β-1,4-內切木聚糖酶(AorXyn10B)基因的克隆及序列分析的製作方法
2023-09-16 08:20:00 1
專利名稱：β-1,4-內切木聚糖酶(Aor Xyn10B)基因的克隆及序列分析的製作方法
技術領域：
本發明涉及源自米麴黴(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株的一種新型10家族木聚糖酶(Aor XynlOB)基因完整mRNA和DNA序列的克隆及分析，屬於生物工程技術領域。
背景技術：
在自然界中植物細胞壁是一個巨大的碳水化合物倉庫，每年的合成量超過IO11 噸，半纖維素約佔植物乾重的33%，是除纖維素之外最為豐富的多糖。木聚糖是半纖維素最主要的成分之一，廣泛存在於植物細胞的細胞壁和胞間層中。木聚糖結構複雜，其主鏈由以 β -1，4糖苷鍵相連的木糖殘基構成，當主鏈被取代後可形成包含阿拉伯糖、葡糖醛酸、甲基葡糖醛酸、乙醯基、阿魏醯基及P-香豆素等取代基的側鏈。木聚糖的這種複雜的結構導致其完全降解需要眾多酶的共同參與才能完成，其中能夠水解木聚糖主鏈的木聚糖酶在整個水解過程中起最重要的作用。內切 β-1，4- -木聚糖酶(3-l，4-D_endoxylanase，EC 3. 2. 1.8)是木聚糖酶的主要組分之一，它能夠從木聚糖主鏈的內部切割β _1，4糖苷鍵形成寡聚木糖和少量木糖。 木聚糖酶在自然界分布很廣，在海洋及陸地細菌、海洋藻類、真菌、酵母、瘤胃和反當動物細菌、蝸牛、甲殼動物、陸地植物組織和各種無脊椎動物中都存在木聚糖酶。研究較多的是微生物產生的木聚糖酶，已報導能合成木聚糖酶的微生物有細菌、放線菌、真菌和酵母菌等。 根據木聚糖酶催化區域的結構和性質分析，可將其分為不同的家族，其中以糖苷水解酶第 10家族和第11家族居多。目前木聚糖酶已在造紙、食品、能源、飼料以及環境等領域體現出了重要的應用價值，近幾年木聚糖酶的市場需求都有顯著的提高，雖然每年都有數目龐大的新的木聚糖酶被發現，但實際上大多數微生物中木聚糖酶的酶學性質和產量都不能滿足工業生產的要求。而隨著基因工程的發展，運用分子生物學方法對木聚糖酶進行改造將加速木聚糖酶在各領域中的應用。
發明內容
本發明的目的是提供一種新型10家族木聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆和分析，為該基因的異源高效表達和產業化生產奠定理論基礎。根據Bernard Henrissat 等提出的糖苷水解酶分類法，絕大多數木聚糖酶屬於糖苷水解酶第10和11家族。生物信息學分析表明該基因所編碼的木聚糖酶屬於A.oryzae CICC 40186中發現的一種10家族的木聚糖酶，命名為Aor XynlOB，其相應的基因命名為iVorx xynlOB.本發明的技術方案一種來源於A. oryzae CICC 40186的新型10家族木聚糖酶基因(Aor xynlOB)，其完整的mRNA和DNA序列分別為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。獲取完整mRNA和DNA序列的流程如圖1所示。
所述的由完整mRNA推導的iVor XynlOB胺基酸序列為SEQ ID NO :3。所述的iVor xynlOB完整mRNA和DNA序列的克隆和分析方法(I)Aor xynlOB 3'端 mRNA 序列的克隆對 10 家族的 Aspergillus fumigatus Af239> Aspergillus terreus NIH2624、Neosartorya fischeri NRRL 181、Aspergillus clavatus NRRLl 禾口PeniciIlium chrysogenum Wisconsin 54—1255木聚糖醇的氛基酸序列進行同源比對，找出兩段約7個胺基酸的保守序列；對該段胺基酸序列的mRNA序列進行同源比對，設計兩條簡併引物XynlOB-Fl和XynlOB-Rl。XynlOB-Fl 5' -A(A/G)CT(G/A/C)TACTACAACGACTAC-3『XynlOB-Rl 5' -TACTT(A/G)TC(A/G)GTCCAGTCCC-3『提取A.oryzae CICC 40186 的總 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit(Ver. 3. 0)說明書進行RT-PCR擴增。將兩輪PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶並與 pUCm-T載體連接(pUCm-T-XynlOB3')，轉化JM109，經酶切鑑定正確後送上海生工測序，得到 Aor xynlOB 3'端 mRNA 序列。(2)Aor xynlOB 5'端mRNA序列的克隆基於上述得到的iVor xynlOB 3'端mRNA 序列，設計一條反向引物XynlOB-R2。XynlOB-R2 5' -GCCGTAGGACTGGATTAGC-3『應用引物XynlOB-Rl 和 XynlOB_R2 按照 TaKaRa 的 5' -Full RACE Kit 說明書進行5' -RACE。將兩輪PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶並與pUCm-T 連接(pUCm-T-XynlOB5')，轉化JM109，經酶切鑑定後送上海生工測序，得到iVor xynlOB 5'端mRNA序列。(3)Aor xynlOB 5'端DNA序列的克隆利用我們前期申請的《一種T載體介導的測定3'端側翼未知序列的方法》(專利申請號:201010550861. 9)，以處理後的A. oryzae CICC 40186基因組DNA為模板，以T-PriF和XynlOB-Rl為引物進行第一輪PCR，以T-PriF 和XynlOB-R2為引物進行第二輪PCR。將兩輪PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶並與PUCm-T連接(pUCm-T-xynlOBP)，轉化JM109，經酶切鑑定正確後送上海生工測序，得到Aor xynlOB 5'端DNA序列。(4)Aor xynlOB 3'端DNA序列的克隆基於上述得到的Aor xynlOB 3'端mRNA 序列，設計兩條正向引物XynlOB-F2和XynlOB_F3 ；XynlOB-F2 5' -GCTAATCCAGTCCTACGGC-3『XynlOB-F3 5' -TTCTTCCAGCTCTCCCAG-3『利用我們前期申請的《一種T載體介導的測定3'端側翼未知序列的方法》(專利申請號201010550861. 9)，以處理後的A. oryzae CICC 40186基因組DNA為模板， XynlOB-F2和T-PrimerR為引物進行第一輪PCR擴增，以XynlOB_F3和T-PrimerR為引物進行第二輪PCR擴增。將兩輪PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶並與pUCm-T 連接(pUCm-T-XynlOB3T)，轉化JM109，經酶切鑑定後送上海生工測序，得到iVor xynlOB 3'端DNA序列。 (5) Aor xynlOB基因的生物信息學分析將Aor xynlOB的5 『和3 『端mRNA序列進行拼接，得到自轉錄起始位點至Poly(A)完整的mRNA序列；在NCBI上對開放閱讀框架 (Open Reading Frame)進行分析，進而推導出Aor XynlOB的胺基酸序列；進行信號肽預測。將iVor xynlOB的5'和3'端DNA序列進行拼接，獲得完整DNA序列，並對其5'端啟動子區域和3'端轉錄終止區的功能進行預測。本發明的有益效果本發明提供了一種新型10家族木聚糖酶基因完整mRNA和 DNA序列的克隆及分析。為該基因的異源高效表達和產業化生產奠定了理論基礎。經生物信息學分析表明來源於A.0ryZae CICC 40186的該木聚糖酶屬於糖苷水解酶第10家族，命名為iVor XynlOB，其相應的基因命名為iVor xynl0Bo Aor XynlOB具有較好的pH穩定性，有較大的工業化生產和應用潛力以及經濟價值，也為其它木聚糖酶的研究奠定了基礎。
圖1 獲取A. oryzae CICC 40186 xynlOB基因完整mRNA和DNA序列的流程圖
具體實施例方式以下結合具體實施例，進一步闡述本發明的操作方法。但是這些實施例僅用於詳細說明本發明，而不用於限制本發明的範圍。實施例IAor xynlOB 3'端mRNA序列的克隆以Oligo dT-Adaptor Primer為引物反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以M13Primer M4 和 XynlOB-Fl 為引物進行 PCR 擴增(94°C 2min ；30 個循環，94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 70s ； 72°C lOmin)。將PCR擴增產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶並與pUCm-T 連接(pUCm-T-XynlOB3')，轉化JM109，經酶切鑑定正確後送上海生工測序。實施例2Aor xynlOB 5'端mRNA序列的克隆以 5 『 RACE Outer Primer 和 XynlOB-Rl 為引物進行第一輪 PCR(94 "C 3min ； 30 個循環，94 "C 30s, 55 "C 30s, 72 "C Imin ；72 "C IOmin)；以 5 『 RACE Inner Primer 和 XynlOB-R2 為引物進行第二輪 PCR(94°C 3min ;30 個循環，94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 50s ； 72 °C lOmin)。將兩輪PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶並與pUCm-T連接 (pUCm-T-xynlOB5')，轉化JM109，經酶切鑑定正確後送上海生工測序。實施例3Aor xynlOB 5'端DNA序列的克隆以 T-PriF 和 XynlOB-Rl 為引物進行第一輪 PCR(94 V 4min ；30 個循環， 94 0C 30s, 52 0C 30s, 72 °C 90s :72°C lOmin)；以 T-PriF 和 XynlOB_R2 為引物進行第二輪 PCR(940C 4min ;30 個循環，94°C 30s, 52 °C 30s, 72 °C 80s ；72 °C lOmin)。將兩輪 PCR 產物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶並與PUCm-T連接(pUCm-T-xynlOBP)，轉化 JM109,經酶切鑑定正確後送上海生工測序。實施例4Aor xynlOB 3'端DNA序列的克隆以XynlOB_F2和Τ-PrimerR為引物進行第一輪PCR擴增(94°C 4min ；30個循環， 940C 30s, 550C 30s, 72°C 90s ；72°C lOmin)；以 XynlOB_F3 和 T-PrimerR 為引物進行第二輪 PCR 擴增(94°C 3min ；30 個循環，94°C 30s,51°C 30s, 72°C Imin ；72°C lOmin)。將兩輪 PCR 產物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶並與PUCm-T連接(pUCm-T-XynlOB3T)， 轉化JM109，經酶切鑑定正確後送上海生工測序。實施例5Aor xynlOB基因的生物信息學分析將iVor xynlOB的5'和3'端mRNA序列進行拼接，得到自轉錄起始位點至poly (A)完整的mRNA序列；在NCBI上對開放閱讀框架(Open Reading Frame)進行分析， 得到長度為1422bp的ORF ；進而推導出iVor XynlOB的胺基酸序列長度為473aa ；進行信號肽預測，其長度為21aa。將iVor xynlOB的5'和3'端DNA序列進行拼接，獲得完整DNA序列，並對其5'端啟動子區域和3'端轉錄終止區的功能進行預測，其5'端啟動子區和3' 端轉錄終止區長度分別為50bp和16;3bp。
權利要求
1.一種源自米麴黴(Aspergillus oryzae)CICC 40186、歸屬於糖苷水解酶第10家族的新型木聚糖酶基因，其完整mRNA和DNA的核苷酸序列分別對應於序列表中的SEQ ID NO 1 禾口 SEQ ID NO :2ο
2.如權利要求1所述的新型木聚糖酶(AorXynlOB)，其胺基酸序列為SEQ ID NO :3。
3.A. oryzae CICC 40186 Aor xynlOB 完整 mRNA 和 DNA 序列的獲取方法(1)A.oryzae CICC 40186 Aor xynlOB 3 『端 mRNA 序列的克隆對 10 家族的 Aspergillus fumigatus Af239> Aspergillus terreus NIH2624、Neosartorya fischeri NRRL 181、Aspergillus clavatus NRRLl 禾口 Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255木聚糖酶的胺基酸序列進行同源比對，設計兩條簡併引物XynlOB-Fl和 XynlOB-Rl ；XynlOB-Fl 5' -A(A/G)CT(G/A/C)TACTACAACGACTAC-3『XynlOB-Rl 5' -TACTT(A/G)TC(A/G)GTCCAGTCCC-3『以 A. oryzae CICC 40186 總 RNA 為模板，Oligo dT-Adaptor Primer 為引物反轉錄合成 cDNA的第一條鏈；以M13Primer M4和XynlOB-Fl為引物進行PCR(94°C 2min ；30個循環， 94°C 30s，52°C 30s，72°C 70s ;72°C IOmin)；目的條帶經克隆、測序得到 iVor xynlOB 3'端 mRNA序列；(2)A. oryzae CICC 40186 Aor xynlOB5'端mRNA序列的克隆基於上述得到的Aor xynlOB3'端mRNA序列，設計一條反向引物XynlOB_R2 ；Xyn10B-R2 5 『 -GCCGTAGGACTGGATTAGC-3『以反轉錄合成的cDNA第一條鏈為模板、5' RACE Outer I^rimer和權利要求3 (1)所述的 XynlOB-Rl 為引物進行第一輪 PCR(94°C 3min ；30 個循環，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C Imin ； 72°C IOmin)；以 5' RACE Inner Primer 和 XynlOB_R2 為引物進行第二輪 PCR(94°C 3min ； 30 個循環，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 50s ；72 °C IOmin)；目的條帶經克隆、測序，得到 Aor xynlOB5'端 mRNA 序列；(3)A.oryzae CICC 40186 Aor xynlOB 5'端DNA序列的克隆運用一種T載體介導的擴增方法，以經處理的A. oryzae CICC 40186基因組DNA為模板，以T-PriF和XynlOB-Rl 為引物進行第一輪 PCR(94°C 4min ；30 個循環，94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 90s ；72°C IOmin)； 以 T-PriF 和 XynlOB-R2 為引物進行第二輪 PCR(94°C 4min ；30 個循環，94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 80s ；72°C IOmin)；目的條帶經克隆、測序，得到Aor xynlOB 5'端DNA序列；(4)A.oryzae CICC 40186 Aor xynlOB 3'端DNA序列的克隆基於上述得到的Aor xynlOB3'端mRNA序列，設計兩條正向引物XynlOB_F2和XynlOB_F3 ；XynlOB-F2 5' -GCTAATCCAGTCCTACGGC-3『XynlOB-F3 5' -TTCTTCCAGCTCTCCCAG-3『以經處理的A. oryzae CICC 40186基因組DNA為模板，以XynlOB_F2和T+rimerR為弓丨物進行第一輪 PCR 擴增(940C 4min ；30 個循環，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 90s ；72°C IOmin)； 以 XynlOB-F3 和 T-PrimerR 為引物進行第二輪 PCR 擴增(94°C 3min ；30 個循環，94°C 30s, 51°C 30s，72°C Imin ;72°C IOmin)；目的條帶經克隆、測序，得到 iVor xynlOB 3'端 DNA 序列；(5)Aor xynlOB基因的生物信息學分析將iVor xynlOB的5'和3'端mRNA序列進行拼接，得到自轉錄起始位點至poly (A)完整的mRNA序列；在NCBI上對開放閱讀框架(Open Reading Frame)進行分析，進而推導出Aor XynlOB的胺基酸序列；進行信號肽預測；將Aor xynlOB的5'和3'端DNA序列進行拼接，獲得完整DNA序列，並對其5'端啟動子區域和 3'端轉錄終止區的功能進行預測。
全文摘要
本發明提出了一種源自米麴黴(Aspergillus oryzae)CICC 40186的新型10家族木聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆方法及分析，其核苷酸序列分別為SEQ IDNO1和SEQ ID NO2。生物信息學分析表明該木聚糖酶屬於糖苷水解酶第10家族，命名為Aor Xyn10B，其胺基酸序列為SEQ ID NO3，相應的基因命名為Aor xyn10B。這為該基因的異源表達和工業化生產奠定了理論基礎。作為一種新型酶製劑，該木聚糖酶具有較大的工業化生產和應用潛力及經濟價值，也為其它木聚糖酶的研究奠定了理論基礎。
文檔編號C12N9/42GK102492708SQ201110410508
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月12日 優先權日2011年12月12日
發明者李劍芳, 殷欣, 胡蝶, 鄔敏辰, 陳忠法 申請人:江南大學