一種碳鋼腐蝕細菌的定量檢測方法

2023-09-16 12:42:05 1

專利名稱：一種碳鋼腐蝕細菌的定量檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測領域，具體涉及一種浸海碳鋼腐蝕細菌-海洋玫瑰桿菌族 (Roseobacter clade)細菌定量檢測方法。
背景技術：
微生物腐蝕是一個非常嚴重的環境和工程問題。在美國，腐蝕直接造成的經濟損失每年高達近3千億美元，英國、日本、澳大利亞、德國、科威特、芬蘭、瑞典和印度等國的統計數據也表明，腐蝕損失約佔國家生產總值(GDP)的 5%，依此推算我國每年腐蝕所造成的經濟損失已超過6千億元。近年來，我國海洋石油平臺、海港碼頭和跨海大橋等重大海洋工程設施建設呈現急劇上升趨勢，海洋腐蝕的危害和損失日益加劇，腐蝕微生物檢測和防護技術已成為海洋設施安全和長期有效使用的關鍵。前期研究發現，海洋玫瑰桿菌族細菌是海洋中的一類重要菌群，在浸海物體表面及海水懸浮顆粒物中構成了關鍵初級附著菌，即所謂的「附著拓殖種」(Dang and Lovell, 2000, 2002a, 2002b ；黃進強等，2008)。並且大部分海洋玫瑰桿菌族細菌在浸海固體表面易產生生物膜(Biofilm)，對附著微生物群落的形成、發育和功能熟化及海洋汙損和金屬腐蝕生物群落的發生起到至關重要作用(Lau, et al. ,2003 ；Roa et al. ,2007 ；Dang et al.， 2008)。同時，一些海洋玫瑰桿菌族細菌還可以在一定環境條件下產生次級代謝產物(包括一些抗菌藥物等)(Slightom and Buchan，2009)。因此，海洋玫瑰桿菌族細菌不但可誘發海洋環境中金屬腐蝕的發生，同時其中的一些產抗菌素菌種還可以作為抑制生物汙損和金屬腐蝕的海洋益生菌而被開發利用，從而用以生產抗汙損和抗腐蝕的生物製劑。因此，浸海金屬表面海洋玫瑰桿菌族細菌的附著動態和數量檢測構成了海洋生物汙損和金屬腐蝕防護的一個關鍵。以前對海水中碳鋼腐蝕微生物的檢測方法大多依賴微生物的培養，費時耗力，且因為很多種類的海洋微生物目前尚無法培養，培養法很難達到檢測準確性的要求。黨宏月和黃進強等人(Dangand Lovell, 2000, 2002a, 2002b ；Dang et al.，2008 ； 黃進強等，2008)曾通過細菌16S rRNA基因克隆文庫定性研究方法和DNA分子探針螢光原位雜交(FISH)定量研究技術，對該類細菌在非金屬浸海材料上進行了種類、分布、動態變化等定性和定量研究。FISH細菌定量法在腐蝕微生物檢測應用中存在實驗步驟繁瑣、操作複雜、所用儀器(雷射共聚焦顯微鏡)昂貴並需專業技術人員操作、定量結果誤差大等種種弊端，不適合常規金屬腐蝕微生物檢測和監測這一應用目標。並且，以前的文獻報導大多沒有涉及與碳鋼腐蝕相關的研究。針對海水碳鋼腐蝕微生物群落中海洋玫瑰桿菌族細菌的定量檢測方法目前尚未見科技文獻或專利報導。為了實現該目的，本發明針對浸海碳鋼腐蝕微生物關鍵菌群_海洋玫瑰桿菌族細菌，設計一種不依賴微生物培養的以現代分子生物技術為手段的海洋玫瑰桿菌族細菌定量檢測技術，可以快速準確地檢測該類細菌在浸海碳鋼表面的附著和生長狀況及其隨碳鋼腐蝕程度變化的數量動態變化特徵，為海水碳鋼腐蝕微生物的研究和檢測提供了新技術，大大提高了檢測效率和準確率。該方法快速、高效、準確，並成功地應用於青島沿岸海水碳鋼腐蝕微生物的檢測中，獲得了理想檢測數據。

發明內容
為了實現上述目的，本發明提供一種海洋玫瑰桿菌族(Roseobacter clade)細菌定量檢測方法，包括以下步驟針對海洋玫瑰桿菌族細菌16S rRNA基因，設計特異性引物， 提取樣品中微生物基因組DNA，利用實時螢光定量PCR技術定量檢測樣品中海洋玫瑰桿菌族(Roseobacter clade)細菌。優選的，所述的特異性引物為以 Rose_F :5，-CCGAACAACGCTAACCCC—3，(SEQ ID NO 1)禾口Rose_R 5' -GGCCTACCAAGTCTACGATC-3，(SEQ ID NO :2)。優選的，本發明實時螢光定量PCR條件為95°C變性50秒，之後進行40個PCR循環，每一循環包括95°C變性5秒；56°C退火30秒；72°C延伸45秒，螢光讀值設定為72°C。本發明進一步提供了上述定量檢測方法用於定量檢測浸海碳鋼表面海洋玫瑰桿菌族(Roseobacter clade)細菌的用途。本發明提供的一種以實時螢光定量PCR (fluorescent quantitative real-time PCR，簡稱FQ-PCR)為技術基礎的碳鋼海水腐蝕細菌群落海洋玫瑰桿菌族細菌的定量檢測方法，通過自行設計的用以該檢測技術的FQ-PCR引物對，實現了快速、準確、並且檢測成本低的目標，易於推廣應用。該引物對特異性非常好，並且FQ-PCR反應條件易於優化，該引物對是實現海洋玫瑰桿菌族細菌定量檢測的關鍵技術，特別適用於碳鋼海水腐蝕微生物群落中海洋玫瑰桿菌族細菌定量檢測。


圖1.青島海水中碳鋼腐蝕細菌群落中海洋玫瑰桿菌族細菌的定量檢測及其數量變動特徵(3 5次重複實驗的平均值和標準差)，圖中帶「*」號的條柱為應用本發明自行設計的FQ-PCR引物對(Rose_F* Rose_R)得到的定量檢測結果。該圖還說明，類似的FQ-PCR檢查方法也可用於海水中碳鋼腐蝕細菌群落中其它菌群的定量檢測(只是不同的菌群需用不同的FQ-PCR引物對)。
具體實施例方式本發明提供的一種浸海碳鋼腐蝕細菌-海洋玫瑰桿菌族細菌定量檢測方法，基於實時螢光定量PCR(FQ-PCR)這一基因定量檢測技術原理，通過自行設計針對海洋玫瑰桿菌族細菌的特異FQ-PCR引物對(即一對引物)，在碳鋼海水腐蝕微生物群落中特異性地定量檢測海洋玫瑰桿菌族細菌的16S rRNA基因的豐度，從而實現對碳鋼海水腐蝕微生物群落中海洋玫瑰桿菌族細菌的定量檢測。該檢測技術中，FQ-PCR引物對是實現碳鋼海水腐蝕微生物群落中海洋玫瑰桿菌族細菌定量檢測的關鍵，FQ-PCR引物對的作用是特異性地識別目標細菌的目標基因，這種識別特異性的實現歸功於FQ-PCR引物對DNA序列的設計上。針對碳鋼海水腐蝕微生物群落中海洋玫瑰桿菌族細菌的16S rRNA基因，本發明提供了特異性FQ-PCR引物對Rose_F 5' -CCGAACAACGCTAACCCC—3，(SEQ ID NO 1)Rose_R 5' -GGCCTACCAAGTCTACGATC-3，(SEQ ID NO 2)該FQ-PCR引物對保證了本發明的檢測方法是特異性地針對海洋玫瑰桿菌族細菌 (而不是其他不相干細菌)，從而實現了該發明檢測方法的檢測有效性和特異性。在此基礎上，本發明優化了 FQ-PCR檢測條件，從而實現了該發明檢測方法的準確性和可重複性。優化後的FQ-PCR實驗條件具體如下應用寶生物公司(Takara，Japan)的 SYBR Premix Ex Taq II (Perfect Real Time)螢光定量試劑盒(Takara code :DRR081A ；除以下特別說明，試劑盒按照廠商提供的說明書使用)，對其反應條件優化為95°C變性50秒，之後進行40個PCR循環，每循環條件為(95°C變性5秒；56°C退火30秒；72°C延伸45秒)，螢光讀值設定為72°C。為了獲得解鏈曲線(Melting curves)以檢驗FQ-PCR檢測反應的特異性和工作質量，本發明在60°C到95°C之間，溫度每升高1°C進行一次螢光讀值。該FQ-PCR檢測反應在一臺 ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems，USA)焚光定量PCR儀進行，在其它類似的不同商業品牌的螢光定量PCR儀上，該反應條件可得到相似結果。因此，只要有了該FQ-PCR引物對(R0Se_F*R0Se_R)，該碳鋼腐蝕微生物定量檢測技術的應用就可以得以實現，檢測結果的準確性和檢測效率將不受影響。因此，該發明檢測技術不但優於以往技術，並且便於推廣應用。實施例1.對實驗室人工構建的模擬菌株目標基因的檢測為驗證應用該FQ-PCR引物對(Rose_F和Rose_R)對海洋玫瑰桿菌族細菌的定量檢測可行性及準確率，本發明利用在以前研究中構建的海洋細菌16S rRNA基因文庫(Dang et al.，2008)，從中選取了攜帶海洋玫瑰桿菌族細菌16S rRNA基因的克隆，應用Qiagen 公司(Qiagen, USA)的質粒提取試劑盒(Mini Plasmid Kit, Qiagen Catalog no. 12125， 試劑盒按照廠商提供的說明書使用)進行了海洋玫瑰桿菌族細菌16S rRNA基因質粒的提取，並應用定量焚光儀(Modulus Single Tube Multimode Reader fluorometer, Turner Biosystems, USA)和 PicoGreen 核酸螢光染料(Molecular Probes, USA)進行了質粒濃度定量測定並建立了質粒濃度梯度系列溶液。依照上述具體實施方式
，應用引物對(Rose_F和Rose_R)，本發明對不同濃度的質粒溶液進行了海洋玫瑰桿菌族細菌16S rRNA基因的FQ-PCR定量檢測(3 5個重複)，同時使用不含海洋玫瑰桿菌族細菌16S rRNA基因的質粒溶液作為負對照(陰性對照)，實驗結果顯示，該FQ-PCR定量檢測方法對所有的目標樣品皆檢測到海洋玫瑰桿菌族細菌16S rRNA基因，對不含海洋玫瑰桿菌族細菌16S rRNA基因的負對照(陰性對照)樣品檢測結果皆為0，表明該檢測技術具有非常高的特異性和準確度，應用該技術的定量檢測結果表明， 該方法同時還具有非常高的檢查效率和檢測靈敏度(表1)。表1.海洋玫瑰桿菌族細菌16S rRNA基因FQ-PCR定量檢測的檢測效率和檢測靈敏度
權利要求
1.一種海洋玫瑰桿菌族(Roseobacter clade)細菌定量檢測方法，其特徵在於包括以下步驟針對海洋玫瑰桿菌族細菌16S rRNA基因，設計特異性引物，提取樣品中微生物基因組DNA，利用實時螢光定量PCR技術定量檢測樣品中海洋玫瑰桿菌族(Roseobacter clade)細菌；所述的特異性引物如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的實時螢光定量PCR條件為95°C變性 50秒，之後進行40個PCR循環；每一循環為95°C變性5秒，56 V退火30秒，72°C延伸45秒； 螢光讀值設定為72°C。
3.如權利要求1或2任一所述的方法用於定量檢測浸海碳鋼表面海洋玫瑰桿菌族 (Roseobacter clade)細菌的用途。
全文摘要
本發明涉及生物檢測領域，具體涉及一種海洋玫瑰桿菌族(Roseobacter clade)細菌定量檢測方法，該方法包括以下步驟針對海洋玫瑰桿菌族細菌16S rRNA基因，設計特異性引物，提取樣品中微生物基因組DNA，利用實時螢光定量PCR技術定量檢測樣品中海洋玫瑰桿菌族(Roseobacter clade)細菌。
文檔編號C12Q1/68GK102242203SQ20111017176
公開日2011年11月16日 申請日期2011年6月24日 優先權日2011年6月10日
發明者黨宏月, 王琳, 陳瑞鵬 申請人:中國石油大學(華東)