一種脂肪酶催化在線合成6″-o-月桂醯-柚皮甙酯的方法
2023-09-15 19:21:15 3
一種脂肪酶催化在線合成6″-o-月桂醯-柚皮甙酯的方法
【專利摘要】本發明公開了一種脂肪酶催化在線合成6''-O-月桂醯-柚皮甙酯的方法，所述方法為：以摩爾比為1:1～9的柚皮甙與月桂酸乙烯酯為原料，以0.5～1.0g脂肪酶Lipozyme?RMIM為催化劑，以叔戊醇和DMSO的混合溶劑為反應溶劑，將脂肪酶Lipozyme?RMIM均勻填充在微流控通道反應器的反應通道中，所述微流控通道反應器的反應通道內徑為0.8～2.4mm，反應通道長為0.5～1.0m；使原料和反應溶劑連續通入反應通道中進行醯化反應，控制醯化反應溫度為40～55℃，醯化反應時間為15～35min，在線收集反應液，反應液經常規後處理得到6''-O-月桂醯-柚皮甙酯。本發明具有反應時間短、選擇性高及產率高的優點。
【專利說明】—種脂肪酶催化在線合成6" -O-月桂醯-柚皮甙酯的方法
(-)【技術領域】
[0001]本發明涉及一種脂肪酶催化在線可控選擇性合成6』 』 -O-月桂醯-柚皮甙酯的方法。
(二)【背景技術】
[0002]柚皮甙(Naringin)又稱柚皮苷、柑橘甙、異橙皮甙，是一種二氫黃酮類化合物，主要存在於芸香科植物柚果實、葡萄柚、橘和橙的果皮和果肉中，具有良好的抗癌、抑菌、抗氧化、降膽固醇、降低毛細血管脆性、改善微循環等多種生物活性，常用於醫藥、化妝品、食品等領域。
[0003]據研究黃酮類化合物的各種生物活性都是以抗氧化活性為基礎的，與抗自由基或抗脂質過氧化有關。特殊的結構賦予它一系列獨特的化學性質，如能與多種金屬離子發生絡合或靜電作用，具有還原和捕獲自由基的特性以及諸多衍生化反應活性等。黃酮類化合物抑制低密度脂蛋白LDL氧化和抑制類胡蘿蔔素及不飽和脂肪酸氧化的研究表明，苷元比糖苷具有更優秀的抗氧化活性。這是由於苷元親脂性強，能嵌入生物膜疏水層的內核中發揮作用。黃酮苷類化合物的多羥基及糖基結構使其具有一定的親水性，這勢必會影響抗氧化活性。黃酮類化合物通過酯化修飾，在分子中引入長烴鏈可以增加它的脂溶性，從而增加和脂肪的相容性及提高抗氧化性。那麼，柚皮甙作為應用最多的黃酮類化合物之一，研究開發其生理活性更強的柚 皮甙脂肪酸酯必將具有良好的應用前景。
[0004]目前，柚皮甙脂肪酯的合成途徑主要是在有機介質中進行酶促反應，對糖基上的羥基進行醯基化，具體包括醯化、酯化和酯交換反應三種方法。雖然酶促反應有反應條件溫和，選擇性好的優點，但是酶催化反應也存在一些局限性，比如酶的活性與有機溶劑的極性之間的制約，有機溶劑的極性與反應底物的溶解性之間的制約，反應時間較長、轉化率不高等技術瓶頸。因此，尋找柚皮甙酶促選擇性酯化新技術對於發展柚皮甙脂肪酸酯的生產具有重要意義。
[0005]微流控學(Microfluidics)是在微米級結構中操控納升至皮升體積流體的技術與科學，是近十年來迅速崛起的新交叉學科。當前，微流控學的發展已大大超越了原來的主要為分析化學服務的目的，而正在成為整個化學學科、生命科學、儀器科學乃至信息科學新一輪創新研究的重要技術平臺。
[0006]自1997年Harrison課題組發表了首篇在微流控晶片微反應器中合成化合物的文獻後，微流控晶片反應器已成功地用於多種有機合成反應，並展示了廣泛的應用前景。隨著微流控晶片中微混合、微反應技術的發展，在晶片中進行合成反應已經成為微流控晶片領域的研究熱點之一。
[0007]同常規化學反應器相比，微通道反應器不僅具有使反應物間的擴散距離大大縮短，而且傳質速度快；反應物配比、溫度、反應時間和流速等反應條件容易控制，副反應較少；需要反應物用量甚微，不但能減少昂貴、有毒、有害反應物的用量，反應過程中產生的環境汙染物也極少，是一種環境友好、合成研究新物質的技術。
[0008]目前，有較多的國內外學者對有機介質中柚皮甙酯的酶催化合成進行了研究，但是該方法往往需要較長的反應時間(24h)，且反應的轉化率與選擇性不高，利用微流控技術探索新的合成反應，用以解決現有合成方法的技術瓶頸是當今國際國內的研究熱點。我們研究小組前期也對微流控反應器中糖類化合物的酶促選擇性合成進行了系統研究，發現利用微流控技術進行糖類化合物的酶促選擇性合成具有一定的可行性。而柚皮甙是一類含糖黃酮類化合物，來源於柚果實、葡萄柚、橘和橙的果皮和果肉中，具有良好的抗癌、抑菌、抗氧化、降膽固醇、降低毛細血管脆性、改善微循環等多種生物活性。對柚皮甙的區域選擇性酯化修飾不僅可以提高生物利用率，還可以拓展其在醫藥、食品等領域的應用。並且是一類含糖黃酮類化合物，我們可以利用前期的研究基礎對柚皮甙的酶促區域選擇性酯化進行研究。因此我們研究了微流控通道反應器中脂肪酶催化選擇性合成6』 』 -O-月桂醯-柚皮甙酯的方法，旨在尋找一種高效環保的柚皮甙月桂酸單酯的在線可控選擇性合成方法。
(三)
【發明內容】
[0009]本發明要解決的技術問題是提供一種微流控通道反應器中脂肪酶催化選擇性合成6』 』 -O-月桂醯-柚皮甙酯的新工藝，具有反應時間短、選擇性高及產率高的優點。
[0010]為解決上述技術問題，本發明採用如下技術方案:
[0011]一種脂肪酶催化在線合成6』 』 -O-月桂醯-柚皮甙酯的方法，所述方法採用微流控通道反應器，所述的微流控通道反應器包括注射泵、注射器、反應通道和產物收集器，所述注射器安裝於注射泵中，通過第一接口與反應通道的入口連通，所述產物收集器通過第二接口與反應通道的出口連通，所述反應通道內徑為0.8~2.4_，反應通道長為0.5~
1.0m ;所述方法包括:以物質的量之比為1:1~1:9的柚皮甙與月桂酸乙烯酯為原料，以
0.5~1.0g脂肪酶Lipozyme RMIM為催化劑，以叔戊醇和二甲亞碸(DMSO)的混合溶劑為反應溶劑，將脂肪酶Lipozyme RMIM均勻填充在反應通道中，將原料和反應溶劑置於注射器中，注射器在注射泵的推動下將原料和反應溶劑連續通入反應通道中進行醯化反應，控制醯化反應溫度為40~55°C，醯化反應時間為15~35min，通過產物收集器在線收集反應液，反應液經後處理製得6』 』 -O-月桂醯-柚皮甙酯。
[0012]本發明採用的微流控通道反應器中，所述注射器數目可以是一個或多個，視具體反應需求而定。比如，當使用兩個注射器時，可採用T型或Y型接口與反應通道的入口相連通，使不同的反應物從兩個入口引入，匯流進入公共的反應通道，通過微通道的中反應物分子接觸與碰撞機率增大，使兩股反應液流在公共的反應通道中混合併進行反應。注射泵將多個注射器同步進行推動。
[0013]所述的微流控通道反應器還包括恆溫箱，所述的反應通道置於恆溫箱中，例如恆溫箱將反應通道封在箱內，以此可以有效控制反應溫度。所述的恆溫箱可以根據反應溫度要求自行選擇，比如水浴恆溫箱等。
[0014]本發明對於反應通道的材質不限，推薦使用綠色、環保的材質，例如矽膠管；對於反應通道的形狀最好為曲線形，可以保證反應液勻速穩定的通過。
[0015]本發明在實施過程中，可先用叔戊醇和DMSO的混合溶劑(叔戊醇:DMS0=4:1)溶解柚皮甙，其用量只要保證柚皮甙能充分溶解即可，並裝於注射器中備用；僅用無毒的叔戊醇溶解月桂酸乙烯酯，裝於另一注射器中備用；然後在注射泵(例如PHD2000注射泵)的同步推動下使原料和反應溶劑通入反應通道中進行反應。因此，本發明中，反應溶劑中叔戊醇和DMSO體積比大於4:1，相比於常規的搖床反應，可以將有毒的DMSO的使用量降至最低。
[0016]較為優選的，本發明所述的方法包括下列步驟:
[0017]先用體積比為4:1的叔戊醇和DMSO的混合溶劑溶解柚皮甙，裝於注射器中備用；用叔戊醇溶解月桂酸乙烯酯，裝於另一注射器中備用；兩支注射器通過Y型接口與反應通道的入口相連通，然後在注射泵的同步推動下將原料和反應溶劑通入反應通道中進行醯化反應。
[0018]當使用兩個注射器分別向反應通道注入溶有柚皮甙的叔戊醇和DMSO的混合溶液以及溶有月桂酸乙烯酯的叔戊醇溶液時，用於溶解月桂酸乙烯酯的叔戊醇的體積用量與溶解柚皮甙的叔戊醇和DMSO的混合溶劑的體積用量優選是相等的，以便於保證進入反應通道時兩種原料摩爾比的一致性。
[0019]所述用於溶解柚皮甙的叔戊醇和DMSO的混合溶劑的體積用量通常以柚皮甙的物質的量計為10~25mL/mmol。
[0020]本發明中，所述的脂肪酶Lipozyme RMIM使用諾維信(novozymes)公司生產的商品，是一種從Rhizomucor miehei得到的脂肪酶,是用一種基因改性的米麴黴(Aspergillusoryzae)微生物經過深層發酵而生產。Lipozyme RM IM是顆粒狀產品,粒度為0.2_0.6mm。
[0021]本發明方法將脂肪酶Lipozyme RMM均勻填充在反應通道，通過機械方法直接將顆粒狀的催化劑均勻固定於反應通道內即可。
[0022]進一步，所述柚皮甙與月桂酸乙烯酯的摩爾比優選為1:7~9，最優選為1:7。
[0023]進一步，所述醯化反應溫度優選為52~55°C，最優選為52 °C。
[0024]進一步，所述醯化反應時間優選為25~35min,最優選為30min。可通過調節注射泵來調節反應通道內流體的流速進而調節原料在反應通道內的停留時間，即反應時間。
[0025]本發明的反應產物可以在線收集，所得反應液可以通過常規後處理方法即可獲得6』 』 -O-月桂醯-柚皮甙酯。所述常規後處理方法可以是:所得反應液減壓蒸餾除去溶劑，剩餘物經矽膠柱層析分離，用200-300目矽膠溼法裝柱，洗脫試劑為乙酸乙酯、甲醇、水體積比為25:2.5:0.6的混合溶劑，剩餘物用少量洗脫試劑溶解後溼法上柱，收集洗脫液，同時TLC跟蹤洗脫進程，將得到的含有單一產物的洗脫液合併蒸乾，可以得到淡黃色的單酯晶體，即為6』 』 -O-月桂醯-柚皮甙酯。
[0026]本發明使用的反應通道內徑為2_，反應通道長為1.0m。反應通道內徑和長度會影響反應通道內的流體流速及停留時間，但對反應本身不造成直接影響。
[0027]本發明中，雖然在柚皮甙中有6個性能相近的羥基，但在微流控微通道反應器中脂肪酶催化選擇性合成6』 』 -O-月桂醯-柚皮甙酯具有較高的轉化率和選擇性，二酯的轉化率很低，幾乎沒有，通過柱層析分離得到的單酯的含量100%。產物的結構經1H NMR確證。這表明微流控微通道反應器中柚皮甙月桂酸酯的酶促選擇性合成具有很好的反應轉化率及選擇性，能實現高的單酯化率。
[0028]與現有技術相比，本發明的有益效果為:本發明微流控通道反應器中選擇性合成柚皮甙_6』 』 -O-月桂酸酯，該法不僅大大地縮短了反應時間，而且具有高的轉化率和反應選擇性；同時降低了 DMSO的`使用量，具有環保優勢。(四)【專利附圖】
【附圖說明】
[0029]圖1為本發明實施例採用的微流控通道反應器的結構示意圖。
(五)【具體實施方式】
[0030]下面以具體實施例對本發明的保護範圍作進一步說明，但本發明的保護範圍不限於此:
[0031]本發明實施例使用的微流控通道反應器的結構參考圖1，包括一個注射泵(未顯示)、兩個注射器1、反應通道3、水浴恆溫箱(5，僅顯示其平面示意圖)和產物收集器4 ;兩個注射器I安裝於注射泵中，通過一個Y型接口與反應通道3的入口連通，所述反應通道3置於水浴恆溫箱5中，通過水浴恆溫箱5控制反應溫度，所述的反應通道3的內徑2.0mm,管長lm，所述反應通道3的出口通過第二接口與產物收集器4連通。
[0032]實施例1:6』 』 -O-月桂醯-柚皮甙酯的合成
[0033]
【權利要求】
1.一種脂肪酶催化在線合成6』 』 -O-月桂醯-柚皮甙酯的方法，其特徵在於所述方法採用微流控通道反應器，所述的微流控通道反應器包括注射泵、注射器、反應通道和產物收集器，所述注射器安裝於注射泵中，通過第一接口與反應通道的入口連通，所述產物收集器通過第二接口與反應通道的出口連通，所述反應通道內徑為0.8~2.4mm,反應通道長為0.5~1.0m ;所述方法包括:以物質的量之比為1:1~9的柚皮甙與月桂酸乙烯酯為原料，以0.5~1.0g脂肪酶Lipozyme RMIM為催化劑，以叔戊醇和二甲亞碸的混合溶劑為反應溶劑，將脂肪酶Lipozyme RM頂均勻填充在反應通道中，將原料和反應溶劑置於注射器中，注射器在注射泵的推動下將原料和反應溶劑連續通入反應通道中進行醯化反應，控制醯化反應溫度為40~55°C，醯化反應時間為15~35min，通過產物收集器在線收集反應液，反應液經後處理製得6』 』 -O-月桂醯-柚皮甙酯。
2.如權利要求1所述的脂肪酶催化在線合成6』』 -O-月桂醯-柚皮甙酯的方法，其特徵在於:所述的方法包括下列步驟:先用體積比為4:1的叔戊醇和DMSO的混合溶劑溶解柚皮甙，裝於注射器中備用；用叔戊醇溶解月桂酸乙烯酯，裝於另一注射器中備用；兩支注射器通過Y型接口與反應通道的入口相連通，然後在注射泵的同步推動下將原料和反應溶劑通入反應通道中進行醯化反應。
3.如權利要求1所述的脂肪酶催化在線合成6』』 -O-月桂醯-柚皮甙酯的方法，其特徵在於:所述微流控通道反應器包括恆溫箱，所述反應通道置於恆溫箱中。
4.如權利要求2所述的脂肪酶催化在線合成6』』 -O-月桂醯-柚皮甙酯的方法，其特徵在於:所述微流控通道反應器包括恆溫箱，所述反應通道置於恆溫箱中。
5.如權利要求1~4 之一所述的脂肪酶催化在線合成6』』 -O-月桂醯-柚皮甙酯的方法，其特徵在於:所述柚皮甙與月桂酸乙烯酯的物質的量之比為1:7~9。
6.如權利要求1~4之一所述的脂肪酶催化在線合成6』』 -O-月桂醯-柚皮甙酯的方法，其特徵在於:所述醯化反應溫度為52~55°C，所述醯化反應時間為25~35min。
7.如權利要求5所述的脂肪酶催化在線合成6』』 -O-月桂醯-柚皮甙酯的方法，其特徵在於:所述柚皮甙與月桂酸乙烯酯的物質的量之比為1:7。
8.如權利要求6所述的脂肪酶催化在線合成6』』 -O-月桂醯-柚皮甙酯的方法，其特徵在於:所述醯化反應溫度為52°C，所述醯化反應時間為30min。
【文檔編號】C12P19/60GK103667402SQ201310392411
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年9月2日 優先權日:2013年9月2日
【發明者】杜理華, 羅錫平, 何鋒, 凌慧敏, 楊文俊 申請人:浙江工業大學