一種新的人基因編碼序列、其編碼的多肽及製備方法
2023-09-16 08:11:30 1
專利名稱：一種新的人基因編碼序列、其編碼的多肽及製備方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發明涉及人HSLARP的cDNA序列，該蛋白是Septin的同系物。本發明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產方法。
Septin家族成員廣泛存在於真菌、果蠅、哺乳動物以及植物等各種真核生物細胞中，是細胞骨架中除微管蛋白、肌動蛋白外的又一重要組成部分，普遍參與胞質分裂作用。研究表明，septin蛋白異常的酵母細胞無法進行胞質分裂，最終形成具有出芽生長不正常的多核細胞(Bacteriol.Rev.38164-198，1971)。這種參與細胞生長的重要作用也由該家族蛋白在各種生物中保守的序列和功能所證明(Cell 84187-190，1996)。Septin家族四個的成員CDC3、CDC10、CDC11、CDC12最早由Hartwell等人於1971年從出芽酵母中分離得到，編碼這四個蛋白的基因於1989年由Pringle等人克隆到(Method Cell Biology 31357-435，1989)。1994年以後，人們在果蠅中找到了三個septin家族的基因pnut、sep1、sep2(Journal of CellBiology 133605-616，1996)。至今，至少有五個哺乳類septin基因被發現鼠的diff6、nedd5(Biochem.Biophys.，Res.Commun.1851155-1161，1992)和h5(TrendsNeurosci 15319-323，1992)，人的hCDC10(Biochem.Biophys.，Res.Commun 20282-87，1994)和KIAA0518(DNA Res.2167-174，1995)。在本發明被公布之前，尚沒有任何人公開過本申請中涉及的另一個人類septin家族成員Hslarp。
本發明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼septin家族的一個新成員，本發明的septin家族被命名為HSLARP。
本發明的另一個目的是提供一種新的人的septin家族成員，該蛋白被命名為HSLARP。
本發明的再一個目的是提供一種利用重組技術生產所述的新的人的septin家族成員的方法。
本發明還提供了這種人的septin家族成員基因序列和多肽的應用。
在本發明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人HSLARP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸21-1121位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸21-1121位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸21-1121位的核苷酸序列。
在本發明的另一方面，提供了一種分離的HSLARP蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4胺基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發明的另一方面，提供了一種所述載體轉化的宿主細胞。
在本發明的另一方面，提供了一種產生具有HSLARP蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有HSLARP蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成HSLARP蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸21-1121位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成HSLARP蛋白的重組細胞；(c)在適合表達HSLARP蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有HSLARP蛋白活性的多肽。
在本發明的一個具體實施方案中，本發明的分離的多核苷酸全長為1177個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位於21-1121位核苷酸。
在本發明中，「分離的」、「純化的」或「基本純的」DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發明中，術語「HSLARP蛋白(或多肽)編碼序列」指編碼具有HSLARP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中21-1121位核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指，位於SEQ ID NO.3序列的編碼框21-1121位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQ ID NO.3中21-1121位核苷酸序列同源性低至約70％的簡併序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳地在高度嚴緊條件下，與SEQ ID NO.3中從核苷酸21-1121位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸21-1121位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與人HSLARP相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5』和/或3』端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發明中，「基本純的」蛋白質或多肽是指其至少佔樣品總物質的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按乾重或溼重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態下的伴隨其的組分。
在本發明中，術語「HSLARP蛋白多肽」指具有HSLARP蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。該術語還包括具有與人高效淋巴細胞趨化因子相同功能的、SEQ IDNO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括HSLARP蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹度條件下能與HSLARP DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗HSLARP多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含HSLARP多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了HSLARP多肽的可溶性片段。通常，該片段具有HSLARP多肽序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。
發明還提供HSLARP蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然HSLARP多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、γ-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
本發明還包括HSLARP多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可用於抑制細胞內HSLARP的表達。
本發明還包括一種探針分子，該分子通常具有HSLARP多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續核苷酸。該探針可用於檢測樣品中是否存在編碼HSLARP的核酸分子。
本發明還包括檢測HSLARP核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然後檢測探針是否發生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增後的產物，其中PCR擴增引物對應於HSLARP多肽的編碼序列，並可位於該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發明中，術語「宿主細胞」包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
另一方面，本發明還包括對HSLARP DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這裡，「特異性」是指抗體能結合於HSLARP基因產物或片段。較佳地，指那些能與HSLARP基因產物或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合併抑制HSLARP蛋白的分子，也包括那些並不影響HSLARP蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的HSLARP基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的HSLARP基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達HSLARP或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發明的抗體包括能阻斷HSLARP功能的抗體以及不影響HSLARP功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用HSLARP基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法製備或利用多肽合成儀合成。與HSLARP基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯後修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
在本發明中，人HSLARP的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人肝臟λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用兩對寡核苷酸為引物——A15』-CAGTGATGGCTGGCGGAGTCATG-3′為正向引物，寡核苷酸A25′-ATTGGACAAGAGGCCGACTGAAG-3』為反向引物，進行PCR。測序後得到SEQID NO.3的全長cDNA序列。
Septin家族成員被發現廣泛存在於各種生物中，參與胞質分裂。我們克隆了一個新的人類基因HSLARP，該基因與鼠diff6基因高度同源，因而這表明它是septin家族在人中的一個同源基因，並且具有和septin家族其它成員相似的生物學功能。首先，它在胞質分裂中有著重要作用。Septin家族成員具有GTP酶活性，從細胞周期G1期開始結合併水解GTP，使單體聚合形成纖維狀結構(J.Cell.Biol.133(3)605-616，1996)。這種纖維狀結構可以起到抵抗外界壓力，並聚集其它參與胞質分裂的蛋白的作用(Cell 77371-379，1994)。其次，在細胞間期，septin蛋白組成的纖絲與肌動蛋白絲緊密相聯，並和細胞間通道點連接相接觸，成為細胞骨架的重要組成部分(Genes Development 111535-1547，1997)。另外，在果蠅眼的發育中，已證實視杆細胞R7發育異常和細胞膜表面蛋白septin活力下降有直接聯繫(Cell 77371-379，1994)。哺乳類的一些septin蛋白被發現在胎腦及一些神經元如海馬、三叉神經節、視網膜和蒲肯野氏細胞中都有表達，提示septin蛋白可能參與發育中的和成熟的神經系統功能(Genes Development 111535-1547.1997)。根據septin家族成員的高度保守性、廣泛表達性及已證實的在胞質分裂中的重要作用，可以推斷septin蛋白在調節細胞結構和功能方面均扮演重要角色。已有研究表明，一種遺傳缺失病的染色體缺失區段中包含有人的一個septin基因(Hum.Genet.1016-12，1997)，本發明可以為研究該種疾病的分子機制和治療提供一條新途徑。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1HSLARP的cDNA序列的克隆和測定1.引物擴增以人肝臟λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用兩對寡核苷酸為引物——A15』-CAGTGATGGCTGGCGGAGTCATG-3』(SEQ ID NO1)為正向引物，寡核苷酸A25』-ATTGGACAAGAGGCCGACTGAAG-3』(SEQ ID NO2)為反向引物，進行PCR。A1/A2的PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、62℃1分鐘和72℃1分鐘進行35個循環，最後72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到約1.2kd的目的片段。
2.PCR產物的測序將如上獲得的PCR擴增產物A1/A2與pGEM-T載體(Promega)連接，轉化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(pHarmacia)對插入片段進行定向系列缺失，然後用PCR對缺失子進行快速鑑定及排序。用SequiTherm EXCELDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進行測序，最後用電腦軟體拼接順序，獲得全長cDNA序列，共1177bp，詳細序列見SEQ ID NO3，其中開放讀框位於21-1121位核苷酸。
根據得到的全長基因組序列推導出HSLARP的胺基酸序列，共366個胺基酸殘基，其胺基酸序列詳見SEQ ID NO4。
實施例2同源比較用HSLARP的全長cDNA序列及其編碼蛋白在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB資料庫及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR資料庫中用BLAST進行核酸和蛋白同源檢索。結果發現它們與septin家族基因及其編碼蛋白具有極高同源性，用PCGENE軟體比較，發現它與鼠diff6基因在核酸和蛋白水平上的同一性分別達到76％和92.6％左右，它們被認為構成一個家族，所以可以從這些基因或蛋白的功能來推測HSLARP的功能。
Septin家族成員被認為與細胞分裂時的胞質分裂過程有關(Cell 84187-196，1996)。胞質分裂是所有真核生物中都存在的一個普遍現象。儘管各種生物的胞質分裂機制有所不同，但是septin家族成員被發現廣泛存在於各種生物中，參與胞質分裂。本發明新的人類基因HSLARP與鼠diff6基因高度同源，因而表明它是septin家族在人中的一個同源基因，並且具有和septin家族其它成員相似的生物學功能。首先，它在胞質分裂中有著重要作用。它的N端序列含有一個P形圈的結合核苷酸的標誌性序列GX4GKS--DX2G--KXD，其中Xn表示任意n個胺基酸，--表示一段不定的胺基酸序列，該序列為GTP酶超家族的標誌性序列(Nature349117-127，1991)。在本發明中的對應序列為32GESGLGKS--89DTPG--170KAD[注胺基酸左下角的數字為胺基酸位置]。Septin家族成員具有GTP酶活性，從細胞周期G1期開始結合併水解GTP，使單體聚合形成纖維狀結構，成為決定胞質分裂時分裂板位置的關鍵因素(J.Cell.Biol.133(3)605-616，1996)。這種纖維狀結構可以起到抵抗外界壓力，並聚集其它參與胞質分裂的蛋白的作用(Cell 77371-379，1994)。其次，在細胞間期，septin蛋白組成的纖絲被發現與肌動蛋白絲緊密相聯，並和細胞間通道點連接相接觸，成為細胞骨架的重要組成部分(Genes Development 111535-1547，1997)。另外，在果蠅眼的發育中，已證實視杆細胞R7發育異常和細胞膜表面蛋白septin活力下降有直接聯繫。研究表明，該septin蛋白的活力下降，導致了有絲分裂的延緩，而這種細胞周期的延緩進一步引起R7細胞對誘導信號的反映能力的大大下降(Cell 77371-379，1994)。哺乳類的一些septin蛋白被發現在胎腦及一些神經元如海馬、三叉神經節、視網膜和蒲肯野氏細胞中都有表達，提示septin蛋白可能參與發育中的和成熟的神經系統功能(Genes Development 111535-1547，1997)。根據septin家族成員的高度保守性、廣泛表達性及已證實的在胞質分裂中的重要作用，可以推斷septin蛋白在調節細胞結構和功能方面均扮演重要角色。已有研究表明，一種遺傳缺失病的染色體缺失區段中包含有人的一個septin基因。該病表現為先天性心臟病、甲狀旁腺機能衰退、細胞介導的免疫缺陷等複雜效應(Hum.Genet.1016-12，1997)，本發明可以為研究該種疾病的分子機制和治療提供一條新途徑。
實施例3HSLARP在大腸桿菌中的表達在該實施例中，將編碼HSLARP的cDNA序列用對應於該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得HSLARP插入片段。
PCR反應中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGGGATCCATGGACAAGGAGTACGTGG-3′(SEQ ID NO.5)，該引物含有BamHI限制性限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之後是由起始密碼子開始的HSLARP編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5』-TTGGGTCGACTCAGAGGGCGTCTGACTGC-3』(SEQ ID NO.6)，該引物含有SalI限制性限制性內切酶的酶切位點、翻譯終止子和HSLARP的部分編碼序列。
引物上的限制性內切酶的酶切位點對應於細菌表達載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌複製起點(ori)、一個IPTG-可調啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結合位點(RBS)、一個6-組氨酸標記物(6-His)以及限制性內切酶克隆位點。
用BamHI和SalI消化pQE-9載體，隨後將插入片段連接到pQE-9載體並保持開放讀框在細菌RBS起始。隨後用連接混合物轉化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質粒pREP4，其表達lacI阻遏物並攜帶卡那黴素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養皿上篩選轉化子，抽提質粒，測序驗證HSLARP的cDNA片段已正確插入了載體。
在補加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養基中過夜培養(O/N)含所需構建物的陽性轉化子克隆。過夜(O/N)培養物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然後接種到大體積培養基中，培養細胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時，加入IPTG(「異丙基硫代-β-D-半乳糖苷」)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導啟動P/O導致基因表達水平提高。繼續培養細胞3-4小時，隨後離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細胞並將細胞沉澱溶於6M的鹽酸胍中。澄清後，通過在能使含6-His標記物蛋白緊密結合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的HSLARP。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫HSLARP。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉澱蛋白。或者，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化後的蛋白質被結合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結合到該柱時蛋白質變性，隨後用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最後，將可溶的蛋白質用PBS進行透析，然後將蛋白質保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑑定表達蛋白的分子量大小為約42KDa。
此外，用常規方法對達蛋白的N端和C端各10個胺基酸長度的胺基酸進行測序，發現與SEQ ID NO.4的序列一致。
實施例4HSLARP在真核細胞(CHO細胞株)中的表達在該實施例中，將編碼HSLARP的cDNA序列用對應於該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得HSLARP cDNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGGGATCCATGGACAAGGAGTACGTGG-3′(SEQ ID NO.5)該引物含有BamHI限制性限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之後是由起始密碼子開始的HSLARP編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5』-TTGGTCTAGATCAGAGGGCGTCTGACTGC-3』(SEQ ID NO.7)該引物含有XbaI限制性限制性內切酶的酶切位點、一個翻譯終止子和HSLARP的部分編碼序列。
引物上的限制性內切酶的酶切位點對應於CHO細胞表達載體pcDNA3上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體複製起點(f1 ori)、一個病毒複製起點(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應的polyA順序。
用BamHI和XbaI消化pcDNA3載體，隨後將插入片段連接到pcDNA3載體。隨後用連接混合物轉化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養皿上篩選轉化子，在補加Amp(100μg/ml)的LB液體培養基中過夜培養(O/N)含所需構建物的克隆。抽提質粒，用ApaI酶切鑑定插入片段大小及方向，並測序驗證HSLARP的cDNA片段已正確插入了載體。
質粒轉染CHO細胞是採用脂轉染法，用Lipofectin(GiBco Life)進行的。轉染48小時後，經2-3周的持續G418加壓篩選，收集細胞及細胞上清測定表達蛋白酶活力。去G418，連續傳代培養；對混合克隆細胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細胞亞克隆。按常規方法大量培養上述陽性亞克隆。48小時後，開始收集細胞及上清，用超聲裂解方法破碎細胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經預平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然後以PBS(pH7.4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最後凍幹保存。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑑定表達蛋白的分子量大小為42KDa。
此外，用常規方法對達蛋白的N端和C端各10個胺基酸長度的胺基酸進行測序，發現與SEQ ID NO.4的序列一致。
實施例5製備抗體將實施例3和4中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進行分離後備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，並用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天後，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉澱HSLARP基因翻譯產物的能力加以評估。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度23鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO1CAGTGATGGC TGGCGGAGTC ATG 23(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特徵(A)長度23鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2ATTGGACAAG AGGCCGACTG AAG 23(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特徵(A)長度1177bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.31 CAGTGATGGCTGGCGGAGTCATGGACAAGGAGTACGTGGGTTTTGCTGCTCTCCCCAACC61 AGCTGCACCGCAAGTCTGTCAAGAAGGGGTTTGACTTCACGCTAATGGTGGCAGGGGAGT121 CAGGCCTAGGGAAATCCACCCTCATCAACAGCCTCTTCCTCACCAACCTCTATGAGGATC181 GCCAGGTGCCAGAGGCAGGTGCTCGCTTGACACAGACCCTGGCCATTGAGCGCCGGGGCG241 TAGAGATTGAGGAAGGGGGTGTGAAAGTGAAGCTGACCCTTGTGGACACACCTGGCTTTG301 GGGACTCAGTGGACTGCTCTGACTGCTGGCTTCCGGTGGTGAAATTCATCGAGGAGCAAT361 TTGAGCAGTACCTTAGGGATGAGAGTGGCCTGAACCGGAAGAACATCCAGGACTCCCGAG421 TCCACTGCTGCCTCTACTTCATCTCACCCTTCGGCCGGGGGTCCCGCCTAGATGTGGCCT481 TCCTCCGGGCAGTACACGAGAAAGTCAACATCATCCCAGTCATTGGCAAAGCGGATGCTC541 TGATGCCCCAGGAAACCCAGGCCCTCAAGCAGAAGATCCGGGATCAGTTGAAGGAAGAGG601 AGATCCACATCTACCAGTTCCCCGAATGTGACTCTGATGAAGATGAAGACTTCAAGAGGC661 AGGATGCAGAGATGAAGGAAAGCATCCCTTTTGCAGTCGTGGGATCATGCGAGGTGGTGA721 GGGATGGCGGGAACGGCCTGGTGAGGGGACGCCGCTACTCCTGGGGGACCGTGGAGGTGG781 AGAACCCACATCACTGCGATTTCCTGAACCTGCGACGGATGCTGGTGCAGACACACCTGC841 AGGACCTGAAAGAGGTGACGCACGATCTGCTCTACGAGGGCTACCGGGCCCGCTGCCTAC901 AGAGCCTGGCCCGGCCTGGGGCTCGCGATCGAGCCAGCCGCAGTAAGCTTTCCCGCCAGA961 GCGCCACAGAGATCCCGCTGCCCATGCCTCCTCTGGCGGACACCGAGAAGCTGATCCGCG1021 AGAAAGACGAAGAGCTGCGCCGCATGCAAGAGATGCTGGAGAAGATGCAGGCCCAAATGC1081 AGCAGAGCCAGGCCCAGGGCGAGCAGTCAGACGCCCTCTGAGCACACGCCCCGCCCGGCC1141 TTACCCCGGTCCGCCTTCAGTCGGCCTCTTGTCCAAT(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特徵(A)長度366個胺基酸(B)類型胺基酸(C)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.41 Met Asp Lys Glu Tyr Val Gly Phe Ala Ala Leu Pro Asn Gln Leu16 His Arg Lys Ser Val Lys Lys Gly Phe Asp Phe Thr Leu Met Val31 Ala Gly Glu Ser Gly Leu Gly Lys Ser Thr Leu Ile Asn Ser Leu46 Phe Leu Thr Asn Leu Tyr Glu Asp Arg Gln Val Pro Glu Ala Gly61 Ala Arg Leu Thr Gln Thr Leu Ala Ile Glu Arg Arg Gly Val Glu76 Ile Glu Glu Gly Gly Val Lys Val Lys Leu Thr Leu Val Asp Thr91 Pro Gly Phe Gly Asp Ser Val Asp Cys Ser Asp Cys Trp Leu Pro106 Val Val Lys Phe Ile Glu Glu Gln Phe Glu Gln Tyr Leu Arg Asp121 Glu Ser Gly Leu Asn Arg Lys Asn Ile Gln Asp Ser Arg Val His136 Cys Cys Leu Tyr Phe Ile Ser Pro Phe Gly Arg Gly Ser Arg Leu151 Asp Val Ala Phe Leu Arg Ala Val His Glu Lys Val Asn Ile Ile166 Pro Val Ile Gly Lys Ala Asp Ala Leu Met Pro Gln Glu Thr Gln181 Ala Leu Lys Gln Lys Ile Arg Asp Gln Leu Lys Glu Glu Glu Ile196 His Ile Tyr Gln Phe Pro Glu Cys Asp Ser Asp Glu Asp Glu Asp211 Phe Lys Arg Gln Asp Ala Glu Met Lys Glu Ser Ile Pro Phe Ala226 Val Val Gly Ser Cys Glu Val Val Arg Asp Gly Gly Asn Gly Leu241 Val Arg Gly Arg Arg Tyr Ser Trp Gly Thr Val Glu Val Glu Asn256 Pro His His Cys Asp Phe Leu Asn Leu Arg Arg Met Leu Val Gln271 Thr His Leu Gln Asp Leu Lys Glu Val Thr His Asp Leu Leu Tyr286 Glu Gly Tyr Arg Ala Arg Cys Leu Gln Ser Leu Ala Arg Pro Gly301 Ala Arg Asp Arg Ala Ser Arg Ser Lys Leu Ser Arg Gln Ser Ala316 Thr Glu Tle Pro Leu Pro Met Pro Pro Leu Ala Asp Thr Glu Lys331 Leu Ile Arg Glu Lys Asp Glu Glu Leu Arg Arg Met Gln Glu Met346 Leu Glu Lys Met Gln Ala Gln Met Gln Gln Ser Gln Ala Gln Gly361 Glu Gln Ser Asp Ala Leu(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5TCAGGGATCC ATGGACAAGG AGTACGTGG 29(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6TTGGGTCGAC TCAGAGGGCG TCTGACTGC 29(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7TTGGTCTAGA TCAGAGGGCG TCTGACTGC 29
權利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特徵在於，它包括編碼具有人HSLARP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸21-1121位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸21-1121位的核苷酸序列雜交。
2.如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸21-1121位的核苷酸序列。
4.一種分離的HSLARP蛋白多肽，其特徵在於，它包括具有SEQ ID NO.4胺基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權利要求4所述的多肽，其特徵在於，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特徵在於，它含有權利要求1所述的DNA。
7.一種用權利要求6所述載體轉化的宿主細胞。
8.如權利要求7所述的宿主細胞，其特徵在於，該細胞是大腸桿菌。
9.如權利要求7所述的宿主細胞，其特徵在於，該細胞是真核細胞。
10.一種產生具有HSLARP蛋白活性的多肽的方法，其特徵在於，該方法包括(a)將編碼具有HSLARP蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成HSLARP蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸21-1121位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成HSLARP蛋白的重組細胞；(c)在適合表達HSLARP蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有HSLARP蛋白活性的多肽。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，該序列為SEQ ID NO.3中從核苷酸21-1121位。
12.一種能與權利要求4所述的HSLARP蛋白多肽特異性結合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特徵在於，它是權利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特徵在於，它含有權利要求1所述的DNA分子中約8-100個連續核苷酸。
全文摘要
本發明涉及了一種新的人Septin同系物HSLARP蛋白。本發明提供了該新的人HSLARP蛋白的cDNA編碼序列、該序列編碼的多肽,以及利用重組技術生產所述的新的人HSLARP蛋白的方法。本發明還提供了這種新的人HSLARP的應用。
文檔編號C07K14/47GK1246530SQ9811103
公開日2000年3月8日 申請日期1998年8月31日 優先權日1998年8月31日
發明者餘龍, 張宏來, 高潔, 畢安定, 趙壽元 申請人:上海新黃浦復旦基因工程有限公司