑定為陰性的10份非hMPV樣本為陰性參考品，分別為3種病毒樣品(流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒)以及7份正常的痰液、鼻咽拭子樣品。分別提取上述陽性參考品和陰性參考品的RNA，待用。
[0041]引物探針的篩選:用上述I中設計的多組引物和針分別檢測上述的陽性參考品與陰性參考品的RNA，經反覆多次試驗，篩選出特異性好、靈敏度高和重複性好的最佳引物探針組合。
[0042]引物探針濃度的優化:在反應體系中其他反應組分不變的條件下，分別使用
0.5umol/L至lumol/L的濃度梯度的引物和0.25umol/L至0.5umol/L的濃度梯度的探針進行PCR反應，經反覆多次重複試驗，最終確定最佳的引物濃度為lumol/L、探針濃度為
0.5umol/L。
[0043]Taq DNA聚合酶用量的優化:在反應體系中其他反應組分不變的情況下，分別使用從IU (酶單位)至8U濃度梯度的酶用量/反應，進行RT-PCR反應，經多次重複試驗，最終確定最佳的Taq酶用量為5U/反應。
[0044]RT酶用量的優化:在反應體系中其他反應組分不變的情況下，分別使用從50U(酶單位)至400U濃度梯度的酶用量/反應，進行RT-PCR反應，經多次重複試驗，最終確定最佳的RT酶用量為100U/反應。
[0045]RNasin用量的優化:在反應體系中其他反應組分不變的情況下，分別使用從5U (酶單位)至40U濃度梯度的酶用量/反應，進行RT-PCR反應，經多次重複試驗，最終確定最佳的RNasin用量為20U/反應。
[0046]dNTPs度的優化:在反應體系中其他反應組分不變的情況下，分別使用從0.lmmol/L至0.25mmol/L濃度梯度的dNTPs用量/反應，進行RT-PCR反應，經多次重複試驗，最終確定最佳的dNTPs濃度為0.2mmol/Lo
[0047]反應溫度、時間的優化:根據酶的活性和寡多核苷酸的長度，主要對退火溫度和延伸時間進行了優化，經多次重複試驗，最終確定最佳的反應溫度和時間為:37°C 60min,94°C 5min ;PCR 反應條件為 94°C 5min ；94°C 10s,60°C 30s, 72°C Is 共 30 個循環。
[0048]4.標本檢測:以痰液、鼻咽拭子等為作為待檢標本，分別提取標本的RNA後，經上述優化建立的核酸擴增體系檢測，結果表明:本發明試劑盒可以靈敏的檢測出臨床標本中的人偏肺病毒(hMPV)。
[0049]實施例2:人偏肺病毒一步法螢光實時定量RT-PCR檢測試劑盒及其使用
`[0050]1、製備包括下列組分成分的試劑盒:RNA提取液、RT-PCR擴增反應液、陰性質控品、陽性質控品、定量參考品、DEPC處理水。[0051]2.標本的採集、運輸及保存
[0052]2.1適用標本類型:痰液、鼻咽拭子等。
[0053]2.2標本採集與前處理(注意無菌操作)
[0054]2.2.1痰液標本採集:以晨痰為佳，採集標本前應用清水、冷開水漱口或用牙刷(不用牙膏)清潔口腔和牙齒，有假牙者應取下假牙(為減少口腔正常菌群汙染標本)，用力咳出呼吸道深部的痰(非後鼻部分泌物、非唾液)，痰液直接吐入無菌痰杯中，標本量應> Iml0對於痰量少或無痰或咳痰困難者可用霧化吸入加溫至45°C的10%NaCl水溶液(痰液粘稠難咳，阻塞氣道的，需要用α-糜蛋白酶鹽水溶液)，使痰液易於排出後咳痰。
[0055]2.2.2鼻咽拭子標本採集:咽拭子:將咽拭子在採樣液中充分浸潤，向上提起離開液面，在管壁上反覆擠壓幾下；讓病人頭部微仰，嘴張大，並發「啊」音，露出兩側咽扁桃體，手持拭子在病人兩側咽扁桃體稍微用力來回擦拭至少3次，然後再在咽後壁上下擦拭至少3次；將拭子頭浸入採樣液中，把拭子頭部與管壁接觸幾下，使標本儘量多的保存在採樣液中，棄去拭子手捏尾部部分。
[0056]將咽拭子在採樣液中充分浸潤，向上提起離開液面，在管壁上反覆擠壓幾下；讓病人頭部自然放鬆，將拭子貼鼻孔壁慢慢轉動進入病人一鼻孔內，至鼻顎處，然後邊擦拭邊旋轉慢慢取出。以同一拭子，用同樣的方法擦拭另一鼻孔；將鼻拭子放入已收集咽拭子的採樣管中，方法同步驟上，這樣，一支採樣管中就有一支咽拭子、一支鼻拭子，即所謂的鼻咽拭子管。
[0057]2.3標本運輸與保存:採集或處理的樣本在4°C條件下保存應不超過48h ;若需長期保存，須放置_80°C低溫冰箱，但應避免反覆凍融(最多凍融3次)。採集的樣本密封后，採用保溫箱加冰密封，並儘快運送到實驗室。
.[0058]3檢測步驟
[0059]( I) RNA 提取
[0060]A.取N個(N=I管陰性質控品+待測樣本數)滅菌的1.5ml離心管，並作好標記。
[0061]B.每個離心管加入600ulTrizol試劑，然後分別加入200ul待測樣品上清液或陰性質控品，充分震蕩混勻15s，室溫靜置3?5min ；
[0062]C.每個離心管加入200ul氯仿,上下震蕩混勻10s, 12, OOOrpm離心5min ；
[0063]D.小心吸取無色上層液體，轉移至新滅菌的1.5ml離心管，然後加入IOuIRNA提取液，充分吸打混勻，8，OOOrpm離心I分鐘，然後小心棄去所有液體；
[0064]E.加入溶液C (確認已經加入無水乙醇)800ul，充分吸打混勻，8，000rpm離心Imin,儘可能將液體去除乾淨；
[0065]F.將離心管的蓋子打開並放入通風櫥中風乾15min，也可使用加熱器於60°C乾燥5min,(主要去除無水乙醇)，然後加入30ulDEPC處理水，吸打混勻管中沉澱，得到液體，可直接用於檢測，也可存於-80°C備用。
[0066](2) RT-PCR反應與結果分析、判定
[0067]分別取陰性質控品、陽性質控品、定量參考品、待測標本各3ul，加入PCR反應管中進行RT-PCR擴增反應。RT-PCR擴增反應的條件為:37°C逆轉錄60min ；94°C 5min ；PCR反應條件為 94°C 5min ;94°C 10s,60°C 30s,72°C Is 共 30 個循環。
[0068]結果分析:據定量參考品的擴增曲線設置Baseline的Start值、Stop值以及Threshold的Value值，使Std curve窗口下的標準曲線圖達到最佳，即correlation數值介於-1.0?-0.97。最後在Analysis菜單中選擇Analyze自動分析結果。
[0069]結果判定:陽性樣本擴增曲線呈S型，所有陰性樣本無擴增曲線出現，待測標本的hMPV檢測結果有效，否則，結果為無效，需要重新檢測，並根據標準品進行陽性樣本定量檢測，結果如圖1/2。
[0070]實施例3:人偏肺病毒一步法螢光實時定量RT-PCR檢測試劑盒臨床檢測使用
[0071]用上述方法對另外疑似人偏肺病毒感染病人痰液標本18份進行檢測，其中hMPV檢測結果陽性4例，病毒螢光定量PCR擴增曲線見圖3，根據這4例陽性結果的Ct值結合擴增曲線，由Roche LightCycler480分析軟體自動分析得到這4例hMPV陽性標本的病毒濃度，具體結果見表I。
[0072]表I 4例hMPV陽性標本病毒濃度
【權利要求】
1.一種人偏肺病毒的RT-PCR檢測試劑盒，該試劑盒包括:RNA提取試劑，RT-PCR擴增反應液，陰性質控品，陽性質控品，人偏肺病毒陽性標準品。
2.權利要求1所述的試劑盒，其中，所述的RT-PCR擴增反應液包含有能與雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈特異性結合的正向弓I物hMPV-F、能與雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈特異性結合的反向引物hMPV-R、能與靶多核苷酸特異性結合併且兩末端分別結合有螢光報告集團和螢光猝滅集團的寡核苷酸探針hMPV-P中任意一種或一種以上的組合。
3.權利要求2所述的試劑盒，其中: 所述正向引物 hMPV-F 的序列為:5' -ATGCGCAGGACTAAAGCTAT-3'； 所述反向引物 hMPV-R 的序列為:5' -GTCCATTGGCTAATCGGTTC-3'； 所述寡核苷酸探針hMPV-P的序列為:5' -TGCATTGGACTGTACTCGATGT-3'； 或包含有上述序列的向5』端和/或3』端延長的序列；或與上述序列同源性大於85%的序列；或上述序列的鹼基互補序列；或使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組口 ο
4.權利要求1-3任一所述的試劑盒，其中，所述的RT-PCR擴增反應液還包括DNA聚合酶、逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs和PCR buffer ;其中，DNA聚合酶為Taq DNA聚合酶，其最佳濃度為5U/反應；逆轉錄酶的最佳濃度為IOOU/反應；RNA酶抑制劑的最佳濃度為20U/反應，dNTPs的最佳濃度為0.2mmol/L/反應。
5.根據權利要求2-4任一所述的試劑盒，其中，正向引物和反向引物的最佳濃度為lumol/L,寡核苷酸探針的最佳濃度為0.5umol/Lo
6.根據權利要求1-9任一所述的試劑盒，其中，所述試劑盒的最佳反應條件為:37°C60min，94°C 5min ;PCR 反應條件為 94°C 5min ；94°C 10s, 60°C 30s, 72°C ls，共 30 個循環。
7.根據權利要求1-6任一所述的試劑盒，其特徵還在於:檢測樣本選自痰液、鼻咽拭子、含痰液或鼻咽拭子的抽提液或培養上清液。
8.一種用於檢測人偏肺病毒的寡核苷酸組合物，所述組合物包含1)-4)中任一個: 1)正向引物hMPV-F，其序列為:5' -ATGCGCAGGACTAAAGCTAT-3'； 2)反向引物hMPV-R，其序列為:5' -GTCCATTGGCTAATCGGTTC-3'； 3)寡核苷酸探針hMPV-P，其序列為:5' -TGCATTGGACTGTACTCGATGT-3'； 4)I)-3)中一個或多個序列的組合，或包含有上述序列的向5』端和/或3』端延長的序列；或與上述序列同源性大於85%的序列；或上述序列的鹼基互補序列；或使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
9.權利要求8所述的寡核苷酸組合物在製備檢測人偏肺病毒的試劑中的應用。
10.權利要求9所述的應用，其中所述試劑為用於RT-PCR的試劑。
【文檔編號】C12Q1/68GK103436639SQ201310393831
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月2日 優先權日:2013年9月2日
【發明者】石康, 江城名, 朱世新 申請人:湖北朗德醫療科技有限公司