一種pcr螢光分子信標探針技術定量檢測人類白細胞抗原b27基因的方法
2023-09-16 09:33:00 4
專利名稱：一種pcr螢光分子信標探針技術定量檢測人類白細胞抗原b27基因的方法
技術領域：
本發明涉及一種人類白細胞抗原B27(HLA-B27)基因的定量檢測技術，具體地說， 是一種通過內參標準品實現靶基因定量的PCR螢光分子信標探針定量檢測技術在HLA-B27 基因檢測方面的應用。
背景技術：
強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis, AS)及其相關的血清陰性脊柱關節病 (Spondyloarthropathies, SpA)是一組與免疫學密切相關的疾病，其免疫與遺傳發病機制 至今不明。SpA是一類疾病，包括:AS、反應型關節炎(ReA)、銀屑病關節炎(PsA)、腸炎性關 節炎(IBDA)、瑞特症候群(舊)和未分化脊柱關節病(USpA)。它們具有如下一些共同特點 ①以HLA-B27為主要遺傳易感因子；②以肌腱-骨附著點炎症和滑膜炎為基本的病理改變； ③常常累及骶髂關節、脊椎和各大關節；④類風溼因子陰性；⑤可進行性發展至脊柱強直、 關節強直。AS是典型的SpA病例，以中軸關節慢性炎症為主，多發於青壯年男性，主要侵犯 人體骶髂關節、脊柱骨突、脊柱旁軟組織及外周關節，也可累及內臟及其他組織，嚴重者可 發生脊柱畸形和關節強直，喪失勞動力。AS起病隱匿、病程長、遷延不愈、致殘率高，在中國 人群中的發病率約為0.3%。因此，我國約有400萬患者。約有10%的AS患者在幼年發病， 稱為幼年型AS，其早期臨床表現主要以外周關節為主，表現為下肢或上肢關節腫脹、壓痛、 活動受限等症狀，與類風溼關節炎、風溼性關節炎等疾病的表現相似，容易引起誤診。近30年的研究表明，AS在免疫醫學領域與人類白細胞抗原B27(HLA_B27)密切 相關。流行病學調查顯示，HLA-B27陽性率在AS患者高達96%以上，而正常人群中僅為
-5%。但HLA-B27與AS的致病機理的關係目前並不十分清楚，一種觀點認為可能是 HLA-B27分子和一些自身肽段結合，形成肽-HLA複合體在自身細胞膜上表達後，能被相應 的CD4+T細胞識別，從而導致T細胞對自身靶細胞的殺傷，造成組織變性、器官受損。另一 種觀點認為是多重因子交互影響，其中基因與環境因素(如細菌感染)扮演重要角色。國 外研究發現動物脊柱受累程度與轉化的HLA-B27基因數量有關，故HLA-B27的基因型與AS 的發病風險和病情關係密切。純合子每個細胞有兩個HLA-B27基因，發病風險更高，病情更 重。雜合子每個細胞只有一個HLA-B27基因，發病風險相對較低，病情也更輕。因此，定量 檢測HLA-B27基因，區分純合子與雜合子，是臨床預測和診斷AS及其相關的SpA最有效的 方法。以往臨床上多採用免疫學分型方法檢測HLA-B27，需要採取較多新鮮血液並分 離白細胞，然後採用ELISA方法或流式細胞儀檢測，整個操作時間長，而且要高質量的 HLA-B27抗體，價格較貴，細胞保存時間短，不便操作，不易普及。此外，HLA-B27與其他的 HLA-B族抗原之間只有很小的差異，免疫學檢測存在較高的交叉反應，假陽性率較高，影響 檢測的準確性。因此，免疫學檢測方法已經逐漸被基因檢測方法取代。目前臨床上HLA-B27的基因檢測方法主要有序列特異性引物PCR(PCR-SSP)法和PCR序列特異性寡核苷酸探針(PCR-SSO)法。PCR-SSP法是針對HLA-B27基因的特異性序 列，設計序列特異性引物，特異性引物與HLA-B27完全互補，然後用此特異性引物擴增一段 HLA-B27特異性序列。在一定條件下，只有有HLA-B27基因的個體才能擴增出目的片段，而 其他HLA I類抗原基因因不能與特異性引物完全互補，無目的擴增產物，結果呈陰性。此法 除引物設計講究外，與普通的PCR反應沒有實質性差別，檢測的準確性不夠高，容易出現假 陽性和假陰性結果。PCR-SSO是用通用引物PCR擴增出目的產物後，再用HLA-B27序列特異 性探針和通用探針檢測PCR擴張產物中是否含有HLA-B27特異性序列。此法比PCR-SSP檢 測的準確性更高，可部分避免假陽性結果。但此法需要較長的檢測時間，整個操作複雜，不 利於大批量樣品檢測。Tyagi和Krammer於1996年設計了一種可以特異性識別核酸序列的新型螢光探 針，這種螢光探針通過與核酸靶分子進行雜交後發生構象的變化而發出螢光，他們將其命 名為分子信標(Molecular Beacon)。分子信標具有背景信號低，靈敏度高、特異識別性強、 操作簡單，不必與未反應的探針分離即可實時檢測，可用於活體分析等優點，在生物化學分 析，生物醫學研究和臨床診斷中有著廣泛的應用價值。當無靶序列存在時，螢光信標呈莖環 結構，莖部的螢光分子與淬滅分子非常接近，螢光分子發出的螢光被淬滅分子吸收並以熱 能的形式散發，此時檢測不到螢光信號；當有靶序列存在時，螢光信標探針的環序列與靶序 列特異性結合，形成的雙鏈體比分子信標的莖環結構更穩定，螢光分子與淬滅分子分開，此 時螢光分子發出的螢光不能被淬滅分子吸收，可以檢測到螢光(見附圖)。本發明是基於熒 光分子信標探針設計的HLA-B27基因的定量檢測技術。參考文獻[1]劉春明，彭媛.強直性脊柱炎與HLA-B27關係的研究.廣西醫學，2005，27 (4) 550-552[2]陳國敏，王東辰.人白細胞抗原-B27在診斷強直性脊柱炎中的意義.檢驗醫 學與臨床，2007，4 (10) 931-933[3]Brown M, Kennedy L, Mae A, et al. Susceptibility to ankylosing spondylitis in twins :therole of genes,HLA and enviroment. Arthritis Rheum,1997, 40(10) 1823-1828[4]Sayer C, Cassell S, Christiansen T. HLA-B27typing by specific amplification without DNAextraction. Mol Pathol,1999,52(5) :300_304[5]Lee H, Choi J, Yoon Y, et al. Quantitative analysis of HLA-B27by flow cytomeyry using CD3gating in seronegative spondy!arthropathies. Clin Exo Rheumatol,1999,17(2) :191_195[6]李維.強直性脊柱炎與HLA-B27.國外醫學臨床生物化學與檢驗分冊，2002， 12(4) 235-238.[7]Khan Ma. Update the twenty subtypes of HLA-B27. Curr Opin Rheumatol, 2000，12 (4) 235-238[8]胡志東，王金良.強直性脊柱炎實驗室診斷的研究進展.醫學綜述，2008， 14(11) 1678-1681[9]黃烽，楊春花.強直性脊柱炎臨床及免疫發病機制的研究進展.中國免疫學雜誌，2001，17(6) :281-285[10]楊柚巖，丁建新.未分化脊柱關節病的診斷與治療.臨床內科雜誌，2003， 20(10) :510-51
發明內容
本發明目的是克服上述已有的HLA-B27蛋白或基因檢測方法缺陷，提供一種以 HLA-B27基因為檢測目標的PCR螢光分子信標探針定量檢測技術，通過內參標準品定量，實 現HLA-B27基因的靈敏、準確、快速定量檢測。實現上述目的的具體方案是本發明涉及的PCR螢光分子信標探針技術定量檢測人類白細胞抗原B27基因的方 法，包括以下步驟a、在HLA-B27基因中選擇一段小於150bp的片段做為靶序列，合成一對引物；b、根據靶序列中位於兩個引物之間的序列，設計合成一個螢光分子信標探針，其 淬滅基團為DABCYL，螢光基團為FAM ；C、構建一個引物與靶序列完全相同、片段長度與靶序列長度相似，但序列內容與 靶序列不同的內參標準品。並根據內參標準品的序列，設計合成一個螢光分子信標探針，其 淬滅基團為DABCYL，螢光基團為R0X。d、提取待測標本中的DNA，使用步驟a中的引物、步驟b中的探針、步驟c中的內參 標準品及其探針，與其它PCR反應體系成分混合，進行PCR反應，擴增靶基因片段和內參標 準品片段。e、分別檢測反應結束後的FAM和ROX螢光值。根據各自外標曲線計算靶序列和內 參標準品的反應終拷貝數。f、根據內參標準品的起始拷貝數和反應終拷貝數計算PCR擴增效率，根據靶序列 的終拷貝數和PCR擴增效率計算靶序列的起始拷貝數。本發明方法的PCR反應體系與常規PCR反應體系類似，包括高溫聚合酶、dNTPs、緩 衝體系、引物、模板和探針。靶序列(Seq1)為1 TTCCCTTCCT TTCCCAGAGC CGTCTTCCCA GTCCACCGTC CCCATCGTGG51 GCATTGTTGC TGGCCTGGCT GTCCTAGCAG TTGTGGTCAT CGGAGCTGTG101 GTCGCTGCTG TGATGTGTAG GAGGAAGAGC TCAGGTAGGG AA引物序列為引物 l(Seq 2) :5，TTC CCT TCC TTT CCC AGA G3，引物 2 (Seq 3) :5，TTC CCT ACC TGA GCT CTT CCT3，靶序列螢光分子信標探針序列(Seq 4)為5' CAG GCT CGT TGT GGT CAT CGG AGC TGT GGT GAG CCT G3，內參標準品核酸序列(Seq 5)為1 TTCCCTTCCT TTCCCAGAGC GTACCACTGG CATCGTGATG GACTCCGGTG51 ACGGGGTCAC CCACACTGTG CCCATCTACG AGGGGTATGC CCTCCCCCAT101 GCCATCCTGC GTCTGGACCT GAGGAAGAGC TCAGGTAGGG AA
內參標準品螢光分子信標探針序列(Seq 6)為5' CAG GCT CCC CAC ACT GTG CCC ATC TAC GAG AGC CTG3，外標曲線是指採用一系列濃度已知的陽性DNA片段，與其螢光分子信標探針雜 交，檢測螢光值，根據螢光值和DNA片段濃度繪製的標準曲線。本發明方法的PCR反應體系可選用重蒸水做為陰性質控。本發明方法使用的儀器為普通常規PCR儀，如果PCR儀有加熱蓋，則PCR反應體系 可無需使用覆蓋劑，否則，最好用與水不相容的油性覆蓋劑(如石蠟、礦物油等)覆蓋。本發明中PCR反應時三步法PCR，包括變性、退火和延伸三步。變性的溫度是94°C， 時間為10秒；退火的溫度是50°C，時間為10秒；延伸的溫度是72°C，時間為10秒。進行 30次循環。本發明中，FAM螢光激發光採用波長494nm的單色光，FAM檢測波長為522nm ；ROX 螢光激發光採用波長588nm的單色光，ROX檢測波長為608nm。本發明可定量的HLA-B27基因的核酸起始拷貝數範圍為IO3拷貝/ml-1011拷貝/ ml ο本發明是針對AS及其相關的SpA疾病臨床診斷而設計，具有快速準確、靈敏特異 等特點。突出特點在於使用了內參標準品在同一反應體系內擴增，通過計算內標的擴增效 率來計算樣品中的靶序列起始拷貝數，同時外標曲線採用不經PCR反應的系列陽性DNA片 段，內外標聯用可避免實驗操作或擴增效率不同而引起的誤差。使用本發明的有益效果是， 可以快速準確、靈敏特異的檢測出AS及其相關的SpA疾病相關基因，並且對其定量，故可判 斷出患者是否HLA-B27基因陽性純合子，對其發病風險和病情輕重做出預測。檢測手段採 用PCR方法，靈敏度高，低至1拷貝核酸也可檢出；螢光分子信標探針具有莖環狀結構，檢測 特異性極高，對靶序列中單個鹼基的錯配、缺失或插入突變均能檢測出來；內標的定量範圍 可達IO3拷貝/ml-1011拷貝/ml ；反應與檢測直接在封閉體系中進行，有效消除核酸交叉汙 染；可以進行大規模自動化檢測，無需實時定量，對儀器設備要求低，可在各級醫療機構推 廣使用。
附圖是螢光分子信標探針核酸檢測原理圖。當無靶序列存在時，螢光信標呈莖環 結構，莖部的螢光分子與淬滅分子非常接近，螢光分子發出的螢光被淬滅分子吸收並以熱 能的形式散發，此時檢測不到螢光信號；當有靶序列存在時，螢光分子信標探針的環序列與 靶序列特異性結合，形成的雙鏈體比分子信標的莖環結構更穩定，螢光分子與淬滅分子分 開，此時螢光分子發出的螢光不能被淬滅分子吸收，可以檢測到螢光。待測樣品中靶序列拷 貝數越多，螢光信號越強。
具體實施例方式實例一、白細胞抗原B27基因(HLA-B27)測定試劑盒(PCR螢光分子信標法)1、白細胞抗原B27基因(HLA-B27)測定試劑盒(PCR螢光分子信標法)的組成(1)靶序列為HLA-27基因的相對保守區——第5外顯子及其前後DNA序列共 142bp。螢光分子信標探針位於一對引物之間區域。
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引物序列為引物 l(Seq 2) :5，TTC CCT TCC TTT CCC AGA G3，引物 2 (Seq 3) :5，TTC CCT ACC TGA GCT CTT CCT3，靶序列螢光分子信標探針序列(Seq 4)為5' CAG GCT CGT TGT GGT CAT CGG AGC TGT GGT GAG CCT G3，(2)內參標準品的構建過程如下首先將靶序列擴增出來，插入質粒pBluSKM的HindIII和I^stI位點之間，得到質 粒pBluSKM-HLAB27。然後將人類β-Actin基因第4外顯子部分DNA序列(102bp)擴增 出來，替換質粒pBluSKM = HLAB27靶序列中20 = 121的片段，得到內參標準品一質粒 pBluSKM—betaactin。內參標準品螢光分子信標探針序列(Seq 6)為5' CAG GCT CGT TGT GGT CAT CGG AGC TGT GGT GAG CCT G3，內參標準品(質粒pBluSKM_HLAB27)起始濃度為IO3拷貝/ml。(3)試劑盒的配製過程如下配製5XBuffer(50mM ρΗ8· 0Tris_HCl、20mM MgCl2,250mM KC1、0. 5% BSA)，再配 成PCR反應液每人份反應液模板0. 5 μ 1引物1，2各 0·5μ1螢光分子信標探針0. 5 μ 1dNTPs5 μ 1Taq 酶(IOU)5μ 15 X Buffer10 μ 1ddH2028 μ 1_總量50 μ 1(4)外標曲線繪製過程如下繪製靶序列外標曲線採用質粒pBluSKM_HLAB27做為靶序列的外標。配置濃度梯 度為 IO3拷貝 /ml、IO5拷貝 /ml、IO7拷貝 /ml、IO9拷貝 /ml、IO11 拷貝 /ml 的pBluSKM_HLAB27， 與靶序列螢光分子信標探針雜交，494nm激發，522nm檢測FAM螢光值，繪製標準曲線並存儲。繪製內參標準品外標曲線採用質粒pBluSKM-betaactin做為靶序列的外標。 配置濃度梯度為IO3拷貝/ml、105拷貝/ml、107拷貝/ml、109拷貝/mlUO11拷貝/ml的 pBluSKM-betaactin，與內參標準品螢光分子信標探針雜交，588nm激發，608nm檢測ROX熒 光值，繪製標準曲線並存儲。2、使用白細胞抗原B27基因(HLA-B27)測定試劑盒(PCR螢光分子信標法)進行 檢測以體積從大至小的順序，向PCR反應管中加入^μ 1 ddH20,10 μ 1 5 X Buffer, 5μ 1 dNTPs,5y 1 Taq 酶(IOU)，0· 5μ 1 引物 1，0. 5 μ 1 引物 2，0. 5 μ 1 螢光分子信標探針，0.5μ1待測基因組DNA樣品。用移液器吹打混勻4-6次，放入PCR儀。採用以下程序進行 PCR反應
權利要求
1.一種以人類白細胞抗原B27(HLA-B27)基因為檢測目標的PCR螢光分子信標探針定 量檢測技術，包括以下步驟a、在HLA-B27基因中選擇一段小於150bp的片段做為靶序列，合成一對引物；b、根據靶序列中位於兩個引物之間的序列，設計合成一個螢光分子信標探針，其淬滅 基團為DABCYL，螢光基團為FAM ；c、構建一個引物與靶序列完全相同、片段長度與靶序列長度相似，但序列內容與靶序 列不同的內參標準品。並根據內參標準品的序列，設計合成一個螢光分子信標探針，其淬滅 基團為DABCYL，螢光基團為R0X。d、提取待測標本中的DNA，使用步驟a中的引物、步驟b中的探針、步驟c中的內參標準 品及其探針，與其它PCR反應體系成分混合，進行PCR反應，擴增靶基因片段和內參標準品 片段。e、分別檢測反應結束後的FAM和ROX螢光值，根據各自外標曲線計算靶序列和內參標 準品的反應終拷貝數。f、根據內參標準品的起始拷貝數和反應終拷貝數計算PCR擴增效率，根據靶序列的終 拷貝數和PCR擴增效率計算靶序列的起始拷貝數。
2.權利要求1所述的PCR螢光分子信標探針定量檢測技術，其特徵在於所述的待測核 酸為人類白細胞抗原B27基因第5外顯子及其前後DNA序列共142bp。所述的特異性核酸序列(Seq 1)為1 TTCCCTTCCT TTCCCAGAGC CGTCTTCCCA GTCCACCGTC CCCATCGTGG 51 GCATTGTTGC TGGCCTGGCT GTCCTAGCAG TTGTGGTCAT CGGAGCTGTG 101 GTCGCTGCTG TGATGTGTAG GAGGAAGAGC TCAGGTAGGG AA 所述的引物序列為引物 l(Seq 2) :5，TTC CCT TCC TTT CCC AGA G 3， 引物 2 (Seq 3) :5，TTC CCTACC TGAGCT CTT CCT 3， 所述的螢光分子信標探針序列(Seq 4)為 5' CAG GCT CGT TGT GGT CAT CGG AGC TGT GGT GAG CCT G 3'
3.權利要求l.c所述的內參標準品，其特徵在於所述的核酸為人類β-Actin基因第4 外顯子部分DNA序列與權力要求2所述的引物序列構建的片段，共142bp。所述的內參標準品核酸序列(Seq 5)為1 TTCCCTTCCT TTCCCAGAGC GTACCACTGG CATCGTGATG GACTCCGGTG 51 ACGGGGTCAC CCACACTGTG CCCATCTACG AGGGGTATGC CCTCCCCCAT 101 GCCATCCTGC GTCTGGACCT GAGGAAGAGC TCAGGTAGGG AA 所述的內參標準品螢光分子信標探針序列(Seq 6)為 5' CAG GCT CCC CAC ACT GTG CCC ATC TAC GAG AGC CTG 3'
4.權利要求1所述的PCR螢光分子信標探針定量檢測技術在血細胞、組織細胞、人體液 中脫落細胞等各種樣本的檢測。
全文摘要
一種人類白細胞抗原B27(HLA-B27)基因的定量檢測技術，其特徵是以HLA-B27基因為檢測目標，應用PCR螢光分子信標探針定量檢測技術，檢測反應終螢光強度，在外標曲線上讀出內參標準品和待測樣品的PCR反應終濃度。通過計算內參標準品的擴增效率，來定量待測樣品的起始拷貝數，實現HLA-B27基因的靈敏、準確、快速定量檢測。可應用於強直性脊柱炎(AS)及其相關的血清陰性脊柱關節病(SpA)的臨床診斷和風險預測。
文檔編號G01N21/64GK102115784SQ20101000156
公開日2011年7月6日 申請日期2010年1月4日 優先權日2010年1月4日
發明者王虹 申請人:王虹