建蘭花葉病毒外殼蛋白基因原核表達蛋白及其製備和應用的製作方法
2023-09-16 14:47:10
專利名稱：建蘭花葉病毒外殼蛋白基因原核表達蛋白及其製備和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種建蘭花葉病毒(CymMV)外殼蛋白基因原核表達蛋白及其製備和 應用。
背景技術：
建蘭花葉病毒(Cymbidium mosaic virus, CymMV)是東南亞蘭花生產中蔓延最廣 的病毒病之一(Korotieieva et al.，2004)，發病非常普遍且無需專門傳播媒介，接觸傳染 迅速，給花卉生產帶來巨大損失。大面積的田間生產和貿易中需要方便、快捷的檢測方法， 以及時阻隔病原物的擴散。目前利用分子免疫學的方法因其具有的快速、特異性強的特點， 被廣泛地應用於動植物病毒檢測中。在檢測過程中往往需要製備特異性強的抗體作為檢測 試劑，通常病毒在病組織中含量低，一方面難以獲得大量高純度的病毒，另一方面利用提純 病毒製備的抗血清中常含有寄主蛋白的抗體，易導致假陽性反應(鄧叢良等，2005)。但是 可以利用病毒核酸基因在大腸桿菌菌株中大量表達蛋白，通過蛋白的富集和純化，可以利 用其免疫獲得特異性強的抗血清，達到上述檢測要求，提高檢測的靈敏度。
發明內容
本發明目的在於提供一種建蘭花葉病毒(CymMV)外殼蛋白基因原核表達蛋白及 其製備和應用。本發明採用的技術方案是一種建蘭花葉病毒(CymMV)外殼蛋白基因原核表達蛋白，具有SEQID No. 1所示的 胺基酸序列mgeptpipaatysaadptsapkladlaaikyspvtssiatpeeikaitqlwvnnlglpadtvgtaaid Iarayadvgasksatllgfcptkpdvrraalaaqifvanvtprqfcayyakvvwnlmlatndppanwakagfqedt rfaafdffdavdstaalepaewqrrptdreraahsigkygalarqriqngnlitniaevtkghlgstntIyalpap pte0本發明還涉及製備所述原核表達蛋白的方法，所述方法包括將編碼所述原核表 達蛋白的目的基因CymMVCP插入原核表達載體，獲得重組表達載體轉化至大腸桿菌中，得 到基因工程菌經誘導培養，獲得所述建蘭花葉病毒外殼蛋白基因原核表達蛋白；所述目的 基因CymMVCP具有SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。在已知本發明原核表達蛋白序列及其編碼序列的情況下，本領域普通技術人員可 以方便的獲得本發明所述的原核表達載體並進一步獲得本發明原核表達蛋白。優選的，所 述原核表達載體為pET32c，目的基因CymMVCP的插入位點位於EcoR I和Hind III兩個酶 切位點之間。具體的，所述原核重組表達載體質粒圖譜如圖1所示。本發明採用的pET32c 表達載體是個帶有多克隆位點(Polylinker)的載體，多克隆位點的下遊含有組氨酸標籤， 因此外源基因以融合蛋白的形式表達，同時表達的蛋白N端由載體序列編碼的6XHis標記 的蛋白不影響病毒外殼蛋白的免疫原性，由此製備的抗血清特異性也不受影響。
含目的基因CymMV-CP的重組載體在大腸桿菌菌株細胞中的大量誘導表達後進行 表達蛋白的富集，通過Ni-NTA Agarose蛋白純化柱進行目的蛋白的純化，通過Bradford進 行蛋白濃度測定。同時對表達蛋白進行SDS-PAGE分離和可溶性檢測，對相應大小的目的蛋 白條帶進行Western-blotting免疫原性分析，獲得了高純度高濃度可溶性的CymMV外殼蛋 白基因原核表達蛋白，可直接作為抗原免疫動物進行抗血清製備，為CymMV檢測提供製備 特異抗體的原料。本發明還涉及所述的原核表達蛋白作為抗原在製備CymMV抗血清中的應用。本發明的有益效果主要體現在提供了一種建蘭花葉病毒(CymMV)外殼蛋白(CP) 基因的原核表達蛋白及其製備和應用，利用該原核表達蛋白作為抗原可以得到特異性強的 抗血清，為進一步研製CymMV的快速檢測試劑盒提供了基礎。
圖1為含建蘭花葉病毒外殼蛋白基因的原核重組表達載體pET32C-CymMV-Cp ；圖2為重組載體pET32c-CymMV-cp的PCR鑑定結果圖；1 標準Mark ； 2 =CymMV RT-PCR擴增產物；3.重組質粒PCR產物；4.空白對照。圖3為原核表達的CymMV-CP蛋白的SDS-PAGE檢測結果；1 非預染Mark ； 2 pET32c-CymMV-cp在大腸桿菌中的表達蛋白；3 純化的pET32c-CymMV-cp在大腸桿菌中的 表達蛋白；4 :PET32c在大腸桿菌中表達的載體蛋白；圖4為CymMV抗體與原核表達菌株pET32c-CymMV-cp表達的CP蛋白的Western blot檢測結果；1 預染Mark ；2 純化的CymMV CP融合蛋白；3 :pET32c空載體表達的載體蛋白。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於 此實施例1 重組載體的構建1、材料與方法1.1實驗材料蝴蝶蘭(P. amabilis)感病株採自杭州傳化大地生物技術有限公司花卉基地，採 集黃化條紋和局部褪綠葉樣，於_75°C低溫冰箱保存。原核表達載體pET32c、大腸桿菌菌株BL21(DE3)購自北京英俊公司(Invitrogen， 北京)。1.2引物設計根據本實驗室分離的CymMV杭州分離物(GenBank登陸號為DQ915439)的CP基 因序列設計2條引物。在引物CymMV-CP-F的5』端添加EcoR I酶切位點和起始密碼子， CymMV-CP-R的5』端添加Hind III酶切位點和終止密碼子；所有引物均由上海生工生物技 術有限公司公司合成，引物序列如下CymMV-CP-F :5，ATCGAATTCATGGAGAGCCCACTCCAGCC-3』CymMV-CP-R 5' TTCAAGCTTTTATTCAGTAGGGGGTGC-3』
1. 3CymMV CP基因片段的PCR擴增CymMV CP基因直接以蝴蝶蘭(P. amabilis)感病株總RNA(以Trizol-RNA抽提試 劑盒提取)合成的cDNA (上海生工生物工程有限公司)為模板，用PCR方法合成，50μ L的 PCR反應體系包括5 X Primer STAR Buffer (Pakala,大連)5 μ LdNTP2mmol/LPrimer (F)50pmol/LPrimer (R)50pmol/LPrimer STAR (Pakala,大連)0. 5 μ L模板1 μ L加去離子水補足 50 μ L本申請發明人在前期工作基礎上已經建立了 CymMV的最佳PCR反應體系及條件 94°C熱變性 3min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 40s, 30 個循環；72°C延伸 IOmin0反應產物用瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，在紫外燈下觀察目的條帶並拍照。1.4擴增產物的純化在紫外燈下小心切下目的條帶，用上海生工生物技術服務有限公司的DNA回收純 化試劑盒進行回收，並取1 μ L純化產物進行瓊脂糖凝膠電泳，粗略定量。1.5載體DNA和目的基因的酶切、回收將純化的PCR產物和pET32c質粒分別用EcoR I、Hind III雙酶切，體系為去 離子水 30 μ L，EcoR II (Pakala，大連)2· 5 μ L，Hind III (Pakala，大連)2· 5 μ L，10 XM buffer (Pakala，大連)5 μ L，質粒DNA或目的基因DNA 10 μ L ;37°C酶切6h。酶切結束後用 DNA純化試劑盒(QIAGEN，上海)回收DNA片段，並用瓊脂糖凝膠電泳粗略定量，估計兩者濃 貞t匕。1.6連接反應將回收的目的DNA片段(SEQ ID No. 1嗎？)與載體DNA按體積比4 1混合後，用 連接試劑盒(Pakala，大連)連接。連接體系為載體DNAl μ L、目的基因DNA4 μ L、Solution I 5 μ L，混勻後16°C連接過夜。1. 7細菌轉化取連接產物與20(^1^感受態見21混勻，冰浴20min，42°C熱激90s後立即冰浴 2min,補加ImL LB液體培養基，37°C振蕩培養45min。6000rpm離心lmin，棄ImL上清，用剩 餘的200 μ L上清懸浮沉澱，塗布含Ampicillin (50 μ g/mL)的LB平板，37°C培養過夜至菌 落出現。2.結果與分析2. 1.原核表達載體的鑑定用EcoR I, Hind III對重組質粒進行雙酶切鑑定；同時用設計的特異性引物 CymMV-CP-F, CymMV-CP-R進行PCR鑑定，原核重組表達載體質粒圖譜如圖1所示，PCR鑑定 結果見圖2。反應結束後進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。挑取酶切和PCR鑑定為陽性的菌落，命 名為pET32C-CymMV-Cp，轉接於新的LB液體培養基，37°C過夜培養後送英俊公司測序，測序 後在GenBank中進行同源性比對。
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GenBank中目前共記錄了 5條CymMV全序列和55條CP基因序列，大部分是來源於 亞洲。利用GenBank已有數據及對85個CymMV分離物的CP基因和27個分離物的複製酶 基因的RdRp domain進行分析，認為世界範圍內CymMV在胺基酸水平上是十分保守的，並且 只有兩個起源，演化成兩個子群，A型和B型。核酸和胺基酸水平的同源性分別達到84%和 86%，其中包含了三個CPs C端高度變異的分離物(X81051，X62133和AF206274)。而本發 明中的分離物序列在核苷酸水平與A型子群同源性高達94 98 %，與B型子群成員的同源 性最低為86%。實施例2:蛋白的表達1.方法1.1 IPTG 誘導表達(1)將檢測陽性的含CymMV外殼蛋白基因重組質粒的另一半菌斑，接種於5mL含 50 μ g/mLAmpcillin的LB液體培養基中，振蕩過夜培養；(2)取200 μ L上述過夜培養液，轉接種於20mL含同樣濃度抗生素的LB液體培養 基中，37°C培養至OD6tltl達0. 4 0. 6 (約4 5小時)；(3)上述20mL繼代培養液中加入終濃度為0. 5mmol/L的IPTG，37°C繼續培養4h 後收集誘導菌液。1. 2SDS-PAGE檢測目的蛋白1)、取誘導菌液ImL於Eppendorf管中，12000rpm離心lmin，去上清；2)、沉澱用0. OlM PBS洗滌後用80 μ L PBS懸浮，超聲波破碎並離心；3)、上述上清和沉澱各加入20 μ L 5 X十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)上樣緩衝液(600mM ρΗ6· 8 Tris-HCl,5% 2-巰基乙醇，5% SDS, 0. 溴酚藍， 25%甘油)混合；4)、上述混合液分別煮沸後離心，取上清，作為SDS-PAGE電泳樣品，用15%的分離 膠進行電泳，並用考馬斯亮藍R250染色以檢測是否有目的蛋白條帶出現。1. 3ffestern-blot 免疫印跡分析 1)、電轉移緩衝液洗滌SDS-PAGE蛋白膠兩次；2)、剪取凝膠大小的濾紙2張、硝酸纖維素膜(NC膜)1張，用轉移緩衝液浸潤， 在負極石墨板上按濾紙、NC膜、凝膠、濾紙順序鋪好，趕走氣泡放上蓋板，20V，350mA轉膜 45min ；3)、上述NC膜放入平皿，用TBST洗滌一次，放入新配製的5%脫脂奶粉中37°C封 閉2h ；4)、將CymMV抗血清(Agdia公司，CymMV檢測抗體效價1 200)用含5%脫脂奶 粉的PBS稀釋100倍後，浸潤封閉過的NC膜，37°C作用Ih ；5)、用TBST洗滌上述浸潤後NC膜5次，每次3 5min ；6)、將HR標記的羊抗兔IgG做1000倍稀釋，浸潤上述洗滌後的NC膜，37°C作用 lh；7)、用TBST洗滌上述NC膜6次，每次3 5min ；8)、將上述NC膜浸入顯影液，待出現明顯的條帶或背景時，用水衝洗終止反應。1.4誘導菌中表達蛋白的富集與純化
1)、選取含CymMV-cp基因原核表達載體的陽性重組菌克隆斑，進行IPTG大量誘導 表達；2)、上述誘導菌液離心，用 50mM PBS (配製0· 5M NaH2PO4 19mL，0. 5M Na2HP0481mL, NaCl 29. 3g，加熱溶解後定容到IOOOmLdjf pH8. 0)洗滌一次，棄去上清；3)、上述每克細菌沉澱物溼重加入5mL緩衝液1 (pH8. 0的50mM PBS溶解urea 480g，定容到lOOOmL，調pH8. 0)懸浮細菌，超聲波破碎(300W，4S，99次)；4)、用清水和20%乙醇清洗Ni-NTAAgarose蛋白純化柱三次；5)、混勻填料上柱(水平裝柱2mL，可純化IOmL左右的細胞破碎液)，並用2 5 個柱床體積50mM PBS平衡柱子；6)、將上述3)細胞破碎超聲液過上述5)所述鎳柱，反覆過柱三次；7)、用50mM PBS 2 5個柱床體積洗滌上述柱子，以除去雜蛋白平衡pH值；8)、再分別用2 5個柱床體積的含10mM、20mM和50mM咪唑的PBS緩衝液洗滌柱 子，除去雜蛋白；9)、用適量含200mM、300mM和400mM咪唑緩衝液洗脫目的蛋白，循環洗滌5次，分 別取少量進行SDS-PAGE電泳檢測蛋白純度；10)、柱床上小心覆蓋20%乙醇適量，4°C保存。1.5純化蛋白濃度測定純化蛋白用Bradford法測定濃度，如果濃度不高則用超濾管濃縮後再測定。標準曲線的繪製
123456789實驗用緩衝液QL)2019.51918.51817.51716.516標準溶液OL)00.511.522.533.54Bradford工作液 L)200Bradford工作液
蒸餾水425mL
95% (ν/ν)乙醇15mL
88% (w/w)磷酸30mL
Bradford儲存液3 OmL ο
Bradford儲存液
95% (ν/ν)乙醇IOOmL
88% (w/w)磷酸200mL
考馬斯亮藍G250350mgo
按上表依次將試劑加入96孔板上相應孔，每種濃度做兩個重複，所測樣品根據蛋
白電泳估測濃度選擇合適量替換，表中標準溶液也同時加入板中，也設兩個重複，放入多功 能連續光譜儀振蕩，5min後用儀器自帶Bradford法程序讀取數據，經過設定後儀器即自動繪製標準曲線，同時給出所測蛋白濃度。2.結果與分析2. 1SDS-PAGE凝膠電泳檢測SDS-PAGE凝膠電泳顯示，含重組質粒pET32c-CymMV-CP的誘導菌表達出現分子 質量約為41. 9Ku的融合蛋白條帶，與理論推測結果一致；而誘導pET32c空質粒的誘導菌 則在分子質量約為22. 7Ku的位置出現了載體編碼的蛋白。蛋白用8mol/L尿素溶解後經 Ni-NTAAgarose柱變性純化後經SDS-PAGE檢測，其他雜蛋白已經洗脫，只在41. 9Ku處可見 較純的CymMV CP蛋白條帶(圖3)，其胺基酸序列經測序，與SEQ ID No. 1 一致。2. 2ffestern-blot 印跡Western Blot檢測表明，CymMV抗體與IPTG誘導的空載體轉化的細菌裂解物無反 應，但與重組菌誘導蛋白在CymMV-CP融合蛋白的大小位置處有很強的免疫反應(圖4)。說 明製備的原核表達蛋白作為抗原製備抗血清，具有較高的靈敏性。2. 3純化蛋白及濃度測定大量誘導蛋白用8mol/L尿素溶解後經Ni-NTAAgarose柱純化後獲得約20毫升的 純化蛋白，用Brandford法測定濃度，估算每毫升菌液可得800 μ g目的蛋白。
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權利要求
一種建蘭花葉病毒(CymMV)外殼蛋白基因原核表達蛋白，具有SEQID No.1所示的胺基酸序列。
2.製備如權利要求1所述原核表達蛋白的方法，所述方法包括將編碼所述原核表達 蛋白的目的基因CymMVCP插入原核表達載體，獲得重組表達載體轉化至大腸桿菌中，得到 基因工程菌經誘導培養，獲得所述建蘭花葉病毒外殼蛋白基因原核表達蛋白；所述目的基 因CymMVCP具有SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述原核表達載體為pET32c，目的基因 CymMVCP的插入位點位於EcoR I和Hind III兩個酶切位點之間。
4.如權利要求1所述的原核表達蛋白作為抗原在製備CymMV抗血清中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種建蘭花葉病毒(CymMV)外殼蛋白基因原核表達蛋白及其製備和應用，所述原核表達蛋白具有SEQ ID No.1所示的胺基酸序列。該表達蛋白可直接作為抗原免疫動物進行抗血清製備，為CymMV檢測提供製備特異抗體的原料，利用該原核表達蛋白作為抗原可以得到特異性強的抗血清，為進一步研製CymMV的快速檢測試劑盒提供了基礎。
文檔編號C07K16/06GK101967184SQ201010271180
公開日2011年2月9日 申請日期2010年9月2日 優先權日2010年9月2日
發明者徐鶯, 施農農, 楊科府, 陳瑜 申請人:杭州師範大學