一種抗微生物肽Cm‑CATH2及其基因、製備方法和應用與流程

2023-09-16 07:56:35

本發明提供一種來源於綠海龜(C.mydas)的cathelicidin家族廣譜抗微生物肽Cm-CATH2及其製備方法和在抗病原微生物感染、消炎等臨床藥物、化妝品、保健品、食品、飼料的添加劑等中的應用，屬於生物醫學技術領域。

背景技術：

Cathelicidin是一類多功能的抗菌肽，在哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物、以及魚類中均發現其存在。自首次從牛中性粒白細胞中發現Bac5後，越來越多的Cathelicidin抗菌肽得以鑑定。Cathelicidin通常以前體的形式合成，包括N端的大約30個胺基酸殘基的信號肽，保守的cathelin結構域及C端高度特異的成熟肽區域，三個部分組成。Cathelicidin前體到達作用部位後，在水解酶的作用下迅速釋放cathelin結構域和成熟肽，發揮抗菌、免疫調節的作用。大量的抗菌肽活性研究顯示，Cathelicidin是一種高效廣譜的抗菌類藥物，甚至對臨床上分離的高耐藥性細菌也具有良好的抑制效果，對許多致病菌殺害作用的速度要遠遠大於傳統抗生素的作用，因此被視為理想的設計新型抗生素的模板。除此之外，Cathelicidin還具有抗病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤癌等多種功能，而且絕大多數抗菌肽對哺乳動物細胞無毒性作用；還具有對多種免疫細胞具有趨化作用、誘導肥大細胞脫粒和組織胺釋放、調節巨噬細胞轉錄、促進傷口癒合、誘導血管發生、誘導變異細胞系細胞凋亡和淋巴細胞活化等生物活性，因此Cathelicidin在醫藥、畜牧業、食品和化妝品等領域具有很好的應用前景。

目前抗菌肽的應用主要集中於醫藥領域的開發，並且取得了一些令人滿意的成果，已經有許多新型藥物逐步邁入醫藥市場。比如，來自爪蟾抗菌肽Magainin的Pexiganan，由Genaera公司開發，目前以外用霜劑的形式用來治療膿皰病和糖尿病患者足底潰爛等，已經進入臨床III期試驗階段，它也是第一個進行商業開發的抗菌肽；Daptomycin是一種陰離子抗菌肽，由Cubit Pharmaceuticals公司研發，2003年9月由美國食品與藥物管理局(FDA)批准上市；來自豬白細胞的Iseganan，由Intrabiotics公司開發，用藥途徑是口服液或噴霧劑，用來治療抗腫瘤治療引發的口腔炎和囊腫性纖維化病人肺感染，目前也處於臨床III期試驗階段；來自於牛的MBI-肽，由Micrologix生物技術公司，以外用乳膏的形式用來治療尿道相關的血流感染，處於III期臨床；來自人唾液的Histatin衍生肽，做成口腔洗劑，用來治療牙根炎和口腔感染(II-III期臨床)、口腔念珠菌感染(II期臨床)和慢性綠膿桿菌感染(I期臨床)。可見，抗菌肽在醫藥領域有著很好的應用前景。

抗菌肽的應用不局限於醫藥領域，動物飼料、化妝品、保健品、食品等中也有很好的應用。抗生素作飼料添加劑的使用早已引起了爭議，世界衛生組織發表公告指出「在牲畜養殖 過程中，停止以往慣用的飼料添加劑抗生素的做法，將在不危害動物和農民利益的前提下，可減少對人類健康的威脅」。抗生素作為飼料添加劑應用於動物生產中，對畜牧業的發展起了重要的作用，但是其在動物體內和動物產品中的殘留，以及病原菌產生的抗藥性問題，對人類的健康和環境產生了負面的影響。美國的R&D報導，抗茵肽可作為飼料防黴劑；溫劉發等應用含抗茵肽的柞蠶免疫血淋巴粉添加於斷奶仔豬飼料中，飼餵試驗表明，柞蠶抗茵肽可減輕斷奶仔豬的腹瀉。他們又將抗茵肽的發酵製劑製作為飼料添加劑餵粵黃雞，研究表明該製劑可促進小雞生長和減少排洩物氮含量。抗菌肽具有廣譜的抗菌作用，對畜禽具有促生長和治療疾病的功能，是無毒、無害、無殘留的綠色產品，其成分為易消化吸收的胺基酸，可作為畜禽飼料添加劑取代或部分取代飼餵動物所用的抗生素，將會減少抗生素對動物體的危害，避免抗生素殘留對人類的傷害。另外，化妝品、保健品、食品中會添加一些添加劑，比如防腐劑，抗氧化劑等，為了抑制食品微生物生長和繁殖，延長食品的保存時間，但是這些添加劑往往被擅自濫用，給人身體帶來巨大傷害，特別是有致癌的副作用，所以可以用抗菌肽替代防腐劑和抗氧化劑。

綠蠵龜(C.mydas)又名綠海龜，是各種海龜中體形較大的一種，和其他海龜一樣，除了上岸產卵外，終其一生都在大洋中渡過。它廣泛分布於熱帶及亞熱帶之海域，並產卵於溫度達25C以上的沙灘。覓食區多為海草豐富的淺水區，為草食性動物，是海龜裡唯一攝食較多海藻的種類。目前關於綠海龜cathelicidin宿主防禦肽的研究和應用還沒有報導。

技術實現要素：

本發明提供一種來源於綠海龜(C.mydas)的cathelicidin家族廣譜抗微生物肽Cm-CATH2及其編碼基因和製備方法，主要應用於製備抗病原微生物感染、消炎等臨床藥物及在化妝品、保健品、食品、飼料中作為添加劑。

為了實現本發明的目的，本發明提供了如下技術方案：

抗微生物肽Cm-CATH2的分離純化方法：

選取綠海龜脾臟組織，洗滌，勻漿，獲得脾臟組織蛋白粗提物。隨後，Sephadex G-50凝膠過濾層析，用自動部分收集器收集3mL/管，220nm檢測並收集各峰檢測抗菌活性，凍幹備用。然後經反相高壓液相層析(RP-HPLC)進行梯度洗脫，收集各多肽樣品峰，用滅菌去離子水溶解，檢測抗菌活性。最後對得到多肽樣品進行一級結構的解析，包括採用電噴霧四級杆飛行時間串聯質譜法(ESI-Q-TOF-MS,Biosystems/MDS Sciex多倫多，加拿大)測定分子量。利用等電聚焦電泳測定其等電點，用Edman降解法確定其多肽胺基酸序列組成。多肽全序列一級結構為：精氨酸-精氨酸-絲氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-苯丙 氨酸-賴氨酸-賴氨酸-纈氨酸-精氨酸-賴氨酸-穀氨醯胺-亮氨酸-甘氨酸-精氨酸-纈氨酸-亮氨酸-精氨酸-組氨酸-絲氨酸-精氨酸-異亮氨酸-蘇氨酸-纈氨酸-甘氨酸-甘氨酸-精氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-苯丙氨酸。

綠海龜Cm-CATH2基因的克隆包括:

綠海龜肝臟總RNA提取，mRNA純化，mRNA反轉錄及cDNA文庫構建，設計引物，利用PCR方法篩選綠海龜抗菌肽Cm-CATH2基因。獲得陽性單克隆進行基因核苷酸序列測定。基因測序結果表明編碼抗微生物肽Cm-CATH2前體cathelicidin的基因由486個核苷酸組成，自5』端至3』端序列為:

其中385到483位是編碼抗微生物肽Cm-CATH2的核苷酸序列，其編碼胺基酸序列為:精氨酸1-精氨酸2-絲氨酸3-精氨酸4-苯丙氨酸5-甘氨酸6-精氨酸7-苯丙氨酸8-苯丙氨酸9-賴氨酸 10-賴氨酸11-纈氨酸12-精氨酸13-賴氨酸14-穀氨醯胺15-亮氨酸16-甘氨酸17-精氨酸18-纈氨酸19-亮氨酸20-精氨酸21-組氨酸22-絲氨酸23-精氨酸24-異亮氨酸25-蘇氨酸26-纈氨酸27-甘氨酸28-甘氨酸29-精氨酸30-甲硫氨酸31-精氨酸32-苯丙氨酸33。

抗微生物肽Cm-CATH2的合成，包括以下步驟：

(1)根據基因編碼的Cm-CATH2胺基酸序列，用自動多肽合成儀合成其全序列；

(2)通過HPLC反相柱層析脫鹽純化，並確定其純度大於97％；

(3)用基質輔助雷射解析電離飛行時間質譜測定其分子量；等電聚焦電泳測定等電點，用自動胺基酸測序儀測定胺基酸序列結構。

所述抗微生物肽Cm-CATH2可應用在製備抗病原微生物感染、消炎等臨床藥物及在化妝品、保健品、食品、飼料等的添加劑中。

本發明的有益效果在於：通過分離純化及Edman降解的方法確定其成熟肽胺基酸組成；通過基因克隆得到了編碼綠海龜cathelicidins抗微生物肽基因；再通過化學合成方法得到成熟 肽Cm-CATH2。該抗微生物肽富含鹼性胺基酸，具有很強的廣譜抗菌活性，抗菌實驗顯示其對多種臨床耐藥菌也有較好的殺滅作用。此外，其結構簡單，不含有二硫鍵及環狀結構，方便化學合成及基因工程製備；還具有低溶血、低細胞毒、不易產生耐藥性等特點。故可替代抗生素製備抗病原微生物感染，消炎等臨床藥物，還可作為化妝品、保健品、食品、動物飼料等中的添加劑，有很好的應用前景。

具體實施方式

下面結合技術方案詳細敘述本發明的具體實施例，但本發明的內容並不局限於此。

實施例1 抗微生物肽Cm-CATH2的分離純化：

(1)從動物園獲取瀕臨死亡的綠海龜新鮮完整脾臟組織，用生理鹽水少許洗滌脾臟組織表面。勻漿後，用少量生理鹽水溶解，按PS液與正丁醇1：50(V/V)比例，把PS與正丁醇在室溫下攪拌60min，13000r/min，20min離心兩次，然後將沉澱凍幹。隨後，第一步Sephadex G-50凝膠過濾層析：0.9g凍乾粉用10ml 0.1M磷酸鹽(Na2HPO4-NaH2PO4,pH 6.0)緩衝液溶解，12000rpm離心10min，取上清液上樣於已平衡好的Sephadex G-50凝膠排阻色譜柱(1.6cm x 90cm,Amersham Bioscience)，用同樣緩衝液洗脫，流速3mL/10min，用自動部分收集器收集3mL/管，220nm檢測並收集各峰檢測抗菌活性，凍幹備用。

(2)反相高壓液相層析(RP-HPLC)：將Sephadex G-50凝膠排阻色譜分離得到的活性成分的峰重新溶解於純水中，4℃，12000rpm離心15min，取上清液，用0.45μm濾膜過濾，收集濾液上樣於經含1‰三氟乙酸的超純水充分平衡的C18反相柱(Hypersil BDS C18,30cm x 0.46cm)用乙腈(含1‰三氟乙酸)構成的洗脫系統進行梯度洗脫,215nm檢測多肽濃度。收集得到的各峰，凍幹濃縮，用滅菌的去離子水重新溶解並進行抗菌活性檢測。

(3)活性多肽一級結構分析。純化的Cm-CATH2採用電噴霧四級杆飛行時間串聯質譜法(ESI-Q-TOF-MS,Biosystems/MDS Sciex多倫多，加拿大)測定分子量。利用等電聚焦電泳測定其等電點，用Edman降解法確定了其胺基酸序列組成為Cm-CATH2：RRSRFGRFFKKVRKQLGRVLRHSRITVGGRMRF。

實施例2 Cm-CATH2前體基因的克隆及基因測序

第一步、綠海龜肝臟總RNA提取(以下實驗所用器具和試劑均經過處理，無RNase)：

A.從新鮮宰殺的綠海龜各種新鮮組織上分別剪下1g左右的小塊，分別放入液氮預冷的細胞凍存管中，然後迅速放入液氮中保存；

B.將保存在液氮中的組織材料取出，放入預冷的研缽內，迅速充分研磨，期間不斷向研缽內加入少許液氮；將大約30mg的組織粉末轉移至預冷的1.5ml離心管中，向其中分別 加入400μl Buffer R-I(裂解液，RNA Miniprep Kit提供)，用21-25號針頭的注射器反覆抽吸8-10次，轉入1.5ml離心管中，加入150μl Buffer R-П，渦旋振蕩15-30s，4℃,12000rpm離心5min；

C.將離心後的上清轉移至新的1.5ml離心管中，加入250ul異丙醇，迅速吸打混勻；將混合液分別轉移至離心吸附柱，室溫，6000rpm離心1min；棄廢液，然後加入500μl Buffer W1A，4℃,12000rpm離心1min；棄廢液，加入700μl BufferW2A,4℃,12000rpm離心1min；棄廢液，加入700μl Buffer W2A,4℃,12000rpm離心1min；棄廢液,空管12000rpm離心1min；將離心吸附柱轉移至新的1.5ml離心管中，然後直接向吸附膜上滴加70-100μl Buffer TE，室溫放置1min，12000rpm離心1min洗脫得到總RNA；

第二步、cDNA文庫的構建

第一鏈的合成(mRNA反轉錄)：

A.在新的0.2ml PCR管(無DNase和RNase)中配製下列混合液：

混合均勻，短暫離心；PCR儀中72℃保溫5min後，然後42℃2min；短暫離心後，在上述管中配製如下反轉錄反應液：

混合均勻後，短暫離心；在PCR儀中完成以下程序：

42℃，90min；68℃，10min；4℃，保存。cDNA保存於-80℃。

第二鏈的合成：

第三步、採用半巢式PCR進行綠海龜cathelicidin的基因克隆篩選

引物使用前先12000rpm離心5min,然後根據標明的摩爾數加入相應體積的ddH2O溶解至20μM的濃度。以合成的肝臟cDNA為模板，以P1和In-Fusion SMARTer CDS為引物，進行第一次PCR擴增。在0.2ml PCR管中加入下列試劑(總體積20μl)：

混勻後，短暫離心。PCR條件為：94℃變性5min；25個循環：94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min；72℃延伸10min；4℃保存。反應結束後，取5μl產物於1％瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。

取上步PCR產物1μl加入99μl ddH2O稀釋100倍作為模板，以P2和CDSⅢ為引物，進行第二次PCR擴增。在0.2ml PCR管中先後加入下列試劑(總體積20μl)：

PCR條件為：94℃變性5min；25個循環：94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min；72℃延伸10min；4℃保存。反應結束後，取5μl，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。

擴增完成後用膠回收試劑盒(天根生物)進行目的片段回收。將回收的目的DNA片段與測序載體pMD19-T Vecter連接，轉化進CaCl2-MgCl2法製備好的DH5α感受態細胞。取100μl轉化菌液均勻塗布在含有100μlg/ml氨苄青黴素(Amp)的LB瓊脂培養基平板上；表面晾乾後，放在37℃恆溫培養箱中倒置培養12-16h。挑取單菌落用M13引物PCR檢測插入片段大小。挑取陽性菌落，搖菌提取質粒，使用Applied Biosystems DNA sequencer,model ABI PRISM 377進行核苷酸測序。

第四步、綠海龜cathelicidin的基因序列測定和結果：

編碼綠海龜cathelicidin抗微生物肽Cm-CATH2為第385到483位核苷酸，其胺基酸序列為：精氨酸1-精氨酸2-絲氨酸3-精氨酸4-苯丙氨酸5-甘氨酸6-精氨酸7-苯丙氨酸8-苯丙氨酸9-賴氨酸10-賴氨酸11-纈氨酸12-精氨酸13-賴氨酸14-穀氨醯胺15-亮氨酸16-甘氨酸17-精氨酸18-纈氨酸19-亮氨酸20-精氨酸21-組氨酸22-絲氨酸23-精氨酸24-異亮氨酸25-蘇氨酸26-纈氨酸27-甘氨酸28-甘氨酸29-精氨酸30-甲硫氨酸31-精氨酸32-苯丙氨酸33。

實施例3 Cm-CATH2的化學合成方法：

(1)根據編碼綠海龜cathelicidin基因推斷的成熟肽Cm-CATH2胺基酸序列，用自動多肽合成儀(Applied Biosystems)合成其全序列。

(2)通過HPLC反相C18柱層析對合成多肽進行脫鹽純化：過程中使用柱子是4.6×250nm，Venusil XBP-C4；溶劑A是0.1％trifluoroacetic溶於100％乙腈，溶劑B是0.1％trifluoroacetic溶於100％水；梯度設為：0.01min(A 15％，B 85％)，25min(A40％,B 60％)，25.1min(A 100％，B 0％)，30min(stop)；流速為1.0ml/min，波長為220nm，體積為5μl，結果測得合成的多肽序列純度大於97％。

(3)分子量測定採用基質輔助雷射解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF)：首先將Cm-CATH2樣品分散在基質分子中並形成晶體，然後用雷射照射晶體，基質從雷射中吸收能量，樣品解吸附，基質-樣品之間發生電荷轉移使得樣品分子電離，電離的樣品在電場作用下飛過真空的飛行管，根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測，即通過離子的質量電荷之比(M/Z)與離子的飛行時間成正比來分析離子，並測得樣品分子的分子量，得到Cm-CATH2樣品的分子量是4089.97Da。

(4)等電聚焦電泳測定等電點：配膠：膠液組成為載體兩性電解質，凝膠貯液，蒸餾水，混合樣品，染色物質等，灌膠，加電極液，電泳，樣品收集進行檢測，得到Cm-CATH2等電點。

(5)用自動胺基酸測序儀測定胺基酸序列結構。合成的Cm-CATH2抗菌肽可以溶於滅菌超純水或PBS，用於藥理活性檢測。

實施例4 綠海龜抗微生物肽Cm-CATH2的藥理實驗：

(1)Cm-CATH2抗菌活性檢測：

將化學合成的CM-CATH2以2mg/ml的濃度溶解在無菌超純水中；用接種環挑取新活化的微生物，然後均勻塗布在新的LB瓊脂板上；將直徑0.5cm的圓形無菌濾紙片放在上述瓊脂板上，然後向紙片上滴加10μl CM-CATH2樣品溶液；放入37℃恆溫培養箱中培養12-24h；觀察抑菌圈形成與否，將對Cm-CATH2敏感的菌株記錄下來。

(2)Cm-CATH2對敏感菌株最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)的測定

該實驗以無菌液體LB作陰性對照，最小抑菌濃度的定義為肉眼可以觀察到的完全抑制微生物生長的最低多肽濃度，或者是光吸收值不高於陰性對照5％的最低濃度。挑取新活化的微生物，接種至無菌液體LB培養基，37℃恆溫振蕩器中200rpm培養10-16h至對數生長期；用紫外分光光度計測菌液600nm光波處的吸光值，吸光值為1時，濃度大約為109cfu/ml，將菌液用無菌液體LB培養基稀釋至106cfu/ml，冰上待用；在96微孔板上配製濃度梯度為100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.13μg/ml、1.56μg/ml、0.78μg/ml、的經0.22μm孔徑膜過濾的Cm-CATH2樣品溶液(即24.4501、12.2250、6.1125、3.0563、1.5281、0.7641、0.3820、0.1910μM)，每孔50μl；每孔加入50μl上述稀釋菌液，充分混勻後，在37℃培養箱中培養10-16h；使用酶標儀測600nm吸光值或肉眼觀察；上述實驗重複3次，取平均值。

表1.Cm-CATH2的最小抑菌濃度(MIC)

*MIC：最小抑菌濃度，濃度值為3次重複實驗的平均值；ND：2mg/ml劑量紙片抑菌試驗無明顯活性；IS：臨床分離菌株。以上結果為三次獨立重複實驗平均值。

由表1可見，Cm-CATH2對測試的微生物具有廣譜的抗菌活性，特別是對幾種常見病原菌株大腸桿菌，痢疾桿菌，金黃色葡糖球菌等。在40種實驗檢測的菌株(包括標準菌株和臨床分離的耐藥菌株)中，Cm-CATH2對絕大多數革蘭氏陰性細菌表現出極強的抗菌活性，其中對大腸桿菌和痢疾桿菌抗性最強，MIC值僅為1.1462μM；革蘭氏陽性菌中，對金黃色葡萄球菌和屎腸球菌最為敏感，最小抑菌濃度分別為1.1462μM和0.5731μM。還對部分真菌也有很強的抗菌活性。Cm-CATH2對臨床分離耐藥細菌具有極強的活性，如銅綠假單孢桿菌、大腸桿菌等。在微生物耐藥性日益嚴重的今天，Cm-CATH2對耐藥菌極強的抗菌活性及其獨特的殺菌機制，使其成為新型抗生素藥物開發的優良模板。

(3)Cm-CATH2對大腸桿菌的殺菌動力學：

大腸桿菌ATCC25922接種到LB固體培養基平板上，37℃培養箱中倒置培養至菌落長出。用接種環挑取單菌落接種到LB液體培養基中，37℃振蕩培養箱中培養到對數生長期。用新 鮮的LB液體培養基將菌液稀釋至1×106CFU/ml，將樣品加入稀釋好的菌液中，使其終濃度為5×MIC(陰性對照加入相應體積的滅菌超純水)。加入樣品的菌液迅速放入37℃振蕩培養箱中，150rpm振蕩培養，分別於0min、5min、10min、20min、30min、45min、60min、90min、120min取10μl菌液用滅菌的生理鹽水稀釋1×103倍，取50μl塗布LB固體平板。平板放入37℃培養箱中倒置培養16h，菌落計數。

表2.Cm-CATH2對大腸桿菌的殺菌動力學

由表2可知，Cm-CATH2平均在20分鐘左右就能夠殺死全部大腸桿菌ATCC25922細胞，而陽性對照美羅培南需要90多分鐘才能全部殺死大腸桿菌ATCC25922，結果證明了Cm-CATH2不僅有很強的殺菌活性，並且其殺菌速度也要遠超過抗生素藥物美羅培南；不僅如此，Cm-CATH2對細菌的作用是致死性的，大腸桿菌經Cm-CATH2作用後全部死亡，2h後無細菌恢復生長，顯示了Cm-CATH2的良好和持久的殺菌作用。