表達豬肺炎支原體p65蛋白的減毒豬霍亂沙門氏菌的構建與應用的製作方法

2023-09-16 07:51:35 1

專利名稱：表達豬肺炎支原體p65蛋白的減毒豬霍亂沙門氏菌的構建與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於動物細菌基因工程技術領域，具體涉及一種不含抗性標記的表達豬肺炎支原體膜蛋白P65基因的重組豬霍亂沙門氏菌活疫苗菌株及應用。
背景技術：
沙門氏菌作為活疫苗載體能夠攜帶多種細菌、病毒或寄生蟲的免疫原性基因，從而成為沙門氏菌病和其它疾病的多價重組基因工程活疫苗。近幾十年來，以減毒沙門氏菌作為活疫苗表達載體的研究受到廣泛的關注。其中，利用基因工程方法致弱的沙門氏菌作為活細菌載體來表達外源基因，已廣泛應用於腫瘤、病毒病、細菌病以及寄生蟲病等的疫苗 研究。沙門氏菌作為疫苗載體已經受到醫學與獸醫學的廣泛重視。其主要優點是沙門氏菌可採用口服或滴鼻等黏膜途徑進行免疫，操作方便，對接種對象的刺激小，同時能夠將質粒DNA特異性地傳遞入巨噬細胞、樹突狀細胞等抗原遞呈細胞，從而有效激發相應的體液與細胞免疫應答[1]。此外，沙門氏菌為胞內寄生菌，其在激發抗沙門氏菌免疫反應的同時，誘導產生針對外源蛋白的特異性體液與細胞免疫反應，並同時誘導黏膜免疫與全身免疫。因此，減毒沙門氏菌既可以作為針對同源抗原的活疫苗，也可以作為誘導針對其他病原微生物產生保護性反應DNA疫苗的載體[2]。鑑於此，以減毒沙門氏菌作為黏膜免疫用的基因工程活疫苗表達載體具有無可比擬的優越性。另外，沙門氏菌載體本身具有免疫佐劑的作用[3]，其LPS作為一種內在佐劑，可以刺激宿主細胞釋放各種細胞因子。減毒沙門氏菌保留侵襲力，可穿過黏膜組織，侵入黏膜局部相關淋巴結和脾、肝、腎等處的淋巴組織，並在侵入部位表達外源抗原，從而不僅局部黏膜產生SIgA，也激發全身性的體液和細胞免疫。以減毒沙門氏菌為載體進行黏膜免疫，是一種繼傳統的滅活與減毒疫苗後新的免疫方式，它能呈遞多種抗原，在多處黏膜產生免疫作用，並引發全身性的體液和細胞免疫。與其它活疫苗載體相比，致弱沙門氏菌載體還具有培養簡便、繁殖迅速、製備和使用方便、免疫原性強、經濟等優點。重組胞內寄生菌經口服或注射免疫後，可通過細菌感染的方式將質粒DNA直接導入諸如巨噬細胞、樹突狀細胞等專職遞呈細胞，被運送至相關黏膜和淋巴組織，誘導細胞免疫和體液免疫反應tt]，同時獲得對載體菌的免疫。減毒沙門氏菌經口服途徑免疫小鼠，不僅安全、高效，而且可激發產生黏膜反應，對同源病原和異源病原均表現出良好的保護力[5]。豬霍亂沙門氏菌C500是在含醋酸鉈的培養基中傳500代後致弱的具有良好免疫原性的菌株，實踐也證明C500株具有免疫原性好，能激活全身、局部和遠端黏膜免疫系統的免疫作用，且有副作用低，安全性好的特點te]。其中，效果最穩定應用最多的是沙門氏菌Asd+平衡致死系統。華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室徐引弟等構建C500株的asd基因缺失株AasdC500，經實驗證實A asdC500缺失株進一步降低了 C500的毒力，增強了疫苗的安全性。
豬支原體肺炎又稱豬喘氣病或豬地方流行性肺炎，分布十分廣泛，以慢性、接觸性、高度傳染性、高發病率以及低死亡率等為特點，主要表現為咳嗽和呼吸困難，解剖可見肺組織呈肉變或者大理石樣病變。豬肺炎支 原體是豬呼吸道疾病症候群的重要病原之一，可繼發感染PRRSV、PCV2等，從而導致多種疫苗的接種失敗。豬肺炎支原體可經空氣傳播，此外還易與其他細菌性疾病如豬肺疫、傳染性胸膜肺炎等並發，對養豬業造成重大的經濟損失，是當前最常發生、最廣流行、最難淨化的重要疫病之一。這主要是因為豬肺炎支原體能夠穿透黏膜層與纖毛粘在一起，破壞纖毛的完整性，並分泌一些有害因子，從而改變纖毛的遊走性，致使纖毛大量脫落，這為其它細菌和病毒的入侵創造了條件，致使損失加劇。豬肺炎支原體能在豬肺中長期滯留，治療效果不佳，雖然該病引起的死亡率不高，但是流行的廣泛性所造成的經濟損失仍然是巨大的。據報導，豬肺炎支原體表面具有纖毛黏附因子，其感染豬的呼吸道後，能與黏膜上皮細胞纖維發生特異性結合，使豬肺炎支原體能夠附殖並造成致病性。Raznis (1983)研究發現，豬肺炎支原體的致病力及免疫原性都與其細胞膜上的膜蛋白有關。Gear S J等(1985)從豬肺炎支原體菌株VPPll的細胞膜中分離得到了一種致病蛋白因子，發現其具有明顯的免疫原性，並證實細胞膜蛋白是導致豬患豬支原體肺炎的主要因素。Jody L W後來也證實這一點。衣阿華大學Ross研究發現，豬肺炎支原體感染後淋巴細胞產生抗體的能力下降，細胞免疫力下降，肺泡巨噬細胞對病原的吞噬和清除能力亦下降，抑制性T細胞的活動增強，導致呼吸道免疫力減弱，抗病力下降，從而使其它病原體更容易侵入。對標準菌株和野外分離菌株的抗原分析表明，支原體肺炎含有幾種主要免疫原即胞內具LDH活性的蛋白(p36)，3種膜蛋白(p46、p65和p70)和粘附素(p97)。這些蛋白在急性或者初次感染肺炎支原體後，可刺激產生早期和特異抗體。M F Kim等研究發現，p65蛋白是豬肺炎支原體的一個重要的免疫原，它的碳端是其主要的抗原區m。P65蛋白是一種解脂酶(lipoiytic enzyme),是豬肺炎支原體主要的具免疫原性的表面蛋白即膜蛋白之一 [8]，其功能可能是損害肺組織中表面活性劑，即一種由脂蛋白組成的物質，是由肺部的肺泡細胞分泌的，可以通過減小肺部表面的液體表面張力來維持肺組織的穩定性[9]，還可以觸發急性或首次感染豬肺炎支原體的斷奶仔豬及生長豬的早期免疫應答。P65蛋白序列中也有I個TGA密碼子，需要進行定點突變才能在大腸桿菌中表達。K. Cheikh Saad Bouh等將p46基因和p65基因克隆到載體上，並在大腸桿菌中對其進行原核表達，收穫表達產物並對其進行復性後免疫BALB/c小鼠，從而獲得相應的單克隆抗體，並對該單克隆抗體進行了交叉反應的研究，結果顯示該蛋白具有很高的種間保守性和特異性[1°]。傳統上，一般用抗生素對其進行控制。然而，隨著耐藥株的普遍增多，豬再次感染肺炎支原體的機率也就增加。因此，除了使用抗生素和採用良好的動物管理程序，通過疫苗來防治豬支原體肺炎也是必要的。但由於早期檢測的困難和缺乏有效的藥物，豬支原體肺炎在控制方面至今未達到令人滿意的效果。目前，國內外預防豬支原體肺炎的疫苗主要是弱毒苗、滅活苗以及基因工程疫苗。然而進口的滅活苗成本較高，國內的弱毒疫苗雖然免疫效果較好，但需要進行胸腔接種，操作不方便，並且對已發病的豬群不能注射該疫苗，而近年來興起的基因工程疫苗大都處於實驗室研究階段，尚未在臨床得以廣泛使用。黏膜免疫系統在抗原刺激後可產生黏膜免疫應答和體液免疫應答，而滅活疫苗免疫只能誘導體液免疫應答，不能激活黏膜免疫系統，即使有較高的血清抗體滴度，仍不能阻止病原經黏膜入侵體內。由於黏膜表面與外界抗原直接接觸，是機體抵抗病原微生物入侵的第一道防線，且絕大部分機體感染的主要途徑是消化道、呼吸道等黏膜系統，因而黏膜免疫在抵抗感染方面具有極其重要的作用。目前使用的黏膜免疫的疫苗中飲水的疫苗容易被消化道降解，抗原的吸收效率低，滴在鼻腔內半清除時間僅15min，致使疫苗不能有效進入機體激發有效的黏膜免疫，尋求高效 的黏膜免疫疫苗已成為目前疫苗研究的熱點。鑑於減毒沙門氏菌作為疫苗載體具有運送效率高，免疫方法簡單，免疫效果較好，能同時激發全身免疫和局部黏膜免疫等優點，有著良好的應用前景。1990年翁仲男研究表明，豬支原體肺炎疫苗經腸道免疫後，受抗原刺激所產生的抗體可經循環系統移至呼吸道，證實消化道與呼吸道之間的黏膜免疫機制是相通的。因此，豬支原體肺炎基因工程活疫苗採用口服方式刺激腸道免疫產生的抗體可通過黏膜移至呼吸道，從而抵禦呼吸道疾病病原入侵，起到預防保護作用。因此，開發更加安全、高效、廉價的新型疫苗是世界養豬業的迫切需要。重組沙門氏菌活疫苗自然感染或試驗感染，誘導抗任何異源血清型沙門氏菌保護的同時，沙門氏菌因侵入淋巴系統，能夠更有效地激發宿主產生針對異源抗原的體液和細胞免疫反應。這樣，重組弱毒活疫苗也許是解決當前豬支原體肺炎商品化疫苗不足之處的一種可行方法。構建重組沙門氏菌株的傳統方法存在很多缺陷；如以前普遍採用攜帶抗性基因的表達質粒，因存在生物安全問題而不被人們所接受。asd質粒載體平衡致死系統具有表達量高、外源基因表達穩定、不需純化以及無抗生素抗性標記等優點，同時鑑於豬霍亂沙門氏菌C500的良好免疫原性，將其開發為表達豬支原體肺炎主要免疫原性膜蛋白的重組活疫苗具有廣闊的應用前景。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術存在的缺陷，其第一個目的是獲得表達豬肺炎支原體的主要免疫原性膜蛋白-P65蛋白的重組減毒豬霍亂沙門氏菌C500 (pYA-65)，該重組菌株P65蛋白基因中一個編碼色氨酸的TGA密碼子已定點突變為TGG，以便於該蛋白的原核表達。本發明的第二個目的是利用上述豬霍亂沙門氏菌C500(pYA_65)獲得一種以減毒豬霍亂沙門氏菌製備的豬霍亂沙門氏菌和豬支原體肺炎二價基因工程活疫苗。本發明的第三個目的是上述的豬霍亂沙門氏菌C500 (pYA-65)在製備豬霍亂沙門氏菌和豬支原體肺炎二價基因工程活疫苗中的應用。本發明通過以下技術方案實現申請人:通過基因工程的方法，獲得一株表達豬支原體肺炎主要免疫原性膜蛋白-p65蛋白的重組減毒的豬霍亂沙門氏菌(Salmonella choleraesuis) C500 (pYA-65),於2011年4月2日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號為CCTCC NO M2011107o申請人:提供了一種重組減毒的豬霍亂沙門氏菌C500 (pYA-65)的製備方法，它包括下列步驟I)構建重組質粒pGEX-65 :用一對引物擴增豬肺炎支原體膜蛋白_p65蛋白的基因片斷，將其亞克隆至原核表達載體pGEX-KG，構建重組質粒pGEX-65。所用引物對核苷酸序列如下所示if 向引物AAAGGATCCATGGCAAAAGAA(5' —3')，反向引物CCCAAGCTTAATCCTGCTTGA(5' — 3')；2)利用一對引物將豬肺炎支原體的p65蛋白基因片斷633bp處的鹼基A定點突變為鹼基G，所用引物對的核苷酸序列如下所示

正向引物CCCTTGTAAATTGGCTTGTTAAA(5' — 3')，反向引物CCCCCAATTTACAATTTCATTAT(5' — 3')；3)構建重組質粒pYA-65 :將上述突變正確的p65基因片段以重組質粒pGEX_65為模板，用一對引物進行擴增並回收，酶切後連接質粒PYA3493，轉化x7213篩選陽性克隆，所得的陽性質粒電轉化至豬霍亂沙門氏菌C500 A crp A asd缺失株，從而得到保藏編號為CCTCC NO M2011107的豬霍亂沙門氏菌C500 (pYA_65)。所用引物對的核苷酸序列如下所示if 向引物AAAGTCGACCATGGCAAAAGAA(5' —3')，反向引物CCCAAGCTTAATCCTGCTTGA(5' — 3')。申請人:獲得一種能原核表達豬支原體肺炎主要免疫原性膜蛋白p65蛋白的基因片段，將其序列中633bp的鹼基A定點突變為G，p65蛋白的基因片段的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO 1 所示。申請人:利用所述重組減毒的豬霍亂沙門氏菌C500 (pYA-65)的菌液和明膠成功製備一種防治豬霍亂沙門氏菌和豬肺炎支原體二價基因工程疫苗。上述的不含抗性標記表達豬肺炎支原體主要免疫原膜蛋白_p65蛋白的重組減毒的豬霍亂沙門氏菌株缺失了沙門氏菌株基因組中必需的細胞壁形成相關基因asd基因(GenBank號AE008863)(需要含asd基因的質粒存在於菌體內或外源添加DAP的培養基上才能夠正常生長和繁殖)，同時該重組菌株含有外源質粒PYA-65 (含有asd基因)。豬霍亂沙門氏菌C500 (pYA-65)保留了親本菌株C500作為豬霍亂沙門氏菌弱毒疫苗株的免疫特性。質粒pYA-65能在該重組菌株中表達asd基因，且含有能夠原核表達的豬肺炎支原體P65蛋白的基因(本發明命名為p65基因)。其中，asd基因表達產物提供沙門氏菌株必需的細胞壁形成的相關成份，而P65蛋白的基因表達產物提供了良好的針對豬肺炎支原體的免疫原性。本發明的不含抗性標記表達豬肺炎支原體主要免疫原膜蛋白_p65蛋白的重組減毒的豬霍亂沙門氏菌C500 (pYA-65)衍生於在中國已經使用了 50年以上的商品化的豬霍亂沙門氏菌弱毒疫苗株C500。本發明的重組減毒的豬霍亂沙門氏菌株C500 (pYA-65)，缺失了 C500菌株基因組中的asd基因，同時添加了含有能原核表達的豬肺炎支原體p65蛋白基因的質粒pYA-65。由於質粒pYA-65的存在C500 (pYA-65)才能存活，也就大大提高了質粒pYA-65 (也就是p65蛋白的基因)在重組菌株中的穩定性。P65蛋白的基因在豬霍亂沙門氏菌C500 (pYA-65)中的穩定表達，使之具有針對豬肺炎支原體的免疫保護力。本發明的基本構建方法是利用本申請人所在的農業微生物學國家重點實驗室構建的asd基因缺失的豬霍亂沙門氏菌弱毒疫苗株C500 A crp/A asd缺失株(參見文獻徐引弟等，豬霍亂沙門氏菌C500株Acrp Aasd缺失株平衡致死載體系統的構建及鑑定.生物工程學報，2006，5 (3) :366-371.)構建含有能夠原核表達的豬肺炎支原體p65蛋白基因的質粒pYA-65。將質粒pYA-65轉入asd基因缺失株C500，由於生長的需要質粒pYA_65與asd基因缺失株C500互補而穩定共存，形成我們發明的不含抗性標記的能表達豬肺炎支原體P65蛋白的豬霍亂沙門氏菌C500 (pYA-65)。通過大量的生物學實驗數據證明，本發明製備的豬霍亂沙門氏菌C500(pYA-65)可用於製備針對豬霍亂沙門氏菌和豬支原體肺炎的二價基因工程疫苗。本發明的主要優點是I、本發明的豬霍亂沙門氏菌C500 (pYA-65)表達的豬肺炎支原體p65蛋白，具有良好的免疫保護性。由於豬支原體肺炎危害日益嚴重，而目前市場上各種商品化豬支原體肺 炎疫苗(主要是弱毒苗)存在胸腔接種難操作，副反應大等缺陷。因此，用該基因工程菌株製成的疫苗具有廣闊的市場應用前景。2、本發明的豬霍亂沙門氏菌C500 (pYA-65)衍生於在中國已經使用了 50年以上的商品化的豬霍亂沙門氏菌弱毒疫苗株C500，完全保留了 C500針對豬霍亂沙門氏菌的免疫效力。而且，該重組菌株毒力比C500稍弱，具有更好的生物安全性。3、本發明的豬霍亂沙門氏菌C500 (pYA-65)可同時提供針對豬霍亂沙門氏菌和豬支原體肺炎兩種病原的保護力。4、本發明的豬霍亂沙門氏菌C500 (pYA-65)不含抗性標記，完全符合疫苗生物安全性要求。更詳細的技術方案見實施例所述。


序列表SEQ IDNO 1是本發明克隆的豬肺炎支原體免疫原性膜蛋白p65的基因片段，序列全長為1803bp，存在一個A633-G633的人工鹼基突變。序列表SEQ ID NO 2是豬肺炎支原體免疫原性膜蛋白p65的基因片段編碼的胺基酸序列，編碼600個胺基酸。圖I :本發明製備豬霍亂沙門氏菌C500 (pYA-65)的技術流程圖。圖2 :是本發明製備的能夠原核表達的p65基因片段的流程圖。圖3 :是本發明製備的p65基因A633突變G633PCR鑑定圖。圖4 :是本發明製備的p65基因A633突變G633酶切鑑定圖。圖5 :是本發明製備的能夠原核表達的p65基因的BLAST圖。圖6 :是本發明製備重組質粒pYA-65的PCR鑑定的電泳圖片。圖中 Ml DNA Marker (DL2000) I :pYA_65圖7 :是本發明製備重組質粒pYA-65的酶切鑑定結果電泳圖。圖中 MI =DNAMarker (DL15000) I :pYA_65 (Sall/Hindlll)圖8 :是本發明製備的豬霍亂沙門氏菌C500 (pYA-65)的構建流程圖。圖9 :是本發明製備的豬霍亂沙門氏菌C500 (pYA-65)的PCR鑑定圖。圖中 Ml DNA Marker (DLl5OOO) I C500 (pYA-65)
圖10 :是用 Western-blot 檢測 C500 (pYA-65)中 Cpro-65 的分泌表達。圖中 M :Prestained Protein Ladder I :融合表達蛋白 Cpro-65圖11 :是本發明製備的豬霍亂沙門氏菌C500 (pYA-65)的生長曲線圖。圖12 :是本發明製備的豬霍亂沙門氏菌C500 (pYA-65)遺傳穩定性結果。圖中M :DNA marker (DL 2000) 1-10 1-50 代重組菌株-:C500 (pYA3493)對照；圖13 :是本發明製備的豬霍亂沙門氏菌C500 (pYA-6 5)免疫小鼠血清中抗豬肺炎支原體IgG抗體水平。圖14 :是本發明製備的豬霍亂沙門氏菌C500 (pYA-65)免疫小鼠後所誘導的細胞免疫水平的分析結果。圖15 :是本發明克隆的豬肺炎支原體免疫原膜蛋白p65基因片段。括號內顯示的是突變的鹼基的位置。
具體實施例方式以下結合說明書附圖對本發明作進一步的說明。本發明的技術流程如圖I所示。實施例I製備能夠原核表達的豬肺炎支原體p65蛋白的基因片段豬肺炎支原體p65蛋白基因片段的克隆方法見圖2所示。I、製備能夠原核表達的p65基因片段所需的引物如表I所示。表I製備能夠原核表達的p65基因片段所需的引物
~引物名稱引物序列(5'—3')@1
p65(5amH I )AAAGGATCCATGGCAAAAGAA 連接載體p65(ffi dIII) CCCAAGCTTAATCCTGCTTGA pGEX-KG
p65(al) CCCTTGTAAATTGGCTTGTTAAA 突變 p65(a2) CCCCCAATTTACAATTTCATTAT TGA—TGG表I說明引物下劃線部分為酶切位點。2、製備能夠原核表達的p65基因片段以豬支原體肺炎活疫苗(購自南京天邦生物科技有限公司，該活疫苗包含有豬肺炎支原體Mhpl68株和佐劑)提取的基因組DNA (提取方法按照天根生化科技(北京)有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒說明書操作)為模版，利用如表I所示的引物p65 (BamHI)/p65 (HindIII) PCR擴增p65基因片斷，，擴增體系如下
Mhpl68株基因組IpL
10xPCR buffer (Mg2+ plus) 2.5 ^iL
2.5 mmol/L dNTP Mixture 2 引物(10pmol/pL)2x0.5
Taq 酶0.25 \iL
滅菌無離子水18.2594°C預變性5min後，進行如下循環94°C變性45s，53°C退火45s，72°C延伸2min，擴30個循環，最後72°C lOmin。擴增完成後，取PCR產物8 y L，加入I y L IOXLoadingBuffer，用0. 8%瓊脂糖凝膠進行電泳，EB染色，觀察結果。電泳後參照BioFlux公司膠回收試劑盒說明書進行目的基因的純化。將其克隆原核表達載體pGEX-KG(購自寶生物工程(大連)有限公司)，構建重組質粒pGEX-KG-65，並轉化大腸桿菌DH5 a。用表I所示的引物p65 (al) /p65 (a2)同上體系和條件擴增重組質粒pGEX_KG_65，跑膠後利用膠回收試劑盒(購自美國BioFlux公司，按照該試劑盒的說明書操作)進行膠回收後，利用限制性內切酶Dpn I切除模板，回收後轉化至大腸桿菌DH5d，挑取單菌落，經PCR和酶切鑑定篩選出陽性克隆，提取陽性克隆的質粒，轉化大腸桿菌JM105，進行PCR和酶切鑑定並測序。原核表達的P65基因片段的製備流程如圖2所示。PCR和酶切的鑑定結果如圖3和圖4所示；測序結果與p65原序列進行BLAST的結果如圖5所示，由此可見，鹼基A633已突變G633，得到能夠原核表達的豬肺炎支原體的P65蛋白基因片段(其核苷酸序列見SEQ ID NO :I和圖15，圖15所示序列的括號內為鹼基突變位點)。實施例2重組質粒pYA-65的構建與鑑定I、構建重組質構建重組質粒pYA-65所需的引物表2構建重組質粒pYA-65所需的引物

權利要求
1.一株表達豬肺炎支原體主要免疫原性膜蛋白-P65蛋白的減毒豬霍亂沙門氏菌(Salmonella choleraesuis) C500 (pYA-65)，保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，其保藏編號為 CCTCC NO M2011107o
2.一種減毒的豬霍亂沙門氏菌C500 (pYA-65)的製備方法，它包括下列步驟 1)構建重組質粒PGEX-65:用一對引物擴增豬肺炎支原體膜蛋白p65的基因片斷，並將其亞克隆至原核表達載體pGEX-KG，構建重組質粒pGEX-65，所用引物對的核苷酸序列如下所示 正向引物AAAGGATCCATGGCAAAAGAA (5' — 3')， 反向引物CCCAAGCTTAATCCTGCTTGA(5' — 3')； 2)利用一對引物將豬肺炎支原體的p65蛋白基因片斷的633bp處的鹼基A人工定點突 變為鹼基G，所用引物對的核苷酸序列如下所示 正向引物CCCTTGTAAATTGGCTTGTTAAA (5' — 3')， 反向引物CCCCCAAirTACAAITTCATTAT(5/ — 3'); 3)構建重組質粒pYA-65:以上述突變正確的重組質粒pGEX-65為模板，用一對引物進行PCR擴增，酶切後連接質粒pYA3493，轉化x7213篩選陽性克隆，所得陽性質粒電轉化至豬霍亂沙門氏菌C500 A crp A asd缺失株，從而得到保藏編號為CCTCC NO M2011107的豬霍亂沙門氏菌C500 (pYA-65)，所用引物對的核苷酸序列如下所示 正向引物AAAGTCGACCATGGCAAAAGAA (5, — 3,)， 反向引物CCCAAGCTTAATCCTGCTTGA (5' — 3')。
3.—種能夠原核表達豬肺炎支原體的主要免疫原性膜蛋白_p65蛋白的基因片段，該片段的核苷酸序列如下所示 ATGGCAAAAG AAATCATTTT AGGAATCGAC CTTGGAACAA CAMCTCAGT TGTTGCAATT ATTGAAAATC AAAAACCTGT CGTTCTCGAA AATCCCAACG GAAAAAGAAC AACTCCATCC GTTGTCGCTT TTAAAAACAA TGAAGAAATT GTCGGGGATG CAGCTAAAAG ACAACTTGAA ACTAACCCAG AAGCAATCGC TTCAATTAAA AGATTAATGG GAACTGATAA AACAGTTCGT GCAAATGAAA GAGATTATAA ACCTGAAGAA ATCTCGGCAA AAATTCTTGC TTATTTAAAA GAATATGCTG AGAAAAAGAT TGGTCATAAA GTAACAAAAG CAGTAATTAC AGTACCTGCT TATTTTGACA ATGCCCAACG TGAGGCAACA AAAAATGCCG GAAAAATCGC TGGATTACAA GTAGAAAGAA TTATAAATGA ACCAACAGCG GCCGCACTTG CTTTTGGCCT TGATAAAACT GAAAAAGAAA TGAAAGTTCT TGTCTATGAC TTAGGTGGGG GAACTTTTGA TGTCTCAGTT TTAGAATTAT CCGGTGGAAC CTTCGAAGTT TTATCAACTA GTGGTGATAA TCATTTAGGT GGGGATGACT GGGATAATGA AATTGTAAAT TG (A/G)CTTGTTA AAAAAATCAA AGAAGAATAT GATTTTGATC CAAAAAGTGA TAAAATGGCG CTTACAAGAC TTAAAGAAGA GGCTGAAAAA ACCAAAATTA ATCTTTCAAA TCAAAGTGTT TCTACAGTTT CTCTACCATT TTTAGGAATG GGCAAAAACG GGCCGATTAA CGTTGAACTT GAACTTAAAA GATCAGAATT TGAAAAAATG ACTGCCCATT TAATCGATAG AACTCGCAAA CCAATTGTTG ATGCTCTAAA ACAAGCAAAA ATTGAGGCTT CAGATCTTGA TGAAGTTCTC CTTGTAGGTG GATCAACAAG AATGCCAGCT GTTCAGTCAA TGATTGAGCA TACTTTAAAT AAAAAGCCAA ATCGTTCAAT TAATCCTGAT GAGGTAGTCG CAATTGGTGC TGCAATTCAA GGGGGGGTTC TAGCTGGAGA GATCAGTGATGTTCTACTTT TAGATGTTAC TCCTTTAACT TTAGGAATTG AAACTTTAGG TGGAATTGCAACACCTTTGA TTCCAAGAAA TACAACAATT CCGGTAACAA AATCACAAAT TTTCTCAACAGCTGAGGATA ATCAAACCGA AGTAACAATT TCTGTTGTCC AAGGTGAACG TCAACTTGCAGCGGATAATA AAATGTTAGG TCGCTTTAAT TTATCAGGAA TTGAAGCTGC TCCACGAGGTCTTCCCCAGA TTGAAGTTAG CTTTTCAATT GATGTCAACG GGATTACAAC GGTTTCAGCAAAAGATAAAA AAACCGGCAA AGAACAAACA ATTACAATTA AAAATACTTC AACTTTATCAGAAGAAGAAA TTAATAAGAT GATTCAGGAA GCCGAAGAAA ATCGTGAAGC TGATGCTCTTAAAAAAGACA AAATCGAGAC AACAGTTCGT GCCGAAGGGC TTATTAATCA ACTTGAGAAATCAATAACTG ATCAAGGTGA AAAAATTGAT CCAAAACAAA AAGAATTACT TGAAAAACAAATTCAAGAAT TAAAAGATCT TCTAAAAGAA GAAAAAACTG ACGAATTAAA ATTAAAATTAGACCAAATTG AAGCAGCTGC CCAATCTTTT GCGCAGGCAA CCGCGCAGCA AGCAAATACATCTGAATCTG ATCCAAAAGC TGATGATTCA AACACAATGG ATGCTGAAAT CAAGCAGGAT TAA在上述序列表中，將633bp處的鹼基A人工定點突變為鹼基G。
4.包含權利要求I所述的減毒豬霍亂沙門氏菌的菌液以及明膠製備的豬霍亂沙門氏 菌和豬支原體肺炎二價基因工程疫苗，按體積比計，所述的豬霍亂沙門氏菌的菌液與明膠 的比例為2 I。
5.權利要求I所述的減毒豬霍亂沙門氏菌在製備豬霍亂沙門氏菌和豬支原體肺炎二價基因工程疫苗中的應用。
全文摘要
本發明屬於動物細菌基因工程技術領域，具體涉及一種不含抗性標記表達豬肺炎支原體主要免疫原性膜蛋白的重組減毒豬霍亂沙門氏菌株的構建、疫苗製備及應用。本發明得到一株不含抗性標記表達豬肺炎支原體p65蛋白的減毒豬霍亂沙門氏菌C500(pYA-65)，其保藏號為CCTCC NOM2011107該減毒株缺失了豬霍亂沙門氏菌生長所必需的asd基因，含有能在該菌株中表達asd基因和豬肺炎支原體p65基因的質粒。本發明還公開了利用該減毒株製備豬霍亂沙門氏菌和豬肺炎支原體疫苗，製備方法與應用。本發明製備的二價疫苗可刺激豬產生抵抗豬霍亂沙門氏菌和豬肺炎支原體的免疫反應，有效防止豬霍亂沙門氏菌和豬肺炎支原體的感染。
文檔編號C12N1/21GK102732472SQ20111008786
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月8日 優先權日2011年4月8日
發明者何啟蓋, 吳斌, 張灝, 徐高原, 鄒浩勇, 郭愛珍, 陳煥春, 馬豐英 申請人:華中農業大學, 武漢科前動物生物製品有限責任公司