β-1,4-內切木聚糖酶(AorXyn11A)基因耐熱性改造的理性設計及雜合酶的製備的製作方法
2023-09-16 08:12:25
專利名稱：β-1,4-內切木聚糖酶(Aor Xyn11A)基因耐熱性改造的理性設計及雜合酶的製備的製作方法
技術領域：
本發明涉及源自米麴黴(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株的常溫木聚糖酶(Aor XynllA)基因進行熱穩定性的定向改造，雜合木聚糖酶工程菌的構建及重組雜合木聚糖酶的高效表達的方法，屬於生物工程技術領域。
背景技術：
木聚糖酶(EC 3. 2. I. 8)是一類重要的工業用酶。它主要是作用於木聚糖主鏈，隨機地切開木聚糖內部的木糖苷鍵，水解產物主要為不同聚合度的木寡糖和少量的木糖，是木聚糖降解酶中最關鍵的酶。近幾年，由於木聚糖酶在飼料工業、食品加工及釀造等行業具有潛在的工業應用和經濟價值，尤其是在工業造紙上的應用，減少因漂白產生的環境汙染，受到了越來越多的關注。然而在許多工業中，木聚糖酶都需要在高溫條件下進行操作，因此 對木聚糖酶耐熱性的研究也引起了國內外研究的高度重視。開發耐熱型木聚糖酶的研究主要包括篩選超耐熱的木聚糖酶生產菌和利用基因工程對酶分子進行定向改造，相對於篩菌技術的盲目性，後者具有更強的針對性，受到國內外學者的親睞。根據木聚糖酶催化區域的結構和性質分析，可將其分為不同的家族，其中以糖苷水解酶第10家族和第11家族居多。由於G/11家族的木聚糖酶分子量較小，且結構比較簡單，更適合作為理論研究的分子模型，可以用於極端條件下木聚糖酶催化模式系統及蛋白質分子摺疊機理等的研究。基因工程技術、生物信息學以及計算機科學的快速發展，為分子生物學的研究開闢了新的前景。我們可以運用大規模高性能的計算機及其相關軟體，結合基因工程手段，利用模擬試驗對酶分子進行定向改造以提高熱穩定性，加速木聚糖酶在各種領域中的應用過程。
發明內容
本發明的目的是提供一種新型地利用計算機技術與生物信息學方法對常溫的木聚糖酶進行理性設計，運用基因工程的方法構建雜合木聚糖酶工程菌以及重組雜合木聚糖酶的高效表達的方法。將源自A. oryzae CICC 40186的第11家族的木聚糖酶命名為AorXynllA，其相應的基因命名為Aor xynllA ;採用的模板為同家族的超耐熱木聚糖酶，將其命名為EvXynATS，基因序列為EvXynATS ;由定向改造得到的兩種雜合木聚糖酶分別命名為a -Aor xynl IAts β -Aor xynllATS,其相應的基因為 a -Aor xynl IAts β -Aor xynl I Ats ,其熱穩定性有了很大的提高，有較大的工業化生產和應用潛力以及經濟價值。本發明的技術方案一種來源於A. oryzae CICC 40186的木聚糖酶基因(AorxynllA)在計算機輔助下進行理性設計,得到兩種雜合木聚糖酶a -Aor XynlIAts,其完整的 mRNA 序列分別為 SEQ ID NO l,R β-Aor Xyn I IAts，其完整的 mRNA 序列為 SEQ ID NO:
3。這兩種酶統稱為Aor XynllAis0A. oryzae菌株購於中國工業微生物菌種保藏中心(China Center of IndustrialCulture Collection, CICC)，編號為 40186。所述的由完整mRNA推導的α-Aorβ-Aor XynlIAts胺基酸序列分別為 SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO :4。所述的重組木聚糖酶的活性測定方法 於25mL具塞試管A和B中，各加入用pH 4. 6、檸檬酸-Na2HPO4緩衝液配製的質量濃度為O. 5%的樺木木聚糖(Sigma, USA)溶液2. 4mL, 50°C預熱IOmin,在A管中加入O. ImL適當稀釋的酶液，50°C準確反應15min;立即各加入2. 5mL 3'，5' - 二硝基水楊酸(DNS)試劑，在B管中再補加O. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ;冷卻後各加去離子水5mL，搖勻；540nm處以B管為空白對照測定A管吸光度值，並從木糖標準曲線上查出相應的還原糖(以木糖計)含量並折算成酶活性單位。酶活性單位定義在本測定條件下，以每分鐘產生I μ mo I還原糖所需的酶量定義為I個木聚糖酶活性單位(IU)。所述的耐熱雜合木聚糖酶基因的設計、克隆及表達(I)同源建模模擬Aor XynllA的空間結構登錄蛋白質結構資料庫Protein databank (http: / / rcsb. org),經BLAST比對,找到與Aor XynllA具有高度同源序列。本實驗選擇具有非常高的熱穩定的EvXynATS (Protein Data Bank登錄號為2VUL,本實驗室已經合成這段基因序列)為模板，並且兩者的同源性為66. 49%，運用SWISS-MODEL伺服器在線全自動為Aor XynllA構建空間結構。運用軟體Verify_3D對同源建模的結構模型進行評估和優化，獲得準確性較高的空間結構模型。其中，由於Aor XynlIA存在一段長度為44個胺基酸的信號肽，因此在同源建模過程中去掉這一段序列，為了保證後續分子動力學研究的準確性，需要充分評估建模獲得的三級結構的可靠性。(2)利用分子動力學(Molecular Dynamics, MD)模擬的方法理性設計熱穩定性提高的雜合基因使用GR0MACS4. O軟體對由(3)得到的Aor XynllA空間結構和耐熱型EvXynAis分別進行分子動力學模擬。採用的力場是GR0M0S96力場，該力場中蛋白的立場參數數據均給予實驗值擬合。模擬溫度為300K，溶劑採用TIP3P水模型。對於每個模擬體系，均在溶質外圍加上I. 5nm的水分子層。MD模擬之前，對體系分別進行了兩次能量優化，首先約束溶質，用最陡下降法優化800步，再用共軛梯度法優化1200步。然後去約束後再進行800步最陡下降法優化，1200步共軛梯度法優化。MD模擬分為兩步首先進行20ps的約束溶質分子的MD模擬，此時溫度從OK逐步升高到300K ;接著進行500ps的無約束恆溫MD模擬。最後分別得到常溫Aor XynllA和超耐熱EvXynATS總體能量和RMSD值及Aor XynllA各個胺基酸的B-factor值。(3)雜合基因α-Aor XynllATlP β-Aor XynllATS及其表達質粒的構建根據GenBank上EvXynATS基因序列(登錄號為EU 591743. I)設計引物EF，與Aor xynllA公用引物的TMl, TM2 EF 5/ -GAATTCAACGCTCAAACTTGTCTTACC-3'，含 EcoR I 酶切位點TMl 5/ ~TGCCGACGTTGGACCAGTTAGAAGTGTAACGA~3/，含公共序列TM2 5/ -GAAGCTTCCGGAGTAGGTGATGTTACGACGACTTCCAG-3'以本實驗保存的PUCm-T-EvXynATS為模板，以EF和TMl為引物進行第一輪PCR ;以本實驗室保存的pUCm-T-Aor xynllA為模板，以第一輪PCR反應液和XynllA-R為引物進行第二輪PCR ;將引物EF在冰上直接加入到上一輪PCR管中，進行第三輪PCR。將第三輪PCR產物用I %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶並與pUCm-T連接(pUCm-T- a -Aorxynl 1ATS)，pUCm-T- β -Aor xynlIAts按照同樣的方法以TM2為引物獲得。分別轉化JM109，經酶切鑑定正確後送上海生工測序。將測序結果正確的pUCm-T-a-Aor xynl IAts, pUCm-T-β-Aor xynllATS 和 pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，割膠回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒 pPIC9K- a -Aor xynl IAts 和 pPIC9K_ β -Aor xynl IAts (圖 I)，並對重組表達質粒進行序列測定。(4) GSl 15/ a -Aor xynlIAts 和 GSl 15/β-Aor xynlIAts 重組子的構建、表達及酶活的測定用 Sal I 對pPIC9K-a-Aor xynllATlPpPIC9K_Aor xynlIAts分別進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/a-Aor xynlIAts和GS115/i3-Aor xynlIAts ;按照手冊上的標準流程進行誘導表達；發酵液經冷凍離心，獲得了電泳重組木聚糖酶電泳圖。
圖I :重組質粒pPIC9K_Aor xynlIAts的構建示意圖
具體實施例方式以下結合具體實施例，進一步闡述本發明的操作方法。但是這些實施例僅用於詳細說明本發明，而不用於限制本發明的範圍。實施例I同源建模模擬Aor XynllA及其雜合蛋白的空間結構登錄蛋白質結構資料庫Proteindata bank (http://rcsb. orR),經BLAST 比對，找到與Aor XynllA具有高度同源序列。本實驗選擇具有非常高的熱穩定的EvXynATS(ProteinData Bank登錄號為2VUL)為模板，並且兩者的同源性為66. 49%，運用SWISS-MODEL伺服器在線全自動為AorXynllA構建空間結構。運用軟體Verify_3D對同源建模的結構模型進行評估和優化，獲得準確性較高的空間結構模型。實施例2利用分子動力學模擬的方法理性設計熱穩定性提高的雜合基因分別對通過同源建模獲得的野生型Aor XynllA的晶體結構和耐熱型EvXynATS進行分子動力學模擬。主要包括以下幾步首先我們對空間結構進行預處理，使用GR0MACS中的pdb2gmx命令添加所有缺失的氫原子，並輸出一個包含所有原子信息的.gro文件。該命令的格式為pdb2gmx-f llbs.pdb-o libs, gro-p libs, top-ignh-ter第二步利用GROMACS中的editconf和genbox命令為Aor XynllA空間結構添加適當的水溶液來模擬Aot XynllA在水溶液中的運動。其中溶劑釆用TIP3P水模型，對於模擬的體系，在溶質外圍加上I. 5nm的水分子層。其具體過程是首先使用editconf命令定義盒子的大小，然後用genbox命令讀入GR0MACS的結構文件，並讀入水盒子的大小，輸出文件包含分子文件和水盒子。同時genbox更改原來的top文件,使其含有水分子。該命令的格式為Editconf-f libs. gro~o libs—box. gro-bt cubic-d I. 5Genbox-cp libs—box. gro-cs-p libs, top-o libs—water, gro
第三步用金屬離子平衡體系的電荷,命令格式為grompp-f em. mdp-c llbs_water_ion. gro-p libs, top-o minimize—water, tprgenion-s minimize—water, tpr-o llbs_water_ion. gro-p libs.top-pnameNa+_np 10-random-g trp_ion. loggenion-s minimize—water, tpr-o llbs_water_ion. gro-p libs.top-nnameCL—nn l—random-gtrp—ion. log並且需要手動對得到的libs—water—ion. gro與libs, top文件中的原子數目進行修改，與添加的金屬離子相匹配。第四步分別利用grompp和mdmn兩個命令進行能量最小化處理。首先約束溶質，用最陡下降法優化800步，再用共軛梯度法優化1200步。然後去約束後再進行800步最陡 下降法優化，1200步共軛梯度法優化。命令格式為grompp-f emstl. mdp-c Ilbs_water_ion. gro-p libs.top-o minimize—water,tprmdrun-s minimize—water, tpr-o minimize—water, trr-c minimize—water, gro-eminimize—water, edr-g minimize—water, loggrompp-f emst. mdp-c minimize—water, gro-p libs, top-o minimize—water, tprmdrun-s minimize—water, tpr-o minimize water, trr-c minimize—water2.gro-e minimize—water, edr-g minimize—water, log第五步分子動力學模擬分為兩步，首先進行20ps的約束溶質的MD模擬，此時模擬溫度從OK逐步升高到300K ;然後進行500ps的無約束恆溫MD模擬。命令格式為grompp-f pr. mdp-c minimize—water2. gro-p libs, top-o minimize—waterl. tprmdrun-s minimize—waterI.tpr-o minimize—waterI. trr-c minimize—waterI.gro-e minimize—waterl. edr-g minimize—waterl. loggrompp-f full, mdp-c minimize—waterl. gro-p libs.top-o minimize—water2.tprmdrun-s minimize—water2. tpr-o minimize—water2.trr-c minimize—water3.gro-e minimize—water2. edr-g minimize—water2. log最後得到其總體能量，RMSD值及Aor XynllA各個胺基酸的B-factor值。命令格式為g_rms-s minimize_waterl. tpr-f minimize_waterl. trr-o rms. xvgxmgrace-nxy rms. xvgg—rmsf-s minimize—water2. tpr-f minimize—water2. trr_b 400_e 600_o rmsf.xvg-oq I. pdbxmgrace-nxy rmsf. xvgg—energy-f minimize—water2-o energy.xvgxmgrace-nxy energy, xvg 我們分別將MD得到的Aor XynIIA和已知的EvXynATS各個胺基酸的B_factor值導入到PDB文件中，使用B-FITTER軟體導出各個胺基酸的B-factor值，由圖可以看出EvXynAis序列中各胺基酸的柔性較小，波動幅度較為平均，而Aor XynllA序列尤其是N端較為不穩定，可通過N端序列替換方法進行分子改造。我們分別隨機選取Aor XynllA的N端適當胺基酸數分別用EvXynATS相應的序列進行替換改造，然後我們以EvXynATS為模板，分別對雜合木聚糖酶進行同源建模，運用分子動力學模擬方法分別對雜合蛋白進行總體能量及RMSD值的計算。由結果我們得出將Aor XynllA的N端37個胺基酸由EvXynATS的N端42個胺基酸替換，S卩a-Aor XynllAτs，及62個EvXynAτs替換Aor XynllA的N端57個胺基酸，即β -Aor XynllATS，這兩種雜合酶的總體能量和RMSD值相對較小，即熱穩定性較好。實施例3兩種雜合基因a-Aor xynllAT4P β-Aor xynl IAts及其表達質粒的構建採用重疊PCR技術構造融合基因，主要分為三步以EF和TMl為引物進行第一輪PCR(940C 2miN ;30 個循環，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 12s ；72°C IOmin);以第一輪的反應液和 XynllA-R 為引物進行第二輪 PCR(94°C 2min ;10 個循環，94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 40s ；72°C IOmin) ;EF在冰上直接加入到上述per管中，以EF和XynllA-R為引物進行第三輪PCR(940C 2miN ;30 個循環，94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 40s ；72°C IOmin)。將第三輪 PCR產物用I %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶並與pUCm-T連接(pUCm-T- a -Aor xynllATS),轉化JM109，經酶切鑑定正確後送上海生工測序。將測序正確的pUCm-T- a -Aor xynlIAts與PPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，回收的酶切產物在T4 DNA連接酶的作用下 進行連接，得到重組質粒pPIC9K- a -AorxynIIAts,並對重組表達質粒進行序列測定。以同樣的方法得到 pUCm-T-β -Aor xynlIAts 和 pPIC9K_i3 -Aor xynlIAts,並送去測序。實施例4GS115/a-Aor xynlIAt^P GSl 15/β-Aor xynllATS 重組子的構建、表達及酶活的測定用Sal I 對 pPIC9K_ a-Aor xynllATS 和 pPIC9K_ β-Aor xynl IAts 分別進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/a-Aorxyn 11 Ats和GS115/β-Aor xynl IAts。該工程菌用1.0%甲醇誘導72h。離心上清液為重組木聚糖酶粗酶液，經SDS-PAGE檢測為單一條帶,顯示重組木聚糖酶a-Aor XynllATi^P β-AorXynlIAts分子量分別約為25kDa和29kDa，重組木聚糖酶最適反應溫度分別為75°C和80°C。
權利要求
1.一種源自米麴黴(Aspergillus oryzae)CICC 40186、歸屬於糖苷水解酶第11家族的常溫木聚糖酶基因Aor xynllA,以另一個同家族的超耐熱木聚糖酶基因EvXynATS為模板，利用計算機技術及其相關軟體，結合分子動力學模擬的方法，對Aor XynllA分子進行理性設計，定向改造以提高熱穩定性。
2.利用分子動力學模擬的方法理性設計熱穩定性提高的雜合基因 (1)同源建模模擬AorXynllA的空間結構登錄蛋白質結構資料庫Protein databank (http: //rcsb. org),經BLAST比對,找到與Aor XynllA具有高度同源的序列；本實驗選擇熱穩定非常高的EvXynATS (Protein Data Bank登錄號為2VUL)為模板，並且兩者的同源性為66. 49%，運用SWISS-MODEL伺服器在線全自動為A. oryzae常溫木聚糖酶成熟肽構建空間結構；運用軟體Verify_3D對同源建模的結構模型進行評估和優化，獲得準確性較聞的空間結構|旲型； (2)利用分子動力學模擬的方法理性設計熱穩定性提高的雜合基因使用GR0MACS4.0軟體對由(I)得到的Aor XynllA空間結構和耐熱型EvXynATS分別進行分子動力學模擬；採用的力場是GR0M0S96力場，該力場中蛋白的立場參數數據均給予實驗值擬合；模擬溫度為300K，溶劑採用TIP3P水模型；對於每個模擬體系，均在溶質外圍加上I. 5nm的水分子層；MD模擬之前，對體系分別進行了兩次能量優化，首先約束溶質，用最陡下降法優化800步，再用共軛梯度法優化1200步；然後去約束後再進行800步最陡下降法優化，1200步共軛梯度法優化；MD模擬分為兩步首先進行20ps的約束溶質分子的MD模擬，此時溫度從OK逐步升高到300K ;接著進行500ps的無約束恆溫MD模擬；最後分別得到常溫Aor XynllA和超耐熱EvXynATS總體能量和RMSD值及Aor XynllA各個胺基酸的B_factor值； 我們分別將由MD得到的Aor XynllA和已知的EvXynATS各個胺基酸的B-factor值導入到PDB文件中，使用B-FITTER軟體導出各個胺基酸的B-factor值，由作圖可以看出EvXynATS序列中各胺基酸的柔性較小，波動幅度較為平均，而Aor XynllA序列尤其是N端較為不穩定，可通過N端序列替換方法進行分子改造；我們分別隨機選取Aor XynllA的N端適當胺基酸數分別用EvXynATS相應的序列進行替換改造，然後我們以EvXynATS為模板，分別對雜合木聚糖酶進行同源建模，然後運用分子動力學模擬方法分別對雜合蛋白進行計算總體能量及RMSD值。由結果我們得出將Aor XynllA的N端37個胺基酸由EvXynATS的N端42個胺基酸替換，S卩a-Aor XynllAτs，及62個EvXynAτs替換Aor XynllA的N端57個胺基酸，即β -Aor XynlIAts，這兩種雜合酶的總體能量和RMSD值相對較小，即熱穩定性較好。
3.雜合木聚糖酶工程菌的構建和表達方法 (I)雜合基因a-Aor xynllATlP β-Aor xynl IAts及其表達質粒的構建根據GenBank上EvXynATS基因序列(登錄號為EU 591743. I)設計引物EF，與Aor xynllA公用引物TMl和 TM2 EF 5/ -GAATTCAACGCTCAAACTTGTCTTACC-3'，含 EcoR I 酶切位點 TMl 5/ ~TGCCGACGTTGGACCAGTTAGAAGTGTAACGA~3/，含公共序列TM2 5/ -GAAGCTTCCGGAGTAGGTGATGTTACGACGACTTCCAG-3' 採用重疊PCR技術構造雜合基因，主要分為三步以EF和TMl為引物進行第一輪 PCR (94 °C 2min ；30 個循環，94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 12s ；72 °C IOmin);以第一輪的反應液和XynllA-R為引物進行第二輪PCR(94 °C 2min ;10個循環，94°C 30s, 52 °C 30s，72°C 40s ；72°C IOmin) ;EF在冰上直接加入到上述PCR管中，以AF和XynllA-R為引物進行第三輪 PCR(94 °C 2min ;30 個循環，94°C 30s, 52 °C 30s, 72 °C 40s ；72°C IOmin);將第三輪PCR目的條帶進行克隆、測序；測序正確的pUCm-Τ-α -Aor xynlIAts與pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K- a -Aor xynlIAts,並對重組表達質粒進行序列測定；以同樣的方法得到pUCm-Τ-β -Aor xynl IAts 和 pPIC9K_i3 -Aor xynl IAts,並送去測序； (2)GS115/a-Aor xynlIAts 和 GSl 15/β-Aor xynlIAts 重組子的構建、表達及酶活的測定用 Sal I 對 pPIC9K-a -Aor xynlIAts 和 ρΡΙ09Κ-β -Aor xynl IAts 分別進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/a-Aor xynlIAts和GS115/P -Aor xynlIAts ;該工程菌用I. 0%甲醇誘導72h ;離心上清液為重組木聚糖酶粗酶液，經SDS-PAGE檢測均為單一條帶,顯示重組木聚糖酶a-Aor xynllATi^Pβ -Aor xynlIAts分子量分別約為25kDa和29kDa，重組木聚糖酶最適反應溫度分別為75°C和 80。。。
全文摘要
本發明提出了一種新型地利用計算機技術與生物信息學方法對常溫的木聚糖酶進行理性設計，運用基因工程的方法構建雜合木聚糖酶工程菌以及重組雜合木聚糖酶的高效表達的方法。將來源於米麴黴(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株的常溫木聚糖酶基因進行熱穩定性定向改造，獲得了兩種雜合木聚糖酶，其熱穩定性有了很大的提高，作為一種耐熱型的酶製劑，該木聚糖酶具有較大的工業化生產潛力和經濟價值。
文檔編號C12N15/63GK102719457SQ20111041055
公開日2012年10月10日 申請日期2011年12月12日 優先權日2011年12月12日
發明者張慧敏, 李劍芳, 汪俊卿, 鄔敏辰, 高樹娟 申請人:江南大學