樣品中抗原響應細胞的檢測的製作方法

2023-09-16 09:32:20

專利名稱：樣品中抗原響應細胞的檢測的製作方法
樣品中抗原響應細胞的檢測艦本發明涉及利用多維標記抗原呈遞化合物，例如主要組織相容性複合抗體(MHC) 以檢測樣品中抗原響應細胞的方法。此外，本發明涉及利用該多維標記抗原呈遞化合物，例如抗原-主要組織相容性複合抗體(MHC)在樣品，優選單一樣品，例如血液樣品中抗原響應細胞的檢測中的應用。本發明的方法能實現特定抗原響應細胞，例如T和B細胞的高通量分析，從而提供了，例如疾病或病症的監控以及免疫治療、疫苗的研發、或表位或免疫原性胺基酸序列的鑑別的高通量方法。抗原響應細胞，例如T和B細胞，能通過利用其克隆特異性(clone-specific) T細胞受體(TCR)監控疾病特異性肽-主要組織相容性複合抗體(MHC)來鑑別病毒感染的細胞和腫瘤細胞等。人T細胞的組合所表達的不同TCR的庫非常大，估計達約2500萬(Arstila 等，1999)。為了疾病和病症的監控和免疫治療或疫苗的開發，能夠從大量無關抗原響應細胞、即不含有抗原特異性受體的細胞庫中，檢測、鑑別或分離出那些鑑別，例如克隆特異性T 細胞受體(TCR)、特異性抗原-MHC (aMHC)複合物例如肽-MHC (pMHC)的特異性抗原響應細胞例如T細胞和B細胞是很關鍵的。如最早由Altman等(1996)所示，偶聯了螢光團的可溶性多聚體pMHC複合物可用於通過流式細胞術檢測抗原特異性T細胞。這些螢光MHC多聚體的使用已經成為研究和臨床監控中T細胞監控的基石。然而，單個生物樣品中僅可監控幾個(且經常僅一個)抗原的特異性這一事實成為使用MHC多聚體流式細胞術檢測抗原特異性T細胞應答中的主要限制。這一限制是由於 「通道」，即可通過其激發或發射光譜區分或用流速細胞術檢測的不同標記例如螢光團的數量的限制，且這嚴重限制了一般能得到的有限量生物材料(例如單份外周血樣品)中可進行的T細胞應答分析的數量。例如，生物材料被分析以監控自然產生(例如在感染或癌症後發生)的免疫應答。 此外，生物材料被分析以得到免疫治療(包括疫苗)對免疫應答的影響。本文所用免疫治療是定義為旨在增強或抑制免疫應答的醫療介入，包括疫苗、非特異性免疫刺激劑、免疫抑制劑、基於細胞的免疫抑制、基於細胞的免疫治療及其組合中的活性成分。儘管最近的量子點(Qdots)作為新型無機螢光團的開發、和流式細胞設備的多參數檢測可能性的持續增加，通過PMHC多聚體染色在單一樣品中能分析的不同T細胞集合的最大數量仍為4種(Chattopadhyay等，2006)。由多個研究組已經嘗試開發稱為MHC微陣列技術這一事實可以理解對於開發能進行更全面的抗原特異性T細胞應答分析技術的需求。在這些系統中，T細胞特異性不是由螢光團編碼的，而是由空間編碼的(Soen等，2003 ；和Mone等，200 。儘管具有潛力，MHC 微陣列還未被廣泛採用，也未有文獻實例證明其在T細胞響應的多重檢測(例如表位鑑別) 中的價值。組合編碼系統已在多種設定下用於增加單一樣品中可進行的分析的數量。在QdotS領域的一個具體例子是由使用Qdot編碼的微珠進行基因分型而形成的(Xu等， 2003)。此外，組合編碼用於利用珠陣列測量血清產物例如細胞因子，其中編碼通過不同的珠粒尺寸，螢光團和螢光團強度進行(例如，BD細胞術珠陣列)。所有這些例子中，溶質通過結合到預編碼的微珠上進行分析。考慮上述信息，本領域仍然需要能夠以高通量方式檢測、分離和/或鑑別特異性抗原響應細胞，例如抗原特異性T細胞的方法。此外，考慮到可得的樣品量通常很有限，本領域還需要能夠在單個樣品中檢測、分離和/或鑑別多種特異性抗原響應細胞，例如T細胞的方法。因此，本發明的目的包括，提供在相對少量的生物樣品，例如單個樣品，例如單個外周血樣品中檢測多種抗原特異性細胞的方法，優選以高通量的方式。該目標和其它目標通過所附權利要求1定義的方法實現。具體而言，該目標通過在樣品(生物材料如外周血樣品)中檢測抗原響應細胞的方法實現，該方法包括-提供(例如加載)攜帶至少一種標記的抗原呈遞化合物，和兩種或兩種以上預定抗原，其中各抗原由至少兩種不同標記表示(編碼)；-將所述含有抗原的抗原呈遞化合物與所述樣品接觸；-檢測所述加載抗原的抗原呈遞化合物與所述抗原響應細胞的結合，從而檢測對所述抗原的細胞響應；其中通過檢測由加載有所述抗原的所述抗原呈遞化合物而結合在抗原響應細胞上的至少兩種不同標記的存在來檢測所述抗原。根據本發明的一種優選實施方式，上述兩種或兩種以上預定抗原選自3種或3種以上、4種或4種以上、5種或5種以上、6種或6種以上、7種或7種以上、8種或8種以上、 10種或10種以上、11種或11種以上、11種或11種以上、12種或12種以上、13種或13種以上、14種或14種以上、15種或15種以上、16種或16種以上、17種或17種以上、18種或 18種以上、19種或19種以上、20種或20種以上、20種或20種以上、21種或21種以上、22 種或22種以上、23種或23種以上、24種或24種以上、25種或25種以上、26種或26種以上、27種或27種以上、觀種或28種以上組成的組。本發明通過分析由限定的抗原呈遞化合物的組合形成的組合編碼擴展了組合編碼的概念。具體而言，本發明基於大量抗原特異性細胞應答可被同時分析這一發現，且檢測是在單個樣品中通過利用各自與獨特的標記(例如螢光團)的組合偶聯的抗原呈遞化合物進行，相同的標記可多次使用，但每次都與一種或多種其它標記，例如螢光團，組成獨特的組合。與現有技術不同，本發明涉及專用於測定的編碼的全新創造；這包括對細胞而非溶質的分析；且本發明涉及組合編碼在抗原特異性細胞應答的平行分析中的應用。得到的數據顯示，儘管廣泛認為抗原特異性細胞是高度交叉反應性的，通過組合編碼檢測細胞還是實用且有現實可能的。本發明通過詳細分析黑色素瘤患者的外周血中黑色素瘤相關抗原特異性的T細胞應答對組合編碼的價值給出了示例。以前的研究顯示，檢測抗原特異性T細胞可以通過含有相同或相關的肽、各自與不同的螢光團偶聯的兩種MHC多聚體的結合進行檢測，從而在單個樣品中檢測單個抗原。 這一雙MHC多聚體染色技術用於發現T細胞對(各種)單一肽表位的精確特異性(Haanen 等，1999)。在本發明中，術語「抗原」是指被免疫系統鑑別為「外來」或異源的免疫原性肽或多肽。本發明預期，若大量該雙色編碼的pMHC可在單個樣品中組合而不幹擾這些pMHC 中單個成員檢測T細胞特異性的能力，可以考慮利用這樣的技術編碼比傳統的單色編碼更多數量的T細胞特異性。在這一設定中，特異性T細胞群體將不再如現有技術pMHC多聚體染色的情形那樣由單個螢光信號限定，而是通過兩種預定螢光團的結合的存在而非單獨或者組合的任何其它螢光團來顯現其克隆特異性。這一組合編碼方案的能力隨著可用的螢光團數量的增加而越發明顯。例如，在有3種螢光團可用於編碼的設定中，單一和雙重編碼系統都可用於揭示三種不同的種類(單色編碼的情況時為『A』、『B』、和『C』，和雙色編碼的情況時為『A-B』、 『A-C』、和『B-C』 )；在有8種螢光團可用於編碼時，單一和雙重編碼系統可分別提供8種和 28中獨特的編碼；在有17種螢光團(目前可用於單一流式細胞分析的不同螢光團的最大數量)可用於編碼時中，單一編碼系統可提供17中獨特的編碼而雙重編碼系統可包含最多達136中不同種類。儘管本發明示例了 2-維的組合編碼，即兩種螢光團編碼單個抗原，三維或更高階 (例如4和5)的組合編碼通過相同原理起作用且在可用的螢光團數量增加時特別有吸引力。為說明這一點，在後面使用了 17種螢光團的實施例中，更高階的編碼方案使得能編碼數千中獨特的特異性。決定上述組合編碼是否可用於單個樣品的關鍵因素之一是在標記被多次使用並與多種不同的抗原-抗原呈遞化合物偶聯的情況下通過多個標記間的相互作用測量抗原響應細胞的能力。使用相同的標記與不同的抗原-抗原呈遞化合物偶聯本身提高了抗原響應細胞被不同抗原-抗原呈遞化合物標記的可能性，從而破壞通過例如下表1所示編碼來揭示其抗原響應性的可能性。與廣泛認為的抗原特異性細胞是高度交叉反應性的觀點相反，本發明的發明人意外地發現多次使用相同的標記與不同的抗原-抗原呈遞化合物偶聯能夠檢測抗原響應細胞。決定上述組合編碼是否可用於單個樣品的另一個關鍵因素是該方法的辨別能力， 或，換言之，分別檢測標記(例如螢光團)的各種組合的能力。標記例如螢光團的使用本身提供了背景信號，低於該背景信號時是不可能進行特異性檢測。由此，其本身遵循當使用兩種標記時背景信號會增加，檢測極限相應提高，當使用三種標記時進一步增加，等等。本發明的發明人意外地發現，與預期的由於背景信號(非特異性)的增強導致辨別能力降低相反，用兩種或多種標記(例如螢光團)編碼多種抗原降低了背景信號，在2標記抗原編碼系統中背景信號降低因子高達10，從而使該系統的靈敏度顯著提高。由於該系統的靈敏度提高，抗原的多重檢測，即多種抗原響應細胞的檢測，成為可能，從而提供了本發明所述的方法。
此外，由於上述觀察到的背景信號降低從而靈敏度提高等因素，期望的由於抗原呈遞化合物的非特異性結合對測試的靈敏度的負面影響被顯著降低，從而進一步提供了本發明所述的方法。根據本方法的一種優選的實施方式，抗原呈遞化合物提供有一種標記，和抗原由至少兩種帶不同標記的抗原呈遞化合物表示或編碼。換言之，根據該優選的實施方式，待檢測的各單獨的抗原(或表位)加載有至少兩種各自具有不同可檢測標記(例如不同的螢光發射螢光團)的抗原呈遞化合物。根據本方法的另一種優選實施方式，抗原呈遞化合物提供有至少兩種不同標記， 例如2、3、4、5、6、7、8種例如與MHC偶聯或共價結合的標記，且抗原由一種多重標記的抗原呈遞化合物表示(或編碼)。換言之，根據該優選的實施方式，待檢測的各單獨的抗原(或表位)加載有一種提供有至少兩種不同標記(例如不同的螢光發射螢光團)的抗原呈遞化合物。本發明所述的抗原優選為肽。該肽可代表例如病毒或腫瘤細胞的已知免疫原性表位，從而使能，例如檢測響應該抗原的免疫細胞的存在及後續診斷病毒感染或癌症。該肽還可以代表未知表位，且檢測對該肽的細胞響應表明該肽中免疫原性胺基酸序列的存在，從而使能鑑別例如多肽中的免疫原性區域或表位。本發明所述的抗原呈遞化合物優選連接抗原和所連接的標記。對於T細胞，本發明所述的抗原呈遞化合物優選為主要組織相容性複合抗體(MHC)和，更優選地，多聚體 (multimeric)主要組織相容性複合抗體(MHC)，優選四個或四個以上。對於T細胞，但不針對例如B細胞，抗原呈遞化合物優選對抗原和抗原響應細胞之間的相互作用有能量貢獻， 從而增強相互作用。主要組織相容性複合抗體(MHC)的使用是有利的，不單是因為這些化合物天然能表示抗原，也因為現有技術能提供可用於本方法的已標記抗原呈遞化合物(Rodenko等， 2006)。本發明優選的抗原響應細胞是T細胞和/或B細胞，更優選T細胞。本發明所述標記優選螢光標記，更優選Qdots技術中指定的螢光標記。根據本方法的一種優選的實施方式，單個測試中使用的不同標記數量選自3種或 3種以上、4種或4種以上、5種或5種以上、6種或6種以上、7種或7種以上、和8種或8種以上。根據另一種優選的實施方式，各單獨的抗原由至少三種或至少四種不同的標記表示。通過使用3種或3種以上、或甚至4種或4種以上的標記，例如Qdots，編碼單個抗原， 單個樣品中可能檢測的抗原響應細胞的數量顯著增加。其示例見圖1，顯示了可用於編碼或表示單個抗原的通道或組合的數量。儘管單個標記編碼單個抗原可以辨別最多與可用標記數量相同的抗原響應細胞種類，用2種、3種、或4種標記編碼同樣的抗原顯著增加了可被檢測的抗原呈遞細胞的種類數量。根據本發明，本方法優選在單個樣品中進行，其中樣品優選為血液樣品。如本文所定義，術語「血液樣品」不限於從個體直接得到的血液樣品，還包括從直接獲得的血液樣品衍生的、或製得的樣品，限制要求是這些衍生樣品仍含有原始存在的抗原響應細胞。根據本方法的一種特別優選的實施方式，抗原響應細胞的檢測包含流式細胞分析。考慮到上述內容，不同於另一方面，本發明還涉及表示單個抗原的至少兩種標記在檢測樣品中抗原響應細胞中的應用。本發明的另一方面涉及本方法在疾病或病症例如癌症的診斷中的應用。本發明的另一方面涉及本方法在免疫治療的開發中的應用。本發明的另一方面涉及本方法在疫苗開發中的應用。本發明的另一方面涉及本方法在鑑別多肽的表位、或免疫原性胺基酸序列中的應用。這一方面在下文舉例描述，利用本發明的方法鑑別了未知HLA-A3相關T細胞抗原 QLRALDGGNK、SLYRDPLPR、HAYIQSLLK、RMYNMVPFF 和 GTYEGLLRR。因此，本發明還涉及選自 QLRALDGGNK、SLYRDPLPR、HAYIQSLLK、RMYNMVPFF 或 GTYEGLLRR的HLA-A3相關T細胞抗原；本發明的HLA-A3相關T細胞抗原、或其功能性衍生物在免疫治療監控和疫苗中的應用；和本發明的HLA-A3相關T細胞抗原、或其功能性衍生物在免疫治療和疫苗開發中的應用。實施例提供了本發明的原理的更多細節，顯示了本發明優選的實施方式。在實施例中，參考了如下附圖，其中


圖1 顯示了 1-或2-維(左)或1-4-維(右)編碼方案中，利用螢光團數量的增加所能得到獨特顏色組合物的理論數量。圖2 顯示了利用8中螢光團的2-維矩陣可用來編碼抗原的觀種獨特的顏色組合物。圖3 顯示了通過使用雙色編碼pMHC多聚體降低背景信號。灰柱PBMC用25種不同的雙色編碼的含有CMVnw表位(『CMV』)或對照pi太(背景)的MHC多聚體組合物染色。 黑柱PBMC用8種不同的單色色編碼的含有CMVnlj表位(『CMV』 )或對照ρ*肽(背景)的 MHC 多聚體(PE、APC、Q565、Q585、Q605、Q655、Q705 和 Q800)染色。圖4 顯示用於鑑別雙色編碼pMHC多聚體染色後的pMHC特異性T細胞門控方案的示意圖。圖5-7 顯示了通過組合編碼進行的病毒特異性T細胞應答多重檢測。在三個健康供體的PBMC中分析病毒特異性T細胞應答1)通過將樣品用25種不同的各自用雙色碼編碼的pMHC多聚體染色；II)通過將25個單獨的樣品用pMHC多聚體染色，該pMHC多聚體含有一種選自25種偶聯有特異性雙色碼的肽；III)通過將25個單獨的樣品用含有25種肽之一的傳統PE標記MHC多聚體染色；和IV)通過將樣品用各自用雙色碼編碼的無關pMHC多聚體的混合物染色。I-IV 在'I中測得頻率>0.03%的抗原特異性T細胞群體的點狀圖。 V:針對所用的25種肽(附表1)的抗原特異性CD8+T細胞頻率的示意圖，由PE標記MHC多聚體染色測得(■)；每個樣品通過25種特異性的雙色編碼MHC多聚體測得( )；由加載了對照肽的雙色編碼MHC多聚體測得( )。圖8 顯示了不同T細胞染色方法之間的相關性。由傳統PE標記MHC多聚體染色(X軸)和由每個樣品用25種特異性雙色編碼MHC多聚體染色(Y軸)測得的抗原特異性T 細胞頻率之間的相關性。圖9 顯示了不同T細胞染色方法之間的相關性。由每個樣品用一種特異性的雙色編碼MHC多聚體染色(X軸)和由每個樣品用25種特異性雙色編碼MHC多聚體染色(Y 軸)測得的抗原特異性T細胞頻率之間的相關性。圖10:顯示了針對黑色素瘤-相關肽的T細胞應答。黑色素瘤患者和健康供體中測得的抗原特異性T細胞應答的小結，各針對HLA-A3-限制性病毒衍生T細胞表位 (EBVkuoEBVkvioFLUiu^離體直接檢測(▲) ；22中黑色素瘤限制性肽、直接離體檢測(■)； 或22中黑色素瘤限制性肽、T細胞富集並體外擴增O。圖11 顯示了胞內IFNy染色證實由組合編碼定義的MHC多聚體反應性T細胞的肽特異性。肽的數量參見表2中的序列。
實施例方法肽-MHC複合物的生成所有肽都是採用標準的Fmoc化學法內部合成或購自荷蘭的派普斯坎公司 (Pepscan Presto BV，Lelystad，NL)。紫外敏感型結構單元(building block) J 按文獻所述合成(Toebes等，2006)。重組HLA-Al、-A2、-A3和-B7重鏈和人β 2m輕鏈在大腸桿菌 (Escherichia coll)內生成。I類MHC的重摺疊反應按文獻所述進行(Garboczi等，1992) 且I類MHC複合物通過PBS (pH 7. 4)中的凝膠過濾HPLC純化。 特異性肽-HLA複合物通過MHC肽交換產生。在所述肽的存在QOO μ Μ)下，p*HLA 複合物(100μ g/mL)經受1小時366nm紫外光照(Camag)。交換後，樣品在16，OOOg下離心 5分鐘，取上清用於形成MHC多聚體。MHC多聚體的生成MHC多聚體利用8種不同的螢光鏈黴親和素偶聯物(Invitrogen)生成 SA-Qdot565、SA_Qdot585、SA_Qdot605、SA_Qdot655、SA_Qdot705、SA_Qdot800、SA-藻紅素 (PE)和 SA-別藻藍素(APC)。每 100 μ L MHC 單體(濃度 100 μ g/mL)加入 7. 08 μ L SA-Qdot 偶聯物(1 μ Μ)、10. 8 μ L SA-PE (lmg/ml)、或 6 μ L SA-APC(lmg/ml)，隨後在冰上培育 20 分鐘。假定MHC肽交換後100%回收，這可導致每個SA-Qdot被30個MHC單體佔據。加入生物素(Sigma)和NaN3 (Sigma)至終濃度分別為26. 4 μ M和0. 02%，隨後在冰上培育20分鐘。 PE和APC標記複合物用含有0. 02% NaN3的PBS稀釋2倍。對於各pMHC複合物，用兩種不同螢光標記按表1和表2中的方案製備多聚體。為了 T細胞組合染色，相同特異性的多聚體複合物按1 1混合Q605、Q655、Q705、 PE和APC標記的複合物，並按2 1的比例將Q565、Q585和Q800標記的複合物與其它顏色相組合。排除Q565、Q585和Q800間的組合。收集生成用於由組合編碼分析T細胞應答的pMHC混合物組合，4°C保存作為50倍濃縮的待用T細胞染色母液。使用前，將MHC多聚體以17，OOOg離心2分鐘，使用上清液。T細胞染色T細胞染色使用約IxIO6PBMC或hlO5培養的T細胞、單一 pMHC多聚體2 μ L、或雙色編碼PMHC的集合50μ L(以最初的單體濃度計算，每個不同的pMHC終濃度為 2 μ g/mL) 0最終染色提交為80μ1且細胞在37°C培養10分鐘。接著加入20yL由 CD8-Alexa700 (Caltech MHCD0289)(最終稀釋度 1/200)、CD4_FITC (BD 345768)(最終稀釋度 1/8)、CD14-FITC (BD 345784)(最終稀釋度 1/32)、CD19-FITC (BD345776)(最終稀釋度 1/16) ,CD40-FITC (Serotech MCA1590F)(最終稀釋度 1/40)、CD16_FITC (BD 347523)(最終稀釋度1/64)組成的5倍抗體混合物，細胞在4°C培育20-30分鐘。進行流式細胞分析之前，細胞清洗2次，加入碘化丙錠(PI)使能排除死細胞。流式細胞分析在裝有FacsDiva軟體的LSR-II流式細胞儀(BD公司(Becton Dickinson))上進行數據採集，採用下列11色設備設定488nm雷射=PI :685LP，695/40 ；PE :550LP，575/26 ； FITC :505LP, 530/30 ；SSC :488/10。633nm 雷射Alexa700 :685LP，730/45 ；APC :660/20。 405nm 雷射Qdot800 :770LP，800/30 ；Qdot705 :680LP，710/50 ；Qdot655 :635LP，660/40 ； Qdot605 :595LP，650/12。355nm 雷射Qdot585 :575LP，585/15 ；Qdot565 :545LP :560/20。各分析記錄約200，000個淋巴細胞。為鑑別抗原特異性T細胞，採用下列門控方案:1).選擇或的單細胞淋巴細胞(採用PI陰性、低FSC-W/H、低SSC-W/H、FSC/SSC-A)。 2) ·選擇CD8陽性和「排除(dump)，，陰性細胞(CD4,14，16，19，40)。3) ·選擇兩個MHC多聚體通道為陽性而其它6個MHC多聚體通道為陰性的⑶8+T細胞。抗原特異性T細胞的富集抗原特異性T細胞用PE-多聚體(每IO7PBMC用1. 25 μ L各PE多聚體的100 μ g/ mL母液)在4°C染色1小時。隨後，清洗細胞，並用20 μ L塗布有抗-PE抗體的磁珠(美天旎公司(Miltenyi))培育。再用MACS(美天旎公司(Miltenyi))，採用LS柱並按廠商方案分離細胞。洗脫的細胞清洗後，與5000個抗-CD3/Q^8戴納珠(Dynabead) (Invitrogen) 一起重懸浮於200 μ LT細胞培養基(IMDM(Gibco)中含有10%人血清Qnvitrogen)、100IU/ mL IL-2 (Proleukin)和 20ng/mL IL-15 (Peprotech)) 富集的細胞在 96 孔板中培養並在次日重懸浮。培養物至少每周分割並更換新鮮培養基兩次。2-3周後，通過基於組合編碼的 MHC多聚體流式細胞分析測量抗原特異性T細胞應答。T細胞分選和培養T細胞用相關pMHC多聚體染色，然後在MoFlo (大科公司(Dako))或FACSAria (BD 公司(Becton Dickinson))上分選成IO5輻照的飼細胞(JY plus同種移植物PBMC)。細胞離心且重懸浮於含有10%人血清、100IU/mL IL-2和0. 5 μ g/mL PHA(生物色品公司 (Biochrom AG))的IMDM中。培養物每兩周再刺激一次。通過MHC多聚體染色測試已建立的培養物的抗原特異性。細胞因子釋放試驗T2-A3細胞中加載所述肽1小時後清洗一次。從所述培養物中取IxlO5T細胞和 IxlO5 T2-A3細胞37°C下在含有10%人血清和蛋白質傳輸抑制劑(BD GolgiPlug)的IMDM 中培育4小時。細胞用PE偶聯的抗-⑶8抗體(SK1，BD)在25°C染色15分鐘，固定並通透 (BD Cytof ix/Cytoperm 試劑盒)，並用 APC 偶聯的抗-IFNgamma 抗體(25723. 11，BD)在 4°C 下染色30分鐘。樣品通過流式細胞分析(青色，Dako)，用Flowjo進行數據分析。實施例1
著眼於開發一種基於在感興趣的靶細胞上組裝限定編碼的組合編碼方案，首先確定了採用一組6種不同的量子點Oidot，特徵見圖2列表)用於檢測抗原特異性T細胞應答的可行性。量子點是按其直徑和組成具有不同發射波長、顯示很窄的發射光譜的螢光納米晶體，使得它們特別適合於同時採用大量螢光團的實驗。通過分析外周血的CMV-特異性⑶8+T細胞應答，已經確立通過與鏈黴親和素偶聯 Qdot或標準別藻藍素(APC)或藻紅素(PE)偶聯而多聚體化的MHC複合物都可用於檢測抗原特異性T細胞群體(數據未顯示)。接下來，測試了是否還能通過結合兩種含有相同抗原性肽但與不同螢光團偶聯的 MHC多聚體可靠地鑑別抗原特異性T細胞。與兩種不同螢光團的所有觀種可能組合偶聯的 I類PMHC複合物的測試表明，這些雙編碼在所有情況中都能鑑別合適的T細胞群體。由於對T細胞表面有限組可用TCR的競爭結合，用兩種不同標記的MHC多聚體同時對T細胞染色導致各通道螢光強度的輕微降低(等摩爾比時，降低因子為幻。為限制競爭對抗原特異性T細胞群體的顯示能量的負面影響，三種在流式細胞系統中給出最低信號強度的qDot ^!565、Q585和Q800)相對於其它螢光團以2 1的比例而不是1 1的比例使用，且Q565+Q585、Q565+Q800和Q585+Q800的組合由於比例調整顯然不現實而在後續試驗中未被採用。本實施例顯示加載有相同抗原的被不同標記的抗原呈遞化合物能夠結合抗原響應細胞，因此，通過檢測這些不同的標記能夠檢測樣品中的這些細胞。實施例2抗原特異性T細胞群體可以以很低的頻率存在，且在流式細胞分析中MHC多聚體顯示出背景染色。為測試通過組合編碼檢測抗原特異性T細胞是否影響背景水平，或抗原特異性τ的測出頻率，含有HLA-A2CMVnw特異性T細胞的PBMC用對照多聚體或HLA_A2CMVNW 多聚體染色並通過流式細胞術分析。具體而言，PBMC或者在8個單獨的染色過程中與8種不同的單編碼MHC多聚體培育、或者在25個單獨的染色過程中與25種雙編碼的MHC多聚體培育。當一個通道(單色染色的情況中)或兩個相關通道中(雙色染色的情況中)染色在背景之上時認為T細胞陽性。由圖3可見，使用雙色編碼方案時背景樣品中細胞的頻率比傳統的單色染色方法低約10倍，顯示雙色編碼MHC多聚體是降低背景信號的有力工具。實施例3確立了雙色編碼的可行性後，檢查了多重雙色編碼pMHC多聚體染色是否可在單個樣品中平行進行。為了分析單個樣品中對任何雙色編碼PMHC多聚體有反應性的T細胞， 首先開發出一種門控方案(圖4)。簡單而言，根據正向和側向散射、細胞寬度/高達和碘化丙錠染色陰性選擇單個活細胞。從這一庫中，進一步鑑別⑶8染色陽性而⑶4、⑶14、⑶16、⑶19和⑶40( 「排除」 通道，van Oijen等，2004)陰性的細胞作為相關的⑶8+T細胞。為分析對任何雙色編碼pMHC 多聚體有反應性的T細胞群體，根據8種用於生成MHC多聚體的獨立螢光團設置門控。這一方案鑑別出給定的雙通道組合中信號顯示高於背景並且在其餘6個通道中為陰性的細胞，使能在一次流式細胞實驗中同時分析25種不同組合而且同時降低了背景染色。實施例4為測試組合編碼技術在T細胞應答的大規模分析中的潛在價值，通過MHC肽交換 CToebes等，2006 ；Rodenko等，2006 ；Bakker等，2008)生成了一組含有一系列已知病毒和癌症相關的人MHC等位基因HLA-A1、-A2、-A3和_B7 (見表1)表位的25種不同的MHC多聚體。這些pMHC多聚體隨後各自與兩種螢光團偶聯生成表1所示的獨特編碼組。為能把組合編碼所得數據與傳統MHC多聚體分析相比較，這組25中不同pMHC多聚體也與PE偶聯。此外，為了確定組合編碼的背景，還製備了一組所有雙色組合的無關 pMHC多聚體。接下來，通過1).用包含pMHC多聚體的雙色編碼病毒和癌症表位的集合單次染色，2).用包含雙色編碼無關pMHC多聚體的混合物單次染色，3).用所有25種PE-標記的pMHC多聚體分25次染色，或4).用所有單獨的雙色編碼pMHC多聚體分25次染色，對來自健康供體的包含所有4種HLA等位基因的PBMC進行分析。『1』和『4』的比較是尤為感興趣的，因為其揭示了標記有相同螢光團的大量不相關 pMHC的同時存在或高pMHC濃度的存在是否影響背景信號。對於供體的HLA單倍型和對於這些供體中抗原特異性T細胞應答的先期分析，實驗都採用盲試形式進行。這些方法中3個供體的疾病/病原特異性T細胞應答揭示了 pMHC 多聚體的組合編碼使能在單個樣品中顯示多種抗原特異性T細胞群體(圖5-7)。重要的是，當通過大系列的獨立PE多聚體染色分析時在各供體中發現了相同的病毒特異性T細胞群體。此外，對PE-偶聯MHC多聚體的分別染色與用25中雙編碼MHC多聚體的多重染色的直接比較揭示了兩種方法在顯示抗原特異性T細胞群體時，在高頻率和低頻率T細胞群體的檢查中都具有高度相關性(圖8)。此外，對用雙色編碼pMHC多聚體的集合在一個樣品中染色和用同一組雙色編碼 pMHC多聚體經25次分別染色進行的PBMC染色所得數據的比較也顯示很高的相關性(圖 9)。後者的發現表明，通過與多組各自和不同的螢光團偶聯的MHC多聚體培育進行多重抗原特異性的同時測量是可行的，即使相同的螢光團和多個含有不同肽的MHC複合物相偶聯。因此，結果顯示在染色混合物中T細胞與多種無關pMHC複合物中任何種類的潛在交叉反應性不成問題。此外，這些發現表明，使用含有高濃度多聚體MHC分子的混合物不幹擾MHC多聚體染色。最後，採用雙色編碼pMHC組佔用疾病/病原相關表位所得信號與採用 25種無關MHC多聚體的集合所得的信號間的比較表明該方法的靈敏度高，且可以鑑別頻率低至0. 03%的⑶8陽性細胞的T細胞群體(圖5-7)。實施例5由於上述實驗證明了構想的組合編碼方法可用於在一個樣品中顯示多種T細胞群體，對其在表位鑑別中的潛在價值進行評估。最近在一次旨在鑑別潛在的HLA-A3相關黑色素瘤表位的篩選設定中，從4種不同的黑色素瘤相關蛋白中鑑別出22種具有高度HLA-A3結合親和性的肽。這組肽中包括所有 4種前文所述的HLA-A3相關表位，還有18種潛在的新型表位。
為解決篩選少量蛋白樣品以分析針對該組(潛在)表位的應答的可行性，通過所有22種表位和3種HLA-A3相關EBV和流感A衍生表位的肽交換生成了 MHC試劑。為了還能揭示低水平的T細胞應答，用含有可能的腫瘤相關表位的22種pMHC進行了一次基於 MACS的富集步驟，富集的細胞隨後被短期體外擴增。然後，在2-維編碼方案中將這25種不同的pMHC多聚體與2中螢光團偶聯並用於篩選從27位HLA-A3陽性的黑色素瘤患者中富集的PBMC。採用這一平行MHC多聚體染色方法，能證實針對前文所述的3種gplOO相關表位的T細胞應答的存在。此外，可觀察到針對一種此前未知的人gplOO衍生表位 (QLRALDGGNK)、針對2中此前未知的結節狀(Nodal)衍生表位(SLYRDPUR和HAYIQSLLK)、 針對一種此前未知的Tyrp2衍生表位(RMYNMVPFF)的⑶8+T細胞應答(表2)。重要的是，當以同樣方式分析來自10位健康的HLA-A3+供體的PBMC時，沒有在任何供體中觀察到應答，而兩組中針對病毒表位的T細胞應答是同等充足的(圖10)。為了確定觀察到的T細胞群體是否針對呈現相應肽的靶細胞顯示功能活性，來自不同患者PBMC的抗原特異性T細胞被分選並體外擴增。然後所得T細胞群體在與加載了肽的靶細胞培育後，用胞內細胞因子測定法測試其抗原特異性(圖11)。所有培養物與其關聯抗原培育時都顯示IFNgamma生產(圖11)。當T細胞培養物與未加載肽的細胞培育時，未觀察到應答。這些結果顯示，黑色素瘤患者中能觀察到針對前文所述高HLA-A3結合親和性肽的列表中所含至少8種黑色素瘤相關表位的T細胞應答，其中5種此前未見描述。此外，若沒有本發明所述抗原特異性的多色編碼提供的多重分析的可能性，就不可能用現有的患者材料進行篩選。Mrk本發明所述的組合編碼技術已證明是多重免疫應答的同時檢測和分析的有價值的工具。開發了能夠在單個樣品中平行檢測多種不同T細胞群體的組合編碼方案。用組合編碼檢測外周血中的抗原特異性T細胞與傳統的PE標記多聚體檢測相比同樣有效，但靈敏度顯著提高，而最重要的是，使得能用患者材料進行全面篩選。通過在黑色素瘤患者的外周血中分析針對已知和潛在的黑色素瘤相關抗原的T 細胞應答證明了用患者材料進行大規模篩選的可行性。這些篩選證實了針對已知T細胞表位的τ細胞應答的存在，並導致鑑別出多種針對HLA-A3的新型黑色素瘤相關T細胞應答。在此得出結論，肽-MHC偶聯的組合編碼使能在單個樣品中進行抗原特異性T細胞免疫的高通量分析。表1 :25種病毒和癌症衍生T細胞表位的列表。對各表位由所述螢光團組合編碼 MHC多聚體。
權利要求
1.一種檢測樣品中抗原響應細胞的方法，其包括-提供攜帶至少一種標記的抗原呈遞化合物，和兩種或兩種以上預定抗原，其中各抗原由至少兩種不同標記表示；-將所述含有抗原的抗原呈遞化合物與所述樣品接觸；-檢測所述加載抗原的抗原呈遞化合物與所述抗原響應細胞的結合，從而檢測對所述抗原的細胞響應；其中通過檢測由加載所述抗原的所述抗原呈遞化合物而結合在抗原響應細胞上的所述至少兩種不同標記的存在來檢測所述抗原。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述兩種或兩種以上預定的抗原選自3種或 3種以上、4種或4種以上、5種或5種以上、6種或6種以上、7種或7種以上、8種或8種以上、10種或10種以上、11種或11種以上、11種或11種以上、12種或12種以上、13種或13 種以上、14種或14種以上、15種或15種以上、16種或16種以上、17種或17種以上、18種或18種以上、19種或19種以上、20種或20種以上、20種或20種以上、21種或21種以上、 22種或22種以上、23種或23種以上、24種或24種以上、25種或25種以上、26種或26種以上、27種或27種以上、觀種或28種以上組成的組。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述抗原呈遞化合物提供有一種標記， 且所述抗原由至少兩種帶不同標記的抗原呈遞化合物表示、或編碼。
4.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述抗原呈遞化合物提供有至少兩種不同的標記，且所述抗原由一種帶標記的抗原呈遞化合物表示、或編碼。
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其特徵在於，所述抗原是肽。
6.如權利要求1-5中任一項所述的方法，其特徵在於，所述抗原呈遞化合物是主要組織相容性複合抗體(MHC)。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述主要組織相容性複合抗體(MHC)是多聚體主要組織相容性複合抗體(MHC)，優選含有至少4個單體。
8.如權利要求1-7中任一項所述的方法，其特徵在於，所述抗原響應細胞是T細胞和/ 或B細胞。
9.如權利要求1-8中任一項所述的方法，其特徵在於，所述標記是螢光標記。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述螢光標記包括qDots。
11.如權利要求1-10中任一項所述的方法，其特徵在於，所述不同標記的數量選自3種或3種以上、4種或4種以上、5種或5種以上、6種或6種以上、7種或7種以上、和8種或 8種以上。
12.如權利要求1-11中任一項所述的方法，其特徵在於，所述抗原由至少三種或至少四種不同的標記表示。
13.如權利要求1-12中任一項所述的方法，其特徵在於，所述樣品是血液樣品或者血液衍生樣品。
14.如權利要求1-13中任一項所述的方法，其特徵在於，所述檢測包括流式細胞術。
15.如權利要求1-14中任一項定義的表示單個抗原的至少兩種標記在檢測樣品中抗原響應細胞中的應用。
16.權利要求1-14中任一項所述的方法在診斷疾病或病症，優選癌症，中的應用。
17.權利要求1-14中任一項所述的方法在開發免疫治療中的應用。
18.權利要求1-14中任一項所述的方法在開發疫苗中的應用。
19.權利要求1-14中任一項所述的方法在鑑別表位中的應用。
20.一種檢測配體與細胞或細胞結合受體的結合的方法，其包括用權利要求1-14中任一項所定義的至少兩種標記去標記所述配體。
21.HLA-A3 相關T 細胞抗原，其選自下組QLRALDGGNK、SLYRDPLPR、HAYIQSLLK、 RMYNMVPFF 和 GTYEGLLRR。
22.如權利要求21所述的HLA-A3相關T細胞抗原、或其功能性衍生物在監控免疫治療和疫苗中的應用。
23.如權利要求21所述的HLA-A3相關T細胞抗原、或其功能性衍生物在開發免疫治療和疫苗中的應用。
全文摘要
本發明涉及利用多維標記抗原呈遞化合物，例如抗原-主要組織相容性複合抗體(MHC)以檢測樣品中抗原響應細胞的方法。此外，本發明涉及利用該多維標記抗原呈遞化合物，例如抗原-主要組織相容性複合抗體(MHC)在樣品，優選單一樣品，例如血液樣品中檢測抗原響應細胞的應用。本發明的方法能實現特定抗原響應細胞，例如T和B細胞的高通量分析，從而提供了例如疾病或病症的監控以及免疫治療、疫苗的研發、或表位或免疫原性胺基酸序列的鑑別的高通量方法。
文檔編號G01N33/569GK102341410SQ200880132338
公開日2012年2月1日 申請日期2008年11月3日 優先權日2008年11月3日
發明者A·H·巴克, A·N·M·舒馬赫, C·Y·J·舒, S·R·哈德魯普 申請人:桑奎因血液基金會, 荷蘭癌症研究基金會