一種大規模生產動物用狂犬病毒抗原的方法
2023-09-16 12:37:30
專利名稱：一種大規模生產動物用狂犬病毒抗原的方法
技術領域：
本發明屬於獸用生物製品技術領域，涉及動物病毒，更具體涉及生產動物用狂犬 病毒抗原的方法。
背景技術：
狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus, RV)感染引起的一種病症嚴重、病死率極 高的自然疫源性人獸共患傳染病，死亡率幾乎100%，目前尚無有效的治療措施。野生動物 是RV的主要儲存宿主，人一旦被攜帶狂犬病毒的此類動物咬傷，就會感染髮病，其病死率 為100%。根據衛生部最新公布的傳染病疫情統計數據，顯示近年來狂犬病繼續呈現兇險的 跡象。但是狂犬病沒有特殊有效的治療手段，注射狂犬病疫苗是唯一有效手段。目前市場上的狂犬病毒疫苗基本都是採用轉瓶工藝傳代細胞培養的，大規模生產 需要大量的物力人力資源，成本較高，並且批間差異大，質量不穩定。高效的疫苗生產需要大量的以高產量從宿主系統中生產出病毒。病毒株生長的培 養條件對於獲得該株系的可接受的高產量來說具有重大意義。因此，為了最大化所想要的 病毒的產量，系統和培養條件都必須特定地適合於提供對於產生所想要的病毒來說有利的 環境。
發明內容
本發明要解決的技術問題是克服現有工藝存在的不足之處，提供一種潮汐式細胞 微載體懸浮培養系統大規模生產動物用狂犬病毒抗原的方法。該方法生產工藝簡單且穩 定、易操作，病毒抗原產量高，批間差異小，質量易控制，可顯著提高疫苗產量和質量，降低 成本。為達到上述目的，本發明利用生物反應器，以細胞微載體懸浮培養系統生產動物 用狂犬病毒抗原，包括下列技術步驟(1)培養製備抗原用細胞將製備抗原用宿主細胞接種到含有培養液與微載體的載體罐中，並將上述細胞與 微載體混合均勻，啟動貼附程序，使細胞貼附在微載體上；切換細胞培養程序，在適當培養 環境下，提供上述細胞足夠的養分和適宜的氣體環境，使細胞在上述微載體上生長至接種 濃度的5 40倍。(2)毒液的接種與繁殖將狂犬病毒製成病毒懸液，使其吸附到上述細胞上；換用細胞維持培養液，在適當 培養環境下培養病毒；連續培養3 5日後，第一次收穫病毒液，採用半連續工藝，換液比例 為50% ；繼續培養9 11日，每24h收穫換液一次，換液比例為50%。(3)經檢驗合格後，將半連續工藝收穫的病毒液與生物反應器的病毒液混合， 於-20°C凍融兩次，滅活純化得到狂犬病毒抗原。病毒液檢驗按《中華人民共和國獸藥典》2005年版附錄15、19、20頁的相關規定進行檢驗，完全符合，安全無副作用，無細菌、黴菌、支原體及外源病毒汙染。通過小鼠腦內 接種法測定，病毒液每1. 0ml病毒含量> 107 0LD50 ；上述技術方案中，所述的宿主細胞為可增殖狂犬病毒的細胞系，如倉鼠腎細胞細 胞系(BHK21)等。本發明方法中所述的培養液最好是95 % 98 % DMEM，加2 % 5 %牛血清，加適量 抗菌素，PH值為7. 0 7. 4較好。上述技術方案中，所述接種的狂犬病毒可以是LEP-Flury毒株。上述技術方案中，所述的適宜本發明的微載體可以為具有網狀結構的纖維，如聚
酯纖維等。本發明方法中細胞獲得氣體交換的方式可以通過培養液液面升降的方式實現。上述技術方案中，步驟(1)中，一般啟動貼附程序後4h換成細胞培養程序。所述細 胞貼附程序最佳參數為up :2400mL/min hold lmin、Down :2400mL/min hold lmin、設定最 大換液量18500mL ；細胞培養程序最佳參數為up :1800mL/min hold lmin、Down 1800mL/ min hold lmin、設定最大換液量18500mL。上述技術方案中，步驟(1)中所述微載體用量為每500ml培養液添加5. 5g微載體 較好，細胞的初始接種量為1. 8 3. 6X 107cellS/g微載體較好。上述技術方案中，步驟(2)中所述接種病毒時細胞密度一般為1. 1X108 1.0X109cells/g 微載體。上述技術方案中，步驟⑵中所述接種病毒時按病毒感染複數(M.0. I.)為 0.01 1的比例。上述技術方案中，步驟(2)中，一般啟動吸附程序後4h換成病毒培養程序，所述病 毒吸附程序最佳參數為up :1500mL/min hold lmin、Down :1500mL/min hold lmin、設定最 大換液量18500mL ；病毒培養程序最佳參數為up :1000mL/min hold lmin、Down 1000mL/ min hold lmin、設定最大換液量18500mL。上述技術方案中，細胞與病毒培養的環境溫度一般為36°C 37°C，培養環境中含 有C02濃度為2. 5% 5%較好。本發明方法中，潮汐式微載體懸浮培養技術採用的生物反應器主要由載體罐、儲 液罐、PH控制器、D0監測器、輸入和輸出系統組成。工作過程如下細胞貼附在載體罐中的 載體上生長，當儲液罐的培養液被泵入載體罐時，培養液液面上升向細胞供給養分並促進 細胞新陳代謝產物的去除；當載體罐的培養液泵入儲液罐時，培養液面隨之下降，使細胞進 行通風，促進呼吸，減小細胞切向壓力，無02供應限制，無泡沫煩惱。這個重複的運動使載 體上的細胞能夠得到足夠的營養和02，同時產生的代謝廢物如C02能夠有效的被排出去，從 而能夠大量的擴增細胞並增值病毒，此種技術稱之為潮汐式微載體懸浮培養技術。本發明所提供的以潮汐式細胞微載體懸浮培養系統生產動物用狂犬病毒抗原的 方法，與傳統轉瓶傳代細胞培養技術相比，更具有以下優點1.採用本發明方法，解決了傳統轉瓶大規模生產時單批產量不高、批間差異大、產 品質量不穩定、勞動強度大、生產成本高等問題。2.本發明方法中採用的載體為網狀的聚酯纖維，具有親水性和生物無害性，lg載 體約佔15ml的空間，可提供2400cm2的貼壁面積，在同樣的空間內極大的增大了細胞的貼
4壁面積，增加了細胞生長的密度，細胞數可達到1.0X109以上，其效能為傳統轉瓶培養系統 的數十倍，可以節省許多成本及人力。3.本發明方法製備的細胞接種量低，控制容易，且病毒感染效率高，得到的高滴度 的抗原可以大大提高疫苗的免疫能力。本發明提供一種新的工藝技術，能夠極大的滿足病毒大量繁殖所需要的條件，並 且能夠製備高滴度的抗原，極大的滿足疫苗製備所需，顯著提高了疫苗的產量和質量，降低 生產成本。
具體實施例方式實施例中所使用的生物反應器為美國CESC0公司生產的TideCell-020型，所使 用的載體為該公司的BioNoc II聚酯纖維，寬5mm，長10mm，lg載體約佔15ml的空間，提供 2400cm2的貼壁面積，可提供1. OX 109以上數量的細胞生長。實施例11.病毒與細胞株用於製備狂犬病毒抗原的病毒株為LEP-Flury毒株，經過致病性測試，該毒株病 毒不具有致病性。以對該病毒株具有良好敏感性的細胞系倉鼠腎細胞(BHK21)，作為制苗用 細胞系，藉以感染並大量繁殖狂犬病毒。2.製備方法(1)將製備抗原用細胞系倉鼠腎細胞(BHK21)接種到加有DMEM液體培養基(包 括 5%牛血清、0. 01mol/LNaHC03>0. lmg/ml 硫酸卡那黴素(kanamycinsulfate)、100，000IU 青黴素G鈉鹽(Penicillin G Sodium)、pH值為7. 2)與BioNoc II聚酯纖維的載體罐內； 微載體用量為每500ml培養液添加5. 5g微載體，細胞初始接種量為2. 7 X 107cells/g微載 體。(2)於37°C、5% C02培養環境下，細胞貼附4h，使上述製備抗原用細胞與微載體 混合均勻，並使細胞貼附在微載體上。貼附程序參數為up :2400mL/minhold lmin、Down 2400mL/min hold 30s、設定最大換液量18500mL ;4h後切換為細胞培養程序，細胞培養 程序參數為up :1800mL/min hold lmin、Down :1800mL/min hold lmin、設定最大換液量 18500mL。(3)於37°C、5% C02培養環境下，使細胞在上述微載體上生長，待細胞達到 4.0X1010cell時，換用添加2%牛血清的DMEM細胞維持培養液，按病毒感染複數(M. 0. I.) 為0. 01的比例接種狂犬病毒LEP-Flury毒株，並使之感染細胞，使病毒增值，病毒吸附程序 為up :1500mL/min hold lmin、Down :1500mL/min hold lmin、設定最大換液量 18500mL ; 病毒培養程序up :1000mL/min hold lmin、Down lOOOmL/min hold lmin、設定最大換液量 18500mL ；(4)於37°C、5%C02培養環境下繼續培養；培養5日後，第一次收穫，採用半連續 工藝，換液比例為50% ；連續培養11天，每24h收穫一次，每次換液比例為50% ；(5)將半連續工藝收穫的病毒液與生物反應器的病毒液於-20°C凍融兩次後混 合，並進行以下檢驗(a)純淨性檢驗按《中華人民共和國獸藥典》2005版附錄15、19、20頁相關規定進行檢驗，結果無細菌、黴菌、支原體及外源病毒汙染。(b)病毒含量測定按照常規小鼠腦內接種法進行。即將收穫的狂犬病毒液用滅 菌生理鹽水進行10倍系列稀釋，每個病毒液取10_3 10_6各4個稀釋度，每個稀釋度通過 腦內接種注射4隻11 13g的昆明系小鼠，0. 03ml/只，連續觀察14天，記錄14天後小鼠 死亡情況，並根據Reed-Muench法計算病毒含量，每1. 0ml含病毒> 107 0LD50 ；(c)特異性將毒種(疫苗)用滅菌生理鹽水稀釋成為每1ml含有100個小鼠的 最小感染量的病毒懸液，與等量的抗狂犬病毒特異性血清充分混合，置10 15°C中和lh， 其間振搖2 3次。同時設立陽性對照組(病毒對照)和陰性對照組(生理鹽水)。中和 結束後分別接種小鼠2隻，每隻腦內注射0. 03ml。除陽性對照組全部死亡外，其餘兩組在接 種後2周內精神狀態良好，無不良反應。(6)經檢驗合格的每毫升病毒含量> 107 0LD50的狂犬病毒原液經過滅活離心純化 得到狂犬病毒抗原。對比例懸浮培養工藝與傳統轉瓶培養技術比較通過對大規模潮汐式細胞微載體懸浮培養系統與常用轉瓶培養系統相關生產性 能指標進行對比，結果如表1所示。表1不同培養系統增殖狂犬病毒的相關比較 備註BioN0C II載體貼壁面積lg = 2400cm2,1個TideCell_020微載體懸浮培養 系統加入BioNOC II載體220g。上列詳細說明系針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限 制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案 之專利範圍中。
權利要求
一種狂犬病毒抗原的製備方法，利用生物反應器，以細胞微載體懸浮培養系統大規模生產狂犬病毒抗原，包括如下技術步驟(1)培養製備抗原用細胞將可增殖狂犬病毒的細胞系接種到含有培養液與微載體的載體罐中，並將上述細胞與微載體混合均勻，啟動貼附程序，使細胞貼附在微載體上；切換細胞培養程序，在適當培養環境下，提供上述細胞足夠的養分和適宜的氣體環境，使細胞在上述微載體上生長至接種濃度的5～40倍；(2)毒液的接種與繁殖將狂犬病毒製成病毒懸液，使其吸附到上述細胞上；換用細胞維持培養液，在適當培養環境下培養病毒；連續培養3～5日後，第一次收穫病毒液，採用半連續工藝，換液比例為50％；繼續培養9～11日，每24h收穫換液一次，換液比例為50％；(3)經檢驗合格後，將半連續工藝收穫的病毒液與生物反應器的病毒液混合，於-20℃凍融兩次，滅活純化得到狂犬病毒抗原。
2.根據權利要求1所述的狂犬病毒抗原的製備方法，其特徵在於，所述細胞微載體懸 浮培養系統為潮汐式。
3.根據權利要求2所述的狂犬病毒抗原的製備方法，其特徵在於步驟(1)中啟動貼附 程序4h後切換培養程序；所述的細胞貼附程序參數為up :2200 2600mL/min hold 40 100s、Down 2200 2600mL/min hold 40 75s、設定最大換液量18500mL ；細胞培養程序 參數為up 1600 2000mL/min hold40 100s、Down 1600 2000mL/min hold 40 100s、設定最大換液量18500mL。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(2)中啟動吸附程序後4h換成病毒培 養程序，所述病毒吸附程序參數為up 1300 1700mL/min hold40 100s、Down 1300 1700mL/min hold 40 75s、設定最大換液量18500mL ；病毒培養程序參數為up 1000 1400mL/min hold 40 100s、DownlOOO 1400mL/min hold 40 100s、設定最大換液量 18500mLo
5.根據權利要求2所述的狂犬病毒抗原的製備方法，其特徵在於所述可增殖狂犬病毒 的細胞係為倉鼠腎細胞系；培養液為95% 98% DMEMJn 2% 5%牛血清，加適量抗菌 素，PH值為7. 0 7. 4 ；所述微載體為聚酯纖維。
6.根據權利要求2所述的狂犬病毒抗原的製備方法，其特徵在於細胞培養溫度36 37°C，培養環境中含有2. 5% 5%二氧化碳。
7.根據權利要求2所述的狂犬病毒抗原的製備方法，其特徵在於微載體用量為每 500ml培養液添加5. 5g微載體，細胞初始接種量為1. 8 3. 6 X 107cellS/g微載體。
8.根據權利要求2所述的狂犬病毒抗原的製備方法，其特徵在於步驟(2)所述的接種 狂犬病毒時的細胞密度為1. IXlO8 1.0X109cells/g微載體。
9.根據權利要求2所述的狂犬病毒抗原的製備方法，其特徵在於，步驟(2)按病毒感染 複數(M. 0. I.)為0. 01 1的比例接種病毒。
全文摘要
本發明公開了一種大規模生產動物用狂犬病毒抗原的方法，利用生物反應器，以細胞微載體懸浮培養系統大規模生產狂犬病毒抗原將製備抗原用細胞接種到含有培養液與微載體的載體罐中，使細胞貼附在微載體上；在適當培養環境下，使細胞在上述微載體上生長至接種濃度的5～40倍；將狂犬病毒製成病毒懸液，使其吸附到上述細胞上；換用細胞維持培養液，在適當培養環境下培養病毒；連續培養3～5日後，第一次收穫病毒液，採用半連續工藝，換液比例為50％；繼續培養9～11日，每24h收穫換液一次；將收穫的病毒液與生物反應器的病毒液混合，於-20℃凍融兩次，滅活純化得到狂犬病毒抗原。該方法生產規模大、單批次產量高、生產成本相對較低。
文檔編號C12N7/02GK101851610SQ20101013513
公開日2010年10月6日 申請日期2010年3月30日 優先權日2010年3月30日
發明者喬榮岑, 習向鋒, 孫進忠, 張海洋, 張許科, 李三, 王進產, 陶家權 申請人:洛陽普萊柯生物工程有限公司