血漿microRNAs用於製備篩查診斷男性群體中肺腺癌患者的診斷試劑的用途的製作方法
2023-09-15 19:34:30 1
本發明屬於臨床診斷領域，涉及肺腺癌篩查診斷試劑，具體涉及血漿microRNAs用於製備篩查診斷肺腺癌患者的診斷試劑的用途。
背景技術：
肺癌是全球最常見的惡性腫瘤，死亡率居惡性腫瘤之首。我國肺癌發病率呈現逐年上升趨勢，年平均增長近2％。肺癌根據病理學特點的不同分為多種組織類型，肺癌組織類型不同，其治療措施也不同。根據2004版WHO分類，常見肺癌組織病理學分型分為非小細胞癌(NSCLC)和小細胞癌(SCLC)。非小細胞癌又分為鱗狀細胞癌(SCC)、腺癌(AC)和大細胞癌(LCC)。不同肺癌臨床治療方案不同，預後效果也不同。因此，為了提高治療效果，肺癌的治療策略已經從傳統的以分期為基礎的治療模式轉變為以組織學類型和基因突變為指導的個體化、精準的多學科治療模式。個體化治療提高了肺癌的治療和預後效果。
腺癌作為最常見的肺癌組織學類型，在全球及我國發病率均呈上升趨勢。流行病學研究結果顯示，非小細胞肺癌的發病有明顯的性別差異，尤其是腺癌。腺癌佔原發肺癌的50％，是非吸菸患者的主要組織學類型。目前在肺癌研究最深入、臨床應用最多的是針對表皮生長因子受體EGFR的小分子酪氨酸激酶抑制劑，而易瑞沙、吉非替尼和厄洛替尼是其主要的代表。隨著對這類小分子靶向治療藥物研究的深入，逐漸發現其療效與肺癌患者的臨床特徵相關，其中亞裔、女性、腺癌、不吸菸是其臨床「優勢人群」的主要特徵(楊新傑等，鹽酸埃克替尼一線治療晚期肺腺癌的臨床療效觀察，中國肺癌雜誌2013年7月；馬智勇等，易瑞沙治療男性、不吸菸或輕度吸菸的晚期肺腺癌患者療效研究，醫藥論壇雜誌2010年11月)。
這些結果讓研究者得出一個推測：腺癌在男性和女性中的發病率、發病機制和臨床治療效果均存在差異。為了適應個性化治療，腺癌的研究有必要分性別開展。
復旦大學附屬中山醫院黃威博士在畢業論文「三種病理亞型肺癌組織中腫瘤標記物的發現、驗證及其靶基因的初步篩選」中詳細研究了用於肺癌診斷的microRNAs標記物。首先，作者應用雷射捕獲顯微切割技術從44例正常肺組織、36例腺癌、30例鱗癌及16例小細胞癌中獲取純的上皮細胞和腫瘤細胞，進行全基因組microRNAs表達分析，經過方差分析和聚類分析發現16個差異表達的microRNAs可以區分三種肺癌病理亞型(肺腺癌、肺鱗癌和小細胞肺癌)，並最終確定其中的7個作為候選標記物進行進一步驗證；然後，作者在三種病理亞型肺癌組織中驗證7個候選microRNAs腫瘤標記物，建立診斷肺癌病理亞型的回歸模型，並且分析7個候選microRNAs的預後價值，結果發現：單個候選microRNA鑑別正常肺組織與肺腺癌的AUC值不理想，經過Logistic回歸分析建立模型發現hsa-miR-375和hsa-miR-34a兩個相互配合可以得到最佳AUC 0.910，敏感性80％，特異性97％，敏感度較低。也就是說，經過作者的研究，無論是單個microRNA還是多個microRNAs的聯合均不能有效診斷區分正常肺組織與肺腺癌，準確度和敏感度不盡如人意。而且，該方法是一種基於組織中標誌物的方法，需要取患者的肺組織用於檢測，依然是一種介入診斷方法，不方便。
申請人認為，上述博士論文未能篩選出有效診斷區分正常肺組織與肺腺癌的microRNAs的關鍵原因在於忽視了肺腺癌的性別差異，樣本分類錯誤，自然無法得出理想結果。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供血漿microRNAs用於製備篩查診斷肺腺癌患者的診斷試劑的用途；具體地，為提高篩查的準確度、敏感度和特異性，根據性別差異，提供一組血漿microRNAs標記物用於製備篩查診斷男性群體中肺腺癌患者的診斷試劑，提供另外一組血漿microRNAs標記物用於製備篩查診斷女性群體中肺腺癌患者的診斷試劑。
上述目的是通過如下技術方案實現的：
篩查診斷男性群體中肺腺癌患者的技術方案如下：
一組用於篩查診斷男性群體中肺腺癌患者的血漿microRNAs標記物，由如下microRNAs組成：miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601；miR-224-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；miR-146a-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；miR-564的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；miR-615-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；miR-601的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
一組篩查診斷男性群體中肺腺癌患者的microRNAs引物、探針的組合，microRNAs引物包括反轉錄引物、定量PCR前引物和定量PCR後引物：miR-224-3p的反轉錄引物序列如SEQ ID NO.9所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.17所示，定量PCR後引物序列如SEQ ID NO.25所示；miR-146a-5p的反轉錄引物序列如SEQ ID NO.10所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.18所示，定量PCR後引物序列如SEQ ID NO.25所示；miR-564的反轉錄引物序列如SEQ ID NO.11所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.19所示，定量PCR後引物序列如SEQ ID NO.25所示；miR-615-5p的反轉錄引物序列如SEQ ID NO.12所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.20所示，定量PCR後引物序列如SEQ ID NO.25所示；miR-601的反轉錄引物序列如SEQ ID NO.13所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.21所示，定量PCR後引物序列如SEQ ID NO.25所示；各microRNAs探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。
一種用於篩查診斷男性群體中肺腺癌患者的診斷試劑，含有上述microRNAs引物、探針的組合。
一種用於篩查診斷男性群體中肺腺癌患者的診斷試劑盒，含有上述microRNAs引物、探針的組合。
進一步地，所述的診斷試劑盒還含有PCR反應常用的酶和試劑，如逆轉錄酶、緩衝液、dNTPs、MgCl2、DEPC水和Taq酶等，以及標準品和/或對照品。
篩查診斷女性群體中肺腺癌患者的技術方案如下：
一組用於篩查診斷女性群體中肺腺癌患者的血漿microRNAs標記物，由如下microRNAs組成：miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-648、miR-523-5p、miR-758-5p；miR-224-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；miR-146a-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；miR-648的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；miR-523-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；miR-758-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
一組篩查診斷女性群體中肺腺癌患者的microRNAs引物、探針的組合，microRNAs引物包括反轉錄引物、定量PCR前引物和定量PCR後引物：miR-224-3p的反轉錄引物序列如SEQ ID NO.9所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.17所示，定量PCR後引物序列如SEQ ID NO.25所示；miR-146a-5p的反轉錄引物序列如SEQ ID NO.10所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.18所示，定量PCR後引物序列如SEQ ID NO.25所示；miR-648的反轉錄引物序列如SEQ ID NO.14所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.22所示，定量PCR後引物序列如SEQ ID NO.25所示；miR-523-5p的反轉錄引物序列如SEQ ID NO.15所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.23所示，定量PCR後引物序列如SEQ ID NO.25所示；miR-758-5p的反轉錄引物序列如SEQ ID NO.16所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.24所示，定量PCR後引物序列如SEQ ID NO.25所示；各microRNAs探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。
一種用於篩查診斷女性群體中肺腺癌患者的診斷試劑，含有上述microRNAs引物、探針的組合。
一種用於篩查診斷女性群體中肺腺癌患者的診斷試劑盒，含有上述microRNAs引物、探針的組合。
進一步地，所述的診斷試劑盒還含有PCR反應常用的酶和試劑，如逆轉錄酶、緩衝液、dNTPs、MgCl2、DEPC水和Taq酶等，以及標準品和/或對照品。
本發明的有益效果：
本發明提供的一組血漿microRNAs標記物可以準確用於篩查診斷男性群體中肺腺癌患者，靈敏度高，特異性強，實現男性群體中肺腺癌患者的無介入診斷；本發明提供的另一組血漿microRNAs標記物可以準確用於篩查診斷女性群體中肺腺癌患者，靈敏度高，特異性強，實現女性群體中肺腺癌患者的無介入診斷。
附圖說明
圖1為5個microRNAs(miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601)聯合診斷區分男性病例組和男性健康對照組的ROC曲線圖；
圖2為5個microRNAs(miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-648、miR-523-5p、miR-758-5p)聯合診斷區分女性病例組和女性健康對照組的ROC曲線圖；
圖3為驗證集中用5個microRNAs(miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601)聯合診斷區分男性病例組和男性健康對照組的準確性圖；
圖4為驗證集中用5個microRNAs(miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-648、miR-523-5p、miR-758-5p)聯合診斷區分女性病例組和女性健康對照組的準確性圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例和附圖詳細介紹本發明的技術方案和技術效果。
肺腺癌患者和健康志願者自2014年9月至2015年9月期間於南京軍區南京總醫院和南京鼓樓醫院收集，取血經患者同意並通過南京軍區南京總醫院和南京鼓樓醫院倫理委員會審批。男性病例組由96名原發性肺腺癌男性患者組成，女性病例組由82名原發性肺腺癌女性患者組成，取血之前均未進行手術、化療、放療或內分泌治療。男性健康對照組和女性健康對照組分別由58例男性健康志願者和54例女性健康志願者組成。樣本年齡均在25-60歲之間，男性病例組與男性健康對照組以及女性病例組與女性健康對照組之間年齡均無統計學差異(P值分別為0.072和0.068)。所有患者和健康志願者均經過組織病理確證。將男性病例組、女性病例組、男性健康對照組、女性健康對照組隨機對半分成測試集和驗證集。測試集用於血漿差異microRNAs的發現，並初步用於評價差異microRNAs作為標記物篩查男性群體中肺腺癌患者和篩查女性群體中肺腺癌患者的診斷效能；驗證集用於進一步驗證microRNAs標記物的診斷準確性。樣本分組情況如下表：
實施例1：基於microRNA晶片的血漿差異microRNA發現及定量確證
一、實驗材料
1、儀器試劑
高速離心機、高速冷凍離心機、紫外分光光度計購自德國Eppendorf公司；NanoDrop 1000分光光度計購自美國賽默飛世爾Thermo Scientific公司；Agilent 2100Bioanalyzer System購自美國Agilent公司；普通PCR反應儀和實時螢光PCR儀購自美國PE公司；DYCP-31B型電泳儀購自北京六一生物科技有限公司；BIO-RAD凝膠成像分析購自美國伯樂；超低溫冰箱購自海爾集團。mirvanaTMparisTMkit購自美國Ambion公司；Agilent RNA 6000Pico Kit購自美國Agilent公司；Trizol總RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司；TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan Universal PCR Master Mix、cDNA合成試劑盒購自美國賽默飛世爾Thermo Scientific公司；引物、探針委託生工生物工程(上海)股份有限公司合成。未特別強調的儀器和試劑均為本領域技術人員常規使用的儀器和試劑，且易於獲得。
2、實驗樣品
早晨空腹抽取測試集肺腺癌患者和健康志願者外周血2mL，放入EDTA管內，輕輕混勻，使血與管內抗凝物質充分接觸，防止血細胞破裂。將EDTA管放入4℃冰箱，在2小時內分離血漿。首先，820g轉速離心10分鐘，將上層液相小心吸出，避免吸取中間白色細胞層。將上層液相轉入事先預冷的1.5mL離心管，16000g轉速繼續離心10分鐘，以便進一步分離血漿和血細胞。將第二步離心以後得到的血漿，以500μL體積分裝，轉入-80℃冰箱長期保存。
其他材料包括常規試劑、常規儀器等均為本領域技術人員熟知並易於獲取的材料。相關試劑的配製按照產品說明書操作，或者按本領域技術人員熟知的常規方法配製即可。
二、實驗方法
1、血漿總RNA的提取
mirvanaTMparisTMkit用於抽提血漿總RNA，NanoDrop 1000分光光度計測定總RNA濃度。對RNA質量的評價通過Agilent RNA 6000Pico Kit由Agilent 2100Bioanalyzer System來完成。方法均參照各自說明書。用RNA完整指數(RIN)衡量總RNA的質量，該值從1到10分別反應樣本的質量。RIN≥7-10表示質量好，RIN≥5表示質量中等，RIN＜5表示質量差。本實驗中，以RIN＞5作為抽提總RNA合格的標準。
2、全基因組microRNA分析
microRNA晶片檢測以及結果分析由上海生物晶片有限公司完成。microRNA晶片包含723個人microRNAs和76個人病毒microRNAs探針，microRNA數據來自Sanger v.10.1資料庫。每一張晶片包含八個上樣位點。總RNA(100ng)通過Cy3標記，晶片通過XDR Scan(PMT100，PMT5)掃描晶片上的信號。標記和雜交過程按照Agilent microRNA晶片系統說明書操作。晶片圖像信息通過軟體轉換為強度值，消除背景嘈雜信號以後，信號強度值直接輸入到軟體進行分析。在對樣本的檢測過程中，發現hsa-miR-1228在血漿中穩定表達，故選用hsa-miR-1228作為內參，將雜交得到的原始信號進行標準化，得到以2為底數的log值。如果一個樣本在晶片上重複檢測的數值，其變異係數大於15％或者陽性信號值不到5％，認為該樣本質量不合格，在下一步試驗中將被排除。可以檢測到的microRNA定義為在超過50％的樣本中，晶片都能檢測到陽性信號。
3、實時螢光定量PCR
具體參照試劑盒TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan MicroRNA Assay、TaqMan Universal PCR Master Mix的說明書，每個樣品上樣量為100ng，反應步驟如下：
100ng RNA標本加入每個RT反應試管中，Nuclease-free water補足體積；加入各反應成分後稍作離心混勻，在PCR反應儀執行如下程序：
16℃30min→42℃30min→85℃5min→4℃保存。
參照TaqMan MicroRNA Assay說明書在實時螢光定量PCR儀上進行，體系和條件如下：
加入各反應成分並充分混勻後稍作離心，每個孔10μL，每個樣本做三個復孔。在螢光定量PCR儀上執行如下程序：
總共40個循環。60℃時進行螢光數據採集，吸收波長為490nm，釋放波長為530nm。Cp值由SDS軟體經過二次衍生法計算得到。
4、數據統計分析
以晶片檢測結果中最穩定的hsa-miR-1228作為內參對照，利用Agilent Feature Extraction軟體進行數據定量分析。晶片的圖像信息通過Scanner Control Rev.7.0軟體轉換為密度值。信號經背景消除後直接導入GeneSpring GX10軟體進行標準化。以重複試驗獲得的平均標準化數據比較研究分析。Benjamini-Hochberg校對的非配對t檢驗(p≤0.01)。利用hierarchical clustering algorithm軟體進行聚類分析，篩選出男性肺腺癌與男性健康對照、女性肺腺癌與女性健康對照中具有顯著性差異的血漿microRNAs。
實時螢光PCR數據採用與晶片相同的內參標準化，非配對t檢驗確定組間差異。p＜0.05設為統計學差異。F檢驗和T檢驗分析通過螢光實時定量PCR檢測得到的microRNAs表達值之間的顯著性差異，通過SPSS軟體分析實現，p＜0.05認為有統計學意義，均為雙側。
未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如教科書和實驗指南中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件，為本領域普通技術人員熟知或易於獲知。
三、實驗結果
microRNA晶片檢測結果發現，與男性健康對照組相比，男性病例組出現大量上調或下調表達的microRNAs，部分microRNAs差異表達非常明顯；與女性健康對照組相比，女性病例組出現大量上調或下調表達的microRNAs，部分microRNAs差異表達非常明顯。
由於microRNA晶片對microRNA表達特徵的研究是間接的，在分析過程中仍存在特異性和敏感度不高等缺點。因此，所得結果有一定的假陽性，需要輔助其他更為準確的表達研究方法加以驗證，本實驗利用螢光實時定量RT-PCR來進行鑑定。
結果有13個血漿差異microRNA得到螢光實時定量RT-PCR的確認，表達水平如下：
上表中，斜線代表變換變化不明顯。得到上述血漿差異microRNA後，進行下一步實驗，採用受試者工作特徵曲線(ROC曲線)評價單個血漿差異microRNA及其聯合用於診斷區分男性肺腺癌與男性健康對照、女性肺腺癌與女性健康對照的診斷效能。其中，由於miR-205、miR-206和miR-155-5p的p值大於0.05，不列入下一步實驗考察。
實施例2：ROC曲線評價血漿差異microRNA的診斷效能
ROC曲線評價法的原理：
診斷試驗的基本評價指標有敏感度、特異性等，綜合評價指標有Youden指數、ROC、AUC等。對於診斷試驗的評價，首先應該知道受試者的真實類別，即哪些屬於健康組，哪些屬於疾病組。劃分健康組和疾病組的標準就是金標準(如本申請中公認的組織病理診斷法)。對於按金標準確定的疾病組和健康組，採用診斷試驗檢測的結果可以分為如下情況：
陽性(True Positive,TP)；診斷試驗檢測為陽性(與金標準結果一致)；
陰性(True Negative,TN)；診斷試驗檢測為陰性(與金標準結果一致)；
假陽性(False Positive,FP)：診斷試驗檢測為陽性(與金標準結果不一致)；
假陰性(False Negative,FN)：診斷試驗檢測為陰性(與金標準結果不一致)。
可以用下表表示：
診斷試驗的敏感度＝A/(A+C)；診斷試驗的特異性＝D/(B+D)。通過敏感度和特異性可以得出診斷試驗相對於金標準的診斷靈敏程度和特異程度。敏感度高代表將疾病例診斷為陰性的個數少，漏診率低；特異性高代表將健康例診斷為陽性的個數少，誤診率低。
ROC曲線正是基於上述敏感度和特異性繪製出的曲線。以診斷試驗中可能的診斷界值作為診斷點，根據上述表格計算出相應的敏感度和特異性。然後，以敏感度為縱坐標，1-特異性為橫坐標，將各診斷點時各點的敏感度和特異性點在坐標圖中標出，連接坐標點得到平滑曲線，該曲線即為ROC曲線。診斷點設置的越多越密，得到的ROC曲線就越平滑。
ROC曲線是以每一個檢測結果作為可能的診斷界值，其曲線下面積AUC的大小表明了診斷試驗準確度的大小。ROC曲線下面積AUC(ROCAUC)作為診斷試驗真實性評價的固有準確度指標已被普遍認可，完全無價值的診斷試驗AUC為0.5，理想的診斷試驗AUC為1，而一般認為對於一個診斷試驗，ROC AUC在0.5～0.7之間時診斷價值較低，在0.7～0.9之間時診斷價值中等，在0.9以上時診斷價值較高。
1、單個血漿差異microRNA用於診斷區分疾病組和對照組時，ROC曲線的繪製方法
將測試集所有樣本中上述13個血漿差異microRNA的含量經內參標準化後，得到標準化值，以各可能的標準化值作為診斷點，按照上述方法繪製ROC曲線。
13個血漿差異microRNA單獨診斷區分男性病例組VS.男性健康對照組、女性病例組VS.女性健康對照組的ROC曲線下面積AUC及最佳cut-off值處敏感度和特異性如下表所示：
上述結果表明，通過microRNA晶片並經實時螢光定量RT-PCR確證的10個血漿差異microRNAs單獨用於診斷區分男性肺腺癌和男性健康對照或女性肺腺癌和女性健康對照的診斷效能較低，AUC在0.5～0.7之間，診斷價值較低。
2、多個血漿差異microRNAs聯合用於診斷區分疾病組和對照組時ROC曲線繪製方法
將測試集所有樣本中上述7個(男性和女性各有7個)血漿差異microRNA的含量經內參標準化後，得到標準化值，將男性肺腺癌樣本作為組別1，男性健康志願者樣本作為組別2(或女性肺腺癌樣本作為組別1，女性健康志願者樣本作為組別2)，對上述7個血漿差異microRNAs中任意多個血漿差異microRNAs在兩組樣本中的標準化值進行二元邏輯回歸，得到二元邏輯回歸方程。然後，將各樣本中該任意多個血漿差異microRNAs的標準化值代入該二元邏輯回歸方程，即可得到各個樣本的回歸值，以可能的回歸值作為診斷點，按照上述方法繪製ROC曲線。該ROC曲線即為該任意多個血漿差異microRNAs聯合診斷時的診斷曲線，曲線下面積AUC及最佳cut-off值處敏感度和特異性可體現該任意多個血漿差異microRNAs的聯合診斷效能。
結果表明：miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601這5個血漿差異microRNAs聯合用於診斷區分男性病例組VS.男性健康對照組時的診斷效能最高，且最佳cut-off值處敏感度和特異性高；miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-648、miR-523-5p、miR-758-5p這5個血漿差異microRNAs聯合用於診斷區分女性病例組VS.女性健康對照組時的診斷效能最高，且最佳cut-off值處敏感度和特異性高。結果如下表和圖1和圖2：
申請人進一步評價了診斷區分男性病例組和男性健康對照組的5個聯合差異microRNAs對女性病例組和女性健康對照組的診斷效能，ROC曲線下面積AUC僅為0.586；申請人還進一步評價了診斷區分女性病例組和女性健康對照組的5個聯合差異microRNAs對男性病例組和男性健康對照組的診斷效能，ROC曲線下面積AUC僅為0.614。該結果也進一步證明，肺腺癌具有明顯的性別差異，這可能與不同性別肺腺癌的發病機理不同有關，體內代謝網絡也存在明顯差異，在進行診斷時應該區別對待，不同性別採用不同診斷指標才能獲得高準確率。
實施例3：在驗證集中進一步驗證血漿差異microRNAs聯合診斷的準確性
一、實驗材料
同實施例1。
二、實驗方法和結果
1、血漿總RNA的提取和實時螢光定量PCR的方法同實施例1。
2、在驗證集中，基於上述二元邏輯回歸方程將驗證集男性肺腺癌和男性健康志願者樣本中的5個血漿差異microRNAs(miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601)含量的標準化值作二元邏輯回歸變換，計算出男性樣本中的該5個血漿差異microRNAs含量的邏輯回歸值。低於最佳cut-off值0.568的預測為男性健康志願者，高於最佳cut-off值0.568的預測為男性肺腺癌，最後計算出以該5個代謝標誌物水平預測男性肺腺癌和男性健康志願者分組的準確率。結果如圖3，基於5個血漿差異microRNAs(miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601)驗證集樣本中的預測準確率為98.7％，僅將1例男性健康志願者誤診為肺腺癌患者，準確率非常高。
3、在驗證集中，基於上述二元邏輯回歸方程將驗證集女性肺腺癌和女性健康志願者樣本中的5個血漿差異microRNAs(miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-648、miR-523-5p、miR-758-5p)含量的標準化值作二元邏輯回歸變換，計算出女性樣本中的該5個血漿差異microRNAs含量的邏輯回歸值。低於最佳cut-off值0.604的預測為女性健康志願者，高於最佳cut-off值0.604的預測為女性肺腺癌，最後計算出以該5個代謝標誌物水平預測女性肺腺癌和女性健康志願者分組的準確率。結果如圖4，基於5個血漿差異microRNAs(miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-648、miR-523-5p、miR-758-5p)驗證集樣本中的預測準確率為98.5％，僅將1例女性健康志願者誤診為肺腺癌患者，準確率非常高。
實施例4：診斷試劑和診斷試劑盒的製備
上述實施例表明，miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601聯合診斷區分男性肺腺癌和男性健康志願者的準確度高，敏感度和特異性強，可基於miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601製作用於篩查診斷男性群體中肺腺癌患者的診斷試劑或診斷試劑盒。該診斷試劑或診斷試劑盒中包括miR-224-3p引物、探針；miR-146a-5p引物、探針；miR-564引物、探針；miR-615-5p引物、探針；miR-601引物、探針。引物具體包括反轉錄引物、定量PCR前引物和定量PCR後引物。當然，診斷試劑盒還含有PCR反應常用的酶和試劑，如逆轉錄酶、緩衝液、dNTPs、MgCl2、DEPC水和Taq酶等，以及標準品和/或對照品。引物和探針的設計是本領域常規技術手段，下表為引物和探針的一種設計，也可以設計成其他序列。
上述實施例表明，miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-648、miR-523-5p、miR-758-5p聯合診斷區分女性肺腺癌和女性健康志願者的準確度高，敏感度和特異性強，可基於miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-648、miR-523-5p、miR-758-5p製作用於篩查診斷女性群體中肺腺癌患者的診斷試劑或診斷試劑盒。該診斷試劑或診斷試劑盒中包括miR-224-3p引物、探針；miR-146a-5p引物、探針；miR-648引物、探針；miR-523-5p引物、探針；miR-758-5p引物、探針。引物具體包括反轉錄引物、定量PCR前引物和定量PCR後引物。當然，診斷試劑盒還含有PCR反應常用的酶和試劑，如逆轉錄酶、緩衝液、dNTPs、MgCl2、DEPC水和Taq酶等，以及標準品和/或對照品。引物和探針的設計是本領域常規技術手段，下表為引物和探針的一種設計，也可以設計成其他序列。
本發明提供的一組血漿microRNAs標記物可以準確用於篩查診斷男性群體中肺腺癌患者，靈敏度高，特異性強，實現男性群體中肺腺癌患者的無介入診斷；本發明提供的另一組血漿microRNAs標記物可以準確用於篩查診斷女性群體中肺腺癌患者，靈敏度高，特異性強，實現女性群體中肺腺癌患者的無介入診斷。
SEQUENCE LISTING
南京九壽堂醫藥科技有限公司
血漿microRNAs用於製備篩查診斷男性群體中肺腺癌患者的診斷試劑的用途
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PatentIn version 3.3
1
23
DNA
智人
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aaaauggugc ccuagugacu aca 23
2
22
DNA
智人
2
ugagaacuga auuccauggg uu 22
3
19
DNA
智人
3
aggcacggug ucagcaggc 19
4
22
DNA
智人
4
gggggucccc ggugcucgga uc 22
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DNA
智人
5
uggucuagga uuguuggagg ag 22
6
19
DNA
智人
6
aagugugcag ggcacuggu 19
7
22
DNA
智人
7
cucuagaggg aagcgcuuuc ug 22
8
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DNA
智人
8
gaugguugac cagagagcac ac 22
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56
DNA
人工序列
9
gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgactg tagtca 56
10
56
DNA
人工序列
10
gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacaa cccatg 56
11
56
DNA
人工序列
11
gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacgc ctgctg 56
12
56
DNA
人工序列
12
gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacga tccgag 56
13
56
DNA
人工序列
13
gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacct cctcca 56
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56
DNA
人工序列
14
gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacac cagtgc 56
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人工序列
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gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacca gaaagc 56
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DNA
人工序列
16
gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacgt gtgctc 56
17
31
DNA
人工序列
17
acactccagc tgggaaaatg gtgccctagt g 31
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31
DNA
人工序列
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acactccagc tgggtgagaa ctgaattcca t 31
19
31
DNA
人工序列
19
acactccagc tgggaggcac ggtgtcagca g 31
20
31
DNA
人工序列
20
acactccagc tggggggggt ccccggtgct c 31
21
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DNA
人工序列
21
acactccagc tgggtggtct aggattgttg g 31
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DNA
人工序列
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acactccagc tgggaagtgt gcagggcact g 31
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31
DNA
人工序列
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acactccagc tgggctctag agggaagcgc t 31
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31
DNA
人工序列
24
acactccagc tggggatggt tgaccagaga g 31
25
23
DNA
人工序列
25
cgccgcagtg cgtgtcgtgg agt 23
26
8
DNA
人工序列
26
cgtatcca 8