健兒清解液指紋圖譜控制方法
2023-09-16 12:47:00
專利名稱：：健兒清解液指紋圖譜控制方法
技術領域：
：本發明涉及一種中藥複方製劑健兒清解液的指紋圖譜控制方法，具體地說是涉及一種指紋圖譜技術來控制健兒清解液藥品的質量。
背景技術：
：該發明中所涉及的健兒清解液藥物為國家標準品種，健兒清解液是目前臨床中可同時治療小兒呼吸系統疾病和消化系統疾病的藥品之一，其市場份額已佔目前兒童用藥的5%以上。健兒清解液目前國內有17家企業擁有國家食品藥品監督管理局頒發的生產批文，在市場銷售的產品有7家左右。由於歷史的原因，這些產品普遍存在著作用物質不清楚，質量不可控，從而影響了該產品療效的發揮，甚至存在著用藥安全性隱患。國際上常採用指紋圖譜對植物藥進行質量控制，效果顯著，如韓國、日本、德國等。他們比較重視對植物藥的開發和利用，外國(德國)用指紋圖譜技術控制質量的銀杏製劑，在國際上具有很強的競爭力。加入世貿組織之後，生產植物藥的大國也都將進入我國進行競爭，我國的中藥企業面臨著嚴峻的挑戰。而針對健兒清解液藥品建立指紋圖譜來控制其質量還未見相關文獻。
發明內容本發明的目的在於提供一種健兒清解液指紋圖譜控制方法，從而實現通過針對健兒清解液藥品建立指紋圖譜來控制其質量的目的。該方法操作方便、精度高，產品質量穩定可靠。為了實現上述發明目的，本發明的技術方案如下本發明提供的一種健兒清解液指紋圖譜控制方法，包括將健兒清解液成品配製的供試液，在一定的色譜條件下測試供試液指紋圖譜，供試液指紋圖譜與對照指紋圖譜經計算機輔助相似度評價軟體計算指紋圖譜的相似度，獲得相似度數值，依據指紋圖譜相似度應大於0.90作為質控標準來控制健兒清解液的質量。上述的健兒清解液指紋圖譜建立方法，包括如下步驟1)健兒清解液供試品溶液的製備先將金銀花、菊花、苦杏仁、連翹分別蒸餾提取芳香水；將山楂用乙醇加熱提取後按順序進行過濾留濾液、濃縮成浸膏得山楂中間體、加水溶解製成山楂藥液；陳皮用乙醇進行滲漉，將滲漉液濃縮成浸膏得陳皮中間體，加水溶解製成陳皮藥液；再合併上述藥液及芳香水，加入適量枸櫞酸、單糖漿及苯甲酸，加水定容，攪勻，過濾即得健兒清解液。取健兒清解液過C18固相小柱，用水洗滌，棄去水洗滌液，再用甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液備用；2)測試吸取健兒清解液供試品溶液注入液相色譜儀，依照高效液相色譜法測定，制定健兒清解液指紋圖譜，其中，高效液相色譜條件為色譜柱用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；採用梯度洗脫，流動相A為O.1X的甲酸水溶液，流動相B為乙腈；梯度洗脫程序如下0分鐘時，97%流動相A、3V流動相B;13分鐘時，95%流動相A、5X流動相B;27分鐘時，85%流動相A、15X流動相B;35分鐘時，80%流動相A、20V流動相B;45分鐘時，80%流動相A、20V流動相B;60分鐘時，72%流動相A、28V流動相B;65分鐘時，40%流動相A、60V流動相B;67分鐘時，0%流動相A、100X流動相B;75分鐘時，0%流動相A、100X流動相B;90分鐘時，97%流動相A、3X流動相B;流速1.OmLmin—1;檢測波長280nm;柱溫25°C;流動相A與流動相B是按體積比添加。上述步驟(1)中健兒清解液供試品溶液的製備1)將金銀花、菊花、苦杏仁、連翹分別蒸餾提取芳香水；2)將山楂用80%乙醇加熱提取2次，每次2小時，過濾，合併濾液，濾液回收乙醇，濃縮成浸膏得山楂中間體，加水溶解製成山楂藥液；3)將陳皮用60%乙醇進行滲漉，收集滲漉液並濃縮成浸膏，再加適量水溶解；4)合併上述各步所得的藥液及芳香水，在加入枸櫞酸0.020.08g、單糖漿200400ml及苯甲酸，加水定容至1000ml，攪勻，過濾即得健兒清解液成品；5)取健兒清解液成品0.52ml，通過C18固相小柱，用水0.52ml洗滌，棄去水洗滌液，再用甲醇0.52ml洗脫，收集洗脫液備用。步驟(2)中色譜條件為進樣量1020iil，流速1.OmL*min—1;檢測波長280nm;柱溫25t:。上述步驟(2)中流動相A溶液的配製比例是按體積百分比配製，流動相B溶劑為色譜純，C18固相小柱的填料規格500mg，臨用前用甲醇3ml活化，再用水3ml洗滌。本發明所述的健兒清解液所用藥材山楂和/或陳皮中間體指紋圖譜建立方法，包括如下步驟1)山楂中間體供試品溶液的製備取山楂中間體0.52mL，用甲醇稀釋至10ml，再取lml甲醇稀釋液，接著用水稀釋至10ml，通過C18固相小柱，用0.52mL水洗滌，棄去水洗滌液，再用0.52mL甲醇洗脫，收集洗脫液；和/或陳皮中間體供試品溶液的製備取陳皮中間體0.52mL，用水稀釋至10ml，再通過C18固相小柱，接著用0.52mL水洗滌，棄去水洗滌液，然後用0.52mL甲醇洗脫，收集洗脫液，最後精密取甲醇洗脫液500iil，用甲醇稀釋至lml;2)測試精密吸取山楂和/或陳皮中間體供試品溶液注入液相色譜儀，依照高效液相色譜法及上述的色譜條件測定，制定山楂和/或陳皮中間體指紋圖譜。本發明所述的健兒清解液所用山楂和/或陳皮藥材指紋圖譜建立方法，包括如下步驟1)山楂藥材供試品溶液的製備先用80%乙醇加熱提取2次，每次兩小時，過濾後合併濾液，接著濃縮成浸膏，再加適量的水溶解，然後取上述溶解液0.52mL，通過C18固相小柱，用水0.52mL洗滌，棄去水洗滌液，再用甲醇0.52mL洗脫，收集洗脫液備用；和/或陳皮藥材供試品溶液的製備陳皮用60%乙醇進行滲漉，收集滲漉液並濃縮成浸膏，再加適量水溶解，然後取上述溶液0.52mL，通過C18固相小柱，用水0.52mL洗滌，棄去水洗滌液，再用甲醇0.52mL洗脫，收集洗脫液備用；2)測試精密吸取山楂和/或陳皮藥材供試品溶液分別注入液相色譜儀，依照高效液相色譜法及上述的色譜條件測定，制定山楂和/或陳皮藥材指紋圖譜。本發明所述的健兒清解液對照指紋圖譜的獲取方法按權利要求2步驟(1)所述方法製備10批次健兒清解液樣品供試品溶液，按上述的色譜條件分析，獲取10批次健兒清解液HPLC指紋圖譜，以該10批次的數據為基礎，運用計算機輔助軟體導出對照指紋圖譜。上述的健兒清解液對照指紋圖譜的獲取方法中參數設置為時間窗寬度0.10秒；校正方式採用多點校正；校正色譜峰的確定4個較高的色譜峰峰1:12.7min、峰2:15.9min、峰3:28.2min、峰4:46.8min。本發明所述的健兒清解液所用藥材山楂和/或陳皮中間體對照指紋圖譜的獲取方法按權利上述方法製備多批次山楂和/或陳皮中間體供試品溶液，按上述的色譜條件分析，獲取多批次山楂和/或陳皮中間體HPLC指紋圖譜，以這些數據為基礎，運用計算機輔助軟體導出對照指紋圖譜。上述的山楂中間體對照指紋圖譜的獲取方法中參數設置為時間窗寬度0.10秒；校正方式採用多點校正；校正色譜峰的確定6個較高的色譜峰，峰1:18min、峰2:22.8min、峰3:28.3min、峰4:40.3min、峰5:40.8min、峰6:58.2min;和/或陳皮中間體對照指紋圖譜的獲取方法中參數設置為時間窗寬度0.10秒；校正方式採用多點校正；校正色譜峰的確定2個較高的色譜峰，峰1:43.5min、峰2:48.lmin。本發明所述的健兒清解液所用藥材山楂和/或陳皮中間體指紋圖譜控制方法，包括將山楂和/或陳皮中間體製備的供試液，在上述的色譜條件下測試供試液指紋圖譜，供試液指紋圖譜與對照指紋圖譜經計算機輔助相似度評價軟體計算指紋圖譜的相似度，獲得相似度數值，依據指紋圖譜相似度應大於0.90作為質控標準來控制山楂和/或陳皮中間體的質量。本發明所述的健兒清解液所用山楂和/或陳皮藥材對照指紋圖譜的獲取方法為按上述方法製備多批次山楂和/或陳皮藥材供試品溶液，按上述的色譜條件分析，獲取多批次山楂和/或陳皮藥材HPLC指紋圖譜，以這些數據為基礎，運用計算機輔助軟體導出對照指紋圖譜。上述的山楂藥材對照指紋圖譜的獲取方法中參數設置為時間窗寬度0.10秒；校正方式採用多點校正；校正色譜峰的確定6個較高的色譜峰，峰1:18min、峰2:22.8min、峰3:28.3min、峰4:40.3min、峰5:40.8min、和峰6:58.2min;和/或陳皮藥材對照指紋圖譜的獲取方法中參數設置為時間窗寬度0.10秒；校正方式採用多點校正；校正色譜峰的確定2個較高的色譜峰，峰1:43.5min、峰2:48.lmin。本發明所述的健兒清解液所用山楂和/或陳皮藥材指紋圖譜控制方法，包括將山楂和/或陳皮藥材用溶劑提取製備樣品的供試液，在上述的色譜條件下測試供試液指紋圖譜，供試液指紋圖譜與對照指紋圖譜經計算機輔助相似度評價軟體計算指紋圖譜的相似度，獲得相似度數值，依據指紋圖譜相似度應大於0.90作為質控標準來控制山楂和/或陳皮藥材的質量。本發明與現有技術相比具備以下有優點本發明針對健兒清解液的特性，建立起健兒清解液的指紋圖譜體系，並以計算機輔助將產品指紋圖譜與對照指紋圖譜經進行指紋圖譜的相似度評價，從而來控制健兒清解液產品的質量，使得產品質量穩定可靠，藥性和療效基本一致，安全性高，同時該方法操作方便、精度高、提高了生產效率。圖1是空白試驗的指紋圖譜；圖2是苯甲酸的指紋圖譜；圖3是健兒清解液120min的指紋圖譜；圖4A是10批健兒清解液(10ml規格)的指紋圖譜疊加圖；圖4B是10批健兒清解液(10ml規格)的對照指紋圖譜；圖5A是IO批健兒清解液(100ml規格)的指紋圖譜疊加圖；圖5B是IO批健兒清解液(100ml規格)的對照指紋圖譜；圖6A是7批山楂中間體的指紋圖譜疊加圖；圖6B是7批山楂中間體的對照指紋圖譜；圖7A是6批陳皮中間體的指紋圖譜疊加圖；圖7B是6批陳皮中間體的對照指紋圖譜；圖8A是7批山楂的指紋圖譜疊加圖；圖8B是7批山楂的對照指紋圖譜；圖9A是6批陳皮的指紋圖譜疊加圖；圖9B是6批陳皮的對照指紋圖譜。具體實施例方式為了使本發明要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。健兒清解液指紋圖譜分析方法建立及質量性評價具體情況如下本品的HPLC及LC/MS分析表明，藥材、中間體和成品的色譜圖有較多的信息及一定的相關性，採用國家藥典會編寫的"中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版"進行分析，生成了對照指紋圖譜。經過多批次長期觀察，發現成品批間的指紋圖譜相似度差異較小。本品亦進行了GC及GC/MS分析，結果表明其相關性較差。故本項未列入質量標準中。1.1儀器與試劑Agilent1100LC系統(含在線真空脫氣機，低壓四元梯度泵或雙高壓泵，自動進樣器，柱溫箱，可變波長檢測器(VWD)或光二極體陣列檢測器(DAD)，色譜工作站；乙腈、甲醇為色譜純，其餘試劑均為分析純，水為去離子水；健兒清解液(國藥控股深圳中藥有限公司，批號(10ml):060105、060104、060111、060201、060203、060307、060317、060309、060315、060314;批號(100ml):060303、050304、050401、050601、050504、050701、050101、040701、040602、040404)、山楂與陳皮中間體(國藥控股深圳中藥有限公司)、山楂與陳皮藥材(國藥控股深圳中藥有限公司)。81.2色譜條件的確定色譜柱用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑(ZorbaxSBC18，4.6mmX250mm，5ym)，流速1.OmL*min—、進樣流量是1020y1，檢測波長280nm，柱溫25°C，採用梯度洗脫，流動相A為0.1%的甲酸水溶液，流動相B為含乙腈溶劑。梯度洗脫程序如下表1:表1流動相A與流動相B完整的梯度表tableseeoriginaldocumentpage91.3試品溶液的製備1.3.1健兒清解液供試品溶液的製備金銀花、菊花、連翹、苦杏仁分別蒸餾提取芳香水；山楂用80%乙醇加熱提取2次，每次2小時，過濾，合併濾液，濾液回收乙醇，濃縮成浸膏得山楂中間體，加水溶解製成山楂藥液；陳皮用60%乙醇進行滲漉，收集滲漉液，回收乙醇，濃縮成浸膏得陳皮中間體，加水溶解製成陳皮藥液；再合併上述藥液及芳香水，加入適量枸櫞酸、單糖漿及苯甲酸，加水使至1000ml，攪勻，過濾即得健兒清解液取健兒清解液過C18固相小柱，用水洗滌，棄去水洗滌液，再用甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液備用。1.3.2山楂與陳皮中間體供試品溶液的製備山楂中間體供試品溶液的製備取山楂中間體lml，用甲醇稀釋至10ml，再取lml甲醇稀釋液，接著用水稀釋至10ml，通過C18固相小柱，用lml水洗滌，棄去水洗滌液，再用lml甲醇洗脫，收集洗脫液。陳皮中間體供試品溶液的製備取陳皮中間體lml，用水稀釋至10ml，再通過C18固相小柱，接著用lml水洗滌，棄去水洗滌液，然後用lml甲醇洗脫，收集洗脫液，最後精密取甲醇洗脫液500iil，用甲醇稀釋至lml。1.3.3山楂與陳皮藥材供試品溶液的製備山楂藥材供試品溶液的製備先用80%乙醇加熱提取2次，每次兩小時，過濾後合併濾液，接著濃縮成浸膏，再加適量的水溶解，然後取上述溶解液lml，通過C18固相小柱，用水1ml洗滌，棄去水洗滌液，再用甲醇1ml洗脫，收集洗脫液備用；陳皮藥材供試品溶液的製備陳皮用60%乙醇進行滲漉，收集滲漉液，回收乙醇，濃縮成浸膏得陳皮中間體，加水溶解製成陳皮藥液，然後取上述溶液lml，通過C18固相小柱，用水1ml洗滌，棄去水洗滌液，再用甲醇1ml洗脫，收集洗脫液備用；1.4指紋圖建立方法分析1.4.1健兒清解液成品的指紋圖建立方法分析1.4.1.l空白試驗取純化水lml，通過C18固相小柱(填料規格500mg)，臨用前用甲醇3ml活化，再用水3ml洗滌)，用水lml洗滌，棄去水洗滌液，再用甲醇lml洗脫，收集洗脫液，即得空白溶液。精密吸取20ia，注入液相色譜儀，照色譜條件測定，結果見圖l，結果表明空白不幹擾稱取苯甲酸1.5g，溶入1000ml水中，按上述方法製得苯甲酸供試品溶液。精密吸取20iU，注入液相色譜儀，照色譜條件測定，結果見圖2。1.4.1.2儀器精密度精密吸取本品的同一供試品溶液(060303)，連續進樣5次(進樣量20y1)，測定主要色譜峰面積，結果見表2。表2儀器精密度試驗結果峰號tR(min)峰面積保留時間RSD%峰面積RSD%111.969.26768.88668.37767.96667.6490.090.96212.6445.875442.914441.745442.216443.76900.37315.92093.4992096.8722098.1822092.4912082.64200.29428.1200.814198.786216.560216.213215.17304.25529.090.97990.93490.38790.29889.2620.020.77632.4182.799181.353179扁180.561203.09205.40740.057.24855,14056.14954.70553.9650.042.31843.110893.5610828.7910851.6110888.1810935.3300.38946.71961.9381945,5871951.1761932.2401899.58701.241047.9187.373176.686182.425174.940178.6850.052.761.4.1.3重複性取同一批供試品(0600303)1.Oml，平行5份，按正文指紋圖譜項下的方法測定，測定主要色譜峰面積，結果見表3。表3重複性結果峰號tw(min)峰面積保留時間RSD%峰面積RSI)0/0111.969.26766.37568.32665.98667.4820.082.0112.7445.658448.374438,628435.534443.4290.02U8315.92186.5242093.3422090.1842103.2642128.07501.88428.1200.634199.786213.265210.372208,46202.9129.092.50690.95191.45990.29888.5280.021.63632.4183.942181.343178.629189.321185.08602.19740.057.34855.24555.14654.67853.8650.042.33843.110913.2410834.7910836.4810942.0810935.880.030.49946.71968.3821956.7681947.3491953.2461898.36701.391047.9189.623186.566182.325179.215180.6480.052.351.4.1.4穩定性取同一1共試品溶液(060303)，分別放置0、2、4、6、8、12小時，分別進樣，;則定指紋圖譜』犯定主要色譜峰面積，見表4。試驗表明，在12小時內，供試品溶液穩定。表4穩定性考查結果保留峰面峰號t;j(min)峰面積、時間RSD%積%111.970.48769.81770.60970.53570.32869.3760.030.70212.8450.13450.171450.887451.881453.064446.85200.47315.92039.8612035.1632031,0492029.4902025.5372023.49000.30428.1196.869194.334197.662197.238196.234193.19400.9029.191.08586.21390.37891.38891.61490.0380.012.23632.4181.885190.59184.16186.636188.505187.09501.66740.160細55.77056.57253.80957.96455.8010.023.76843.211055.7611085.2511119.4711177.7011223.6511114.7900.55946.71848.8241826.6981812.9741790.9221767.3091740.20502.22保留峰面峰號t/f(min)峰面積時間RSD%積RSD%1048.0174.826180.771184.552182.449173.747179.1950.072.371.4.1.5記錄時間的確定11按正文色譜條件，記錄65分鐘後，保持流動相比例不變繼續記錄55分鐘(即記錄120分鐘指紋圖譜)，見圖3。結果表明，保留時間65120分鐘內未檢出色譜峰，故確定分析時間為65分鐘。1.4.1.6健兒清解液對照指紋圖譜的建立1.4.1.6.1計算軟體採用國家藥典會編寫的"中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版"。1.4.1.6.2參數設置:參照譜圖本品採用對照指紋圖譜(共有模式)為參照譜圖。時間窗寬度O.IO秒數據剪切主峰系製劑中的添加劑苯甲酸，對相似度計算供獻較大，故不進行積分。校正方式相似度計算時採用多點校正方式。校正色譜峰的確定4個較高的色譜峰峰1(12.7min)峰2(15.9min)峰3(28.2min)峰4(46.8min)。根據試驗結果，並參照《中藥注射劑色譜指紋圖譜實驗研究技術指南》的規定，且本發明為口服製劑，規定本品的指紋圖譜應與相同規格的健兒清解液對照指紋圖譜相似，相似度不應低於0.90。1.4.2山楂中間體指紋圖建立方法分析為了考察與成品的相關性，採用與健兒清解液相同的儀器，色譜條件、檢測方法和供試品溶液製備。系統適應性試驗見各該中間體指紋圖譜標準草案。1.4.2.l儀器精密度精密吸取本品的同一供試品溶液(060303)，連續進樣5次(進樣量20y1)，測定主要色譜峰面積，結果見表5。表5儀器精密度試驗結果峰號tw(min)峰面積保留時間RSD%峰面積RSD%112.050,86049.32047.12848.80847.83202.94215.340.83741.42740.62342.96942.36302.41317.753.33555.44951,88852.46854.15202.6312tableseeoriginaldocumentpage131.4.2.3穩定性取同一供試品溶液(060303)，分別放置0、2、4、6、8、12小時，分別進樣，測定指紋圖譜，測定主要色譜峰面積，見表7。試驗表明，在12小時內，供試品溶液穩定。表7穩定性試驗結果tableseeoriginaldocumentpage141.4.2.4山楂中間體對照指紋圖譜的建立1.4.2.4.1計算軟體採用國家藥典會編寫的"中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版"。1.4.2.4.2參數設置:參照譜圖本品採用對照指紋圖譜(共有模式)為參照譜圖。時間窗寬度O.10秒數據剪切空白試驗無幹擾，故不需剪切。校正方式相似度計算時採用多點校正方式。校正色譜峰的確定6個強度較高的色譜峰(^分別約為18min、22.8min、28.3min、40.3min、40.8min、和58.2min)。根據試驗結果，規定本品的指紋圖譜應與山楂中間體對照指紋圖譜相似，相似度不應低於0.90。1.4.3陳皮中間體指紋圖建立方法分析1.4.3.l儀器精密度精密吸取本品的同一供試品溶液(060301)，連續進樣5次(進樣量20iU)，測定主要色譜峰面積，結果見表8。表8儀器精密度試驗結果峰號t/(min)峰面積保留時間RSD%峰面積RSD%132.41186.9451190.6651196.1701190.8301189.40700.28243.39815.8789814.9219799.3769778.8039828.05800.19348.09356.4709361.6209371.4919372,7739381.9020.010.11452.3699.476702.562699.682703.220692.86100.5963.4588.421572.248574.210567.010583.75501.521.4.3.2重複性取同一批供試品(060301)1.0ml，平行5份，按指紋圖譜的方法測定，領;u定主要色譜峰面積，結果見表9。表9重複性結果峰號tw(min)峰面積保留時間RSD%峰面積RSD%132.41186.9451190.6651190.8301189.4071194.05100.22243.39815.8789814.9219778.8039828.0589805.7310.030.19348.09356.4709361.6209372.7739381.9029394.7510.050.16452.3699.476702.562703.220682.861703.07501.25563.4576.850564.047576.543556.669589.65502.231.4.3.3穩定性取同一供試品溶液(060301)，分別放置0、2、4、6、8、12小時，分別進樣，測定指紋圖譜，測定主要色譜峰面積，見表10。試驗表明，在12小時內，供試品溶液穩定。表10穩定性考查結果132.41219.2441236.9551233.0801230.69]1230.9681263.71501.2143.39905.1629跳8949977.2839944.1599884.7899724.6000.070.8848.09662.6499670.6869668.3779661.0699678.9999674.1810.090.07452.3696.27712.959720.64727.003685.972731.42302.51563.4謹.716805.304803.413795.520815細828,53902.901.4.3.4陳皮中間體對照指紋圖譜的建立1.4.3.4.1計算軟體採用國家藥典會編寫的"中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版"。1.4.3.4.2參數設置:15峰號tw(min)峰面積峰面積RSD%%留間D保時s參照譜圖本品採用對照指紋圖譜(共有模式)為參照譜圖。時間窗寬度O.10秒數據剪切空白試驗無幹擾，故不需剪切。校正方式相似度計算時採用多點校正方式。校正色譜峰的確定2個強度較高的色譜峰(tK分別約為43.5min、48.lmin)。根據試驗結果，規定本品的指紋圖譜應與陳皮中間體對照指紋圖譜相似，相似度不應低於0.90。1.4.4山楂藥材指紋圖建立方法分析1.4.4.l儀器精密度精密吸取本品的同一供試品溶液(060303)，連續進樣5次(進樣量20y1)，測定主要色譜峰面積，結果見表11。表11儀器精密度試驗結果峰號t*(min)峰面積保留時間RSD%峰面積RSD%112.049.86249.32448.56348.80847.8420.031.57215.342.48641.35840.88642.63840.96202.01317.754,32155.32852.67952.84556.24302.85428.2986.375952.662930.182967.038952.6420.042.16528.799.864104.897103.248103.446106.5790.052.40630.9561.298548.216531.958538.524546.3680.062.03了32.5758.894761.526757.648730.056764.5860.051.85840.1155.679151.482156.346153.038147.8620.042.24940.7137.056138.163132.685130.546131.1280.032.601043,562.42664.03763.95462.02360.9860.022.081158.1125,876125.358122.648121.038120.0202.101.4.4.2重複性取同一批供試品(060303)1.0ml，平行6份，按指紋圖譜的方法測定，測定主要色譜峰面積，結果見表12。表12重複性結果16tableseeoriginaldocumentpage171.4.4.4.2參數設置:參照譜圖本品採用對照指紋圖譜(共有模式)為參照譜圖；時間窗寬度O.IO秒；校正色譜峰的確定6個強度較高的色譜峰(^分別約為18min、22.8min、28.3min、40.3min、40.8min、和58.2min);根據試驗結果，考慮到藥材來源的穩定性，規定本品的指紋圖譜應與山楂對照指紋圖譜相似，相似度不應低於0.90。1.4.5陳皮藥材指紋圖建立方法分析1.4.5.l儀器精密度精密吸取本品的同一供試品溶液(060301)，連續進樣5次(進樣量20iU)，測定主要色譜峰面積，結果見表14。表14儀器精密度試驗結果峰號.tfl(min)峰面積保留時間RSD%峰面積RSD%132.41060.5381089.5651095.2381091.8361089.5020.021.30243.38915,7868924.8688965.3648948.8038922,04700.2348.09556.4639361.6209247.5629372.7739185.9560.071.52452,3686.764702.562703.665703,282692.8850.031.09563.4586.436567.258569.896573.026583.7550.121.481.4.5.2重複性取同一批供試品(060301)1.Oml，平行5份，按指紋圖譜的方法測定，測定主要色譜峰面積，結果見表15。表15重複性結果峰號t;j(min)峰面積保留時間RSD%峰面積RSD%132.41086.8971091.5621092,3561089.6621124.0550.041.40243.38855.6358903.8628978.9898628.0588705.7310.141.64348.09489.3549361.6209675.7859881.2049402.8630.082.25452.3701.567702.562708.223683.648710.0250.061.49563.4583.684561.264573.356557.669589.6860.122.411.4.5.3穩定性取同一供試品溶液(060301)，分別放置0、2、4、6、8、12小時，分別進樣，測定指紋圖譜，測定主要色譜峰面積，見表16。試驗表明，在12小時內，供試品溶液穩定。表16穩定性考查結果tfl(min)峰面積保留時間RSD%峰面積RSD%132.41088.3641068.9561053.0621048.6851026.0381063.7150.021.99243.38957,3568跳5268757.2498689.8568484.5988924扁02.0548.09762.6499670.6869568.3779451.0699278.9999674.1800.041.85452.3724.277720.959709.640701.003685.972732.35602.39563.4851.716835.304813.413805.520800.068831.6340.072.411.4.5.4對照指紋圖譜的建立1.4.5.4.1計算軟體採用國家藥典會編寫的"中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版"。1.4.5.4.2參數設置參照譜圖本品採用對照指紋圖譜(共有模式)為參照譜圖。時間窗寬度O.10秒數據剪切空白試驗無幹擾，故不需剪切。校正方式相似度計算時採用多點校正方式。校正色譜峰的確定2個強度較高的色譜峰(tK分別約為43.5min、48.lmin)。根據以上試驗結果，考慮到藥材來源的穩定性，規定本品的指紋圖譜應與陳皮對照指紋圖譜相似，相似度不應低於O.90。下面結合具體實施方式對本發明進行進一步說明。實施例1健兒清解液對照指紋圖譜的獲取及質量穩定性評價指紋圖譜相似度計算結果各取IO批(10ml規格)和10批(100ml規格)的健兒清解液，按下述(1)項下供試品溶液製備方法製成健兒清解液供試品溶液，按(2)項下色譜條件分析(1)供試品溶液的製備方法取成品lml，通過C18固相小柱(填料規格為500mg，臨用前用甲醇3ml活化，再用水3ml洗滌)，用水lml洗滌，棄去水洗滌液，再用甲醇lml洗脫，收集洗脫液，即得。(2)色譜條件高效液相色譜條件為色譜柱用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑(ZorbaxSBC18，4.6mmX250mm，5iim);採用梯度洗脫，流速1.OmL.min—、進樣量20ii1，檢測波長280nm，柱溫25°C。流動相A為0.1%的甲酸水溶液，流動相B為含乙腈，梯度洗脫程序如表1。10批(10ml規格)健兒清解液指紋圖譜疊加圖4A和對照指紋圖譜如圖4B，相似度計算結別見表17;10批(100ml規格)健兒清解液指紋圖譜疊加圖5A和對照指紋圖譜如圖5B，相似度計算結別見表18。表1710批健兒清解液(10ml規格)的相似度tableseeoriginaldocumentpage20相似度平均值分別為0.965(10批，規格100ml/支)表17和表18結果表明，10批(10ml)和10批(100ml)健兒清解液的相似度值均大於0.95，結果表明，國藥控股深圳中藥有限公司生產的健兒清解液藥品各批次和各規格間質量均一，穩定。實施例2山楂中間體對照指紋圖譜的獲取及質量穩定性評價指紋圖譜相似度計算結果取7批山楂中間體，按下述(1)項下供試品溶液製備方法製成山楂中間體供試品溶液，按(2)項下色譜條件分析(1)供試品溶液的製備方法取山楂中間體lml，用甲醇稀釋至10ml，取lml，用水稀釋至10ml，通過C18固相小柱(填料規格為500mg，臨用前用甲醇3ml活化，再用水3ml洗滌)，用水1ml洗滌，棄去水洗滌液，再用甲醇1ml洗脫，收集洗脫液。(2)色譜條件高效液相色譜條件為色譜柱用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑(ZorbaxSBC18，4.6mmX250mrn，5iim);採用梯度洗脫，流速1.OmL.min—、進樣量20ii1，檢20測波長280nm，柱溫25°C，理論板數按主峰計應不低於80000。流動相A為0.1%的甲酸水溶液，流動相B為含乙腈，梯度洗脫程序如表1。7批山楂中間體指紋圖譜疊加圖6A和對照指紋圖譜如圖6B，相似度計算結別見表19;表197批山楂中間體的相似度tableseeoriginaldocumentpage21表19結果表明，相似度平均值0.994(7批)，7批山楂中間體的相似度值均大於0.90。結果表明，國藥控股深圳中藥有限公司生產的健兒清解液藥品的藥材山楂中間體各批次間質量均一，穩定。根據以上試驗結果，暫定本品的指紋圖譜應與山楂中間體對照指紋圖譜相似，相似度不應低於0.90。實施例3陳皮中間體對照指紋圖譜的獲取及質量穩定性評價指紋圖譜相似度計算結果取6批陳皮中間體，按下述(1)項下供試品溶液製備方法製成陳皮中間體供試品溶液，按(2)項下色譜條件分析(1)供試品溶液的製備方法取陳皮中間體lml，用水稀釋至10ml，通過C18固相小柱(填料規格為500mg，臨用前用甲醇3ml活化，再用水3ml洗滌)，用水1ml洗滌，棄去水洗滌液，再用甲醇1ml洗脫，收集洗脫液，精密取出500iU，用甲醇稀釋至1ml，即得。(2)色譜條件高效液相色譜條件為色譜柱用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑(ZorbaxSBC18，4.6mmX250mrn，5iim);採用梯度洗脫，流速1.OmL.min—、進樣量20ii1，檢測波長280nm，柱溫25°C，理論板數按主峰計應不低於60000。流動相A為0.1%的甲酸水溶液，流動相B為含乙腈，梯度洗脫程序如表1。6批陳皮中間體指紋圖譜疊加圖7A和對照指紋圖譜如圖7B，相似度計算結別見表20;表206批陳皮中間體的相似度編號批號相似度值10603010.99520607010.9920606010.99740605010.9920605030.99360606020,945表20表明，相似度平均值0.986，6批陳皮中間體的相似度值均大於0.90。結果表明，國藥控股深圳中藥有限公司生產的健兒清解液藥品的藥材陳皮中間體各批次間質量均一，穩定。根據以上試驗結果，暫定本品的指紋圖譜應與陳皮中間體對照指紋圖譜相似，相似度不應低於O.90。實施例4山楂藥材對照指紋圖譜的獲取及質量穩定性評價指紋圖譜相似度計算結果取7批山楂提取液，按下述(1)項下供試品溶液製備方法製成山楂中間體供試品溶液，按(2)項下色譜條件分析(1)供試品溶液的製備方法將山楂用80%乙醇加熱提取2次，每次兩小時，濾過，合併濾液，回收乙醇，濃縮成浸膏，加適量的水溶解。取上述溶液lml，通過C18固相小柱(填料規格為500mg，臨用前用甲醇3ml活化，再用水3ml洗滌)，用水1ml洗滌，棄去水洗滌液，再用甲醇1ml洗脫，收集洗脫液，即得。(2)色譜條件高效液相色譜條件為色譜柱用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑(ZorbaxSBC18，4.6mmX250mrn，5iim);採用梯度洗脫，流速1.OmL.min—、進樣量20ii1，檢測波長280nm，柱溫25°C，理論板數按主峰計應不低於80000。流動相A為0.1%的甲酸水溶液，流動相B為含乙腈，梯度洗脫程序如表1。7批山楂指紋圖譜疊加圖8A和對照指紋圖譜如圖8B，相似度計算結別見表21;表217批山楂藥材的相似度編號批號相似度值10602010.95520603010.92130606010.96840606020.9690601010.98260512010.97670607020.985表21表明，相似度平均值0.965，7批山楂的相似度值均大於0.90。結果表明，國藥控股深圳中藥有限公司生產的健兒清解液藥品的藥材山楂提取液體各批次間質量均一，穩定。根據以上試驗結果，考慮到藥材來源的穩定性，暫定本品的指紋圖譜應與山楂對照指紋圖譜相似，相似度不應低於0.90。實施例522陳皮對照指紋圖譜的獲取及質量穩定性評價指紋圖譜相似度計算結果取6批陳皮提取液，按下述(1)項下供試品溶液製備方法製成陳皮中間體供試品溶液，按(2)項下色譜條件分析(1)供試品溶液的製備方法陳皮用60%乙醇進行滲漉，收集滲漉液，回收乙醇，濃縮成浸膏，加適量水溶解；取上述溶液1ml，通過C18固相小柱(填料規格為500mg，臨用前用甲醇3ml活化，再用水3ml洗滌)，用水1ml洗滌，棄去水洗滌液，再用甲醇1ml洗脫，收集洗脫液，即得。(2)色譜條件高效液相色譜條件為色譜柱用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑(ZorbaxSBC18，4.6mmX250mrn，5iim);採用梯度洗脫，流速1.OmL.min—、進樣量20ii1，檢測波長280nm，柱溫25°C，理論板數按主峰計應不低於60000。流動相A為0.1%的甲酸水溶液，流動相B為含乙腈，梯度洗脫程序如表1。6批陳皮指紋圖譜疊加圖9A和對照指紋圖譜如圖9B，相似度計算結別見表22;表226批陳皮的相似度^^相似度值10603010.98320607010.98630606010.995^相似度值i060501O細50605030.991_^_030311_0.935_表22結果表明，相似度平均值0.978，6批陳皮的相似度值均大於0.90。結果表明，國藥控股深圳中藥有限公司生產的健兒清解液藥品的藥材陳皮提取液體各批次間質量均一，穩定。根據以上試驗結果，考慮到藥材來源的穩定性，暫定本品的指紋圖譜應與陳皮對照指紋圖譜相似，相似度不應低於0.90。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。2權利要求一種健兒清解液指紋圖譜控制方法，其特徵在於包括將健兒清解液成品配製的供試液，在一定的色譜條件下測試供試液指紋圖譜，供試液指紋圖譜與對照指紋圖譜經計算機輔助相似度評價軟體計算指紋圖譜的相似度，獲得相似度數值，依據指紋圖譜相似度應大於0.90作為質控標準來控制健兒清解液的質量。2.根據權利要求1所述的健兒清解液指紋圖譜控制方法，其特徵在於所述的健兒清解液指紋圖譜建立方法，包括如下步驟1)健兒清解液供試品溶液的製備先將金銀花、菊花、苦杏仁、連翹分別蒸餾提取芳香水；將山楂用乙醇加熱提取後按順序進行過濾留濾液、濃縮成浸膏得山楂中間體、加水溶解製成山楂藥液；陳皮用乙醇進行滲漉，將滲漉液濃縮成浸膏得陳皮中間體，加水溶解製成陳皮藥液；再合併上述藥液及芳香水，加入適量枸櫞酸、單糖漿及苯甲酸，加水定容，攪勻，過濾即得健兒清解液。取健兒清解液過C18固相小柱，用水洗滌，棄去水洗滌液，再用甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液備用；2)測試吸取健兒清解液供試品溶液注入液相色譜儀，依照高效液相色譜法測定，制定健兒清解液指紋圖譜，其中，高效液相色譜條件為色譜柱用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；採用梯度洗脫，流動相A為0.1%的甲酸水溶液，流動相B為乙腈；梯度洗脫程序如下0分鐘時，97%流動相A、3X流動相B;13分鐘時，95%流動相A、5X流動相B;27分鐘時，85%流動相A、15X流動相B;35分鐘時，80%流動相A、20X流動相B;45分鐘時，80%流動相A、20X流動相B;60分鐘時，72%流動相A、28X流動相B;65分鐘時，40%流動相A、60X流動相B;67分鐘時，0%流動相A、100X流動相B;75分鐘時，0%流動相A、100X流動相B;90分鐘時，97%流動相A、3X流動相B;流速1.OmLmin—1;檢測波長280nm;柱溫25°C。3.根據權利要求2所述的健兒清解液指紋圖譜控制方法，其特徵在於所述步驟(1)中健兒清解液供試品溶液的製備1)將金銀花、菊花、苦杏仁、連翹分別蒸餾提取芳香水；2)將山楂用80%乙醇加熱提取2次，每次2小時，過濾，合併濾液，濾液回收乙醇，濃縮成浸膏得山楂中間體，加水溶解製成山楂藥液；3)將陳皮用60%乙醇進行滲漉，收集滲漉液並濃縮成浸膏得陳皮中間體，加水溶解製成陳皮藥液；4)合併上述各步所得的藥液及芳香水，在加入枸櫞酸0.020.08g、單糖漿200400ml及苯甲酸，加水定容至1000ml，攪勻，過濾即得健兒清解液成品；5)取健兒清解液成品0.52ml，通過C18固相小柱，用水0.52ml洗滌，棄去水洗滌液，再用甲醇0.52ml洗脫，收集洗脫液備用；所述的步驟(2)中色譜條件為進樣量1020iU，流速l.OmL'min—1;檢測波長280nm;柱溫25°C。4.根據權利要求2所述的健兒清解液指紋圖譜控制方法，其特徵在於所述的步驟(2)中流動相A溶液配製比例是按體積百分比配製，所述的流動相B溶劑為色譜純，所述的C18固相小柱的填料規格500mg，臨用前用甲醇3ml活化，再用水3ml洗滌。5.根據權利要求2所述的健兒清解液的指紋圖譜控制方法，其特徵在於所述的山楂和/或陳皮中間體指紋圖譜建立方法，包括如下步驟1)山楂中間體供試品溶液的製備取山楂中間體O.52mL，用甲醇稀釋至10ml，再取lml甲醇稀釋液，接著用水稀釋至10ml，通過C18固相小柱，用0.52mL水洗滌，棄去水洗滌液，再用0.52mL甲醇洗脫，收集洗脫液；和/或陳皮中間體供試品溶液的製備取陳皮中間體O.52mL，用水稀釋至10ml，再通過C18固相小柱，接著用0.52mL水洗滌，棄去水洗滌液，然後用0.52mL甲醇洗脫，收集洗脫液，最後精密取甲醇洗脫液500iil，用甲醇稀釋至lml;2)測試精密吸取山楂和/或陳皮中間體供試品溶液注入液相色譜儀，依照高效液相色譜法及權利要求2步驟(2)的色譜條件測定，制定山楂和/或陳皮中間體指紋圖譜。6.根據權利要求2所述的健兒清解液的指紋圖譜控制方法，其特徵在於所述的山楂和/或陳皮藥材指紋圖譜建立方法，包括如下步驟1)山楂藥材供試品溶液的製備先用80%乙醇加熱提取2次，每次兩小時，過濾後合併濾液，接著濃縮成浸膏，再加適量的水溶解，然後取上述溶解液0.52mL，通過C18固相小柱，用水0.52mL洗滌，棄去水洗滌液，再用甲醇0.52mL洗脫，收集洗脫液備用；和/或陳皮藥材供試品溶液的製備陳皮用60%乙醇進行滲漉，收集滲漉液並濃縮成浸膏，再加適量水溶解，然後取上述溶液0.52mL，通過C18固相小柱，用水`0.52mL洗滌，棄去水洗滌液，再用甲醇0.52mL洗脫，收集洗脫液備用；2)測試精密吸取山楂和/或陳皮藥材供試品溶液分別注入液相色譜儀，依照高效液相色譜法及權利要求2步驟(2)的色譜條件測定，制定山楂和/或陳皮藥材指紋圖譜。7.根據權利要求2所述的健兒清解液的指紋圖譜控制方法，其特徵在於所述的健兒清解液對照指紋圖譜的獲取方法按權利要求2步驟(1)所述方法製備IO批次健兒清解液樣品供試品溶液，按權利要求2步驟(2)的色譜條件分析，獲取10批次健兒清解液HPLC指紋圖譜，以該10批次的數據為基礎，運用計算機輔助軟體導出對照指紋圖譜。8.根據權利要求7所述的健兒清解液的指紋圖譜控制方法，其特徵在於所述的健兒清解液對照指紋圖譜的獲取方法中參數設置為時間窗寬度0.10秒；校正方式採用多點校正；校正色譜峰的確定4個較高的色譜峰峰1:12.7min、峰2:15.9min、峰3:28.2min、峰4:46.8min。9.根據權利要求7所述的健兒清解液的指紋圖譜控制方法，其特徵在於所述的山楂和/或陳皮中間體對照指紋圖譜的獲取方法按權利要求5步驟(1)所述方法製備多批次山楂和/或陳皮中間體供試品溶液，按權利要求2步驟(2)色譜條件分析，獲取多批次山楂和/或陳皮中間體HPLC指紋圖譜，以這些數據為基礎，運用計算機輔助軟體導出對照指紋圖譜。10.根據權利要求9所述的健兒清解液的指紋圖譜控制方法，其特徵在於所述的山楂中間體對照指紋圖譜的獲取方法中參數設置為時間窗寬度0.10秒；校正方式採用多點校正；校正色譜峰的確定6個較高的色譜峰，峰1:18min、峰2:22.8min、峰3:28.3min、峰4:40.3min、峰5:40.8min、峰6:58.2min;和/或陳皮中間體對照指紋圖譜的獲取方法中參數設置為時間窗寬度0.10秒；校正方式採用多點校正；校正色譜峰的確定2個較高的色譜峰，峰1:43.5min、峰2:48.lmin。11.根據權利要求9所述的健兒清解液的指紋圖譜控制方法，其特徵在於所述山楂和/或陳皮中間體指紋圖譜控制方法，包括將山楂和/或陳皮中間體製備的供試液，在權利要求2步驟(2)的色譜條件下測試供試液指紋圖譜，供試液指紋圖譜與對照指紋圖譜經計算機輔助相似度評價軟體計算指紋圖譜的相似度，獲得相似度數值，依據指紋圖譜相似度應大於0.90作為質控標準來控制山楂和/或陳皮中間體的質量。12.根據權利要求7所述的健兒清解液的指紋圖譜控制方法，其特徵在於所述的山楂和/或陳皮藥材對照指紋圖譜的獲取方法為按權利要求6步驟(1)所述方法製備多批次山楂和/或陳皮藥材供試品溶液，按權利要求2步驟(2)的色譜條件分析，獲取多批次山楂和/或陳皮藥材HPLC指紋圖譜，以這些數據為基礎，運用計算機輔助軟體導出對照指紋圖譜。13.根據權利要求12所述的健兒清解液的指紋圖譜控制方法，其特徵在於所述的山楂藥材對照指紋圖譜的獲取方法中參數設置為時間窗寬度0.10秒；校正方式採用多點校正；校正色譜峰的確定6個較高的色譜峰，峰1:18min、峰2:22.8min、峰3:28.3min、峰4:40.3min、峰5:40.8min、和峰6:58.2min;和/或陳皮藥材對照指紋圖譜的獲取方法中參數設置為時間窗寬度0.10秒；校正方式採用多點校正；校正色譜峰的確定2個較高的色譜峰，峰1:43.5min、峰2:48.lmin。14.根據權利要求12所述的健兒清解液的指紋圖譜控制方法，其特徵在於所述山楂和/或陳皮藥材指紋圖譜控制方法，包括將山楂和/或陳皮藥材用溶劑提取製備樣品的供試液，在權利要求2步驟(2)的色譜條件下測試供試液指紋圖譜，供試液指紋圖譜與對照指紋圖譜經計算機輔助相似度評價軟體計算指紋圖譜的相似度，獲得相似度數值，依據指紋圖譜相似度應大於0.90作為質控標準來控制山楂和/或陳皮藥材的質量。全文摘要本發明公開了一種健兒清解液指紋圖譜控制方法，包括將健兒清解液成品配製的供試液，在一定的色譜條件下測試供試液指紋圖譜，供試液指紋圖譜與對照指紋圖譜經計算機輔助相似度評價軟體計算指紋圖譜的相似度，獲得相似度數值，依據指紋圖譜相似度應大於0.90作為質控標準來控制健兒清解液的質量。本發明針對健兒清解液的特性，建立起健兒清解液的指紋圖譜體系，並以計算機輔助將產品指紋圖譜與對照指紋圖譜進行相似度評價，從而來控制健兒清解液產品的質量，使得產品質量穩定可靠，藥性和療效基本一致，安全性高，同時該方法操作方便、精度高、提高了生產效率。文檔編號A61K36/752GK101744920SQ201010108838公開日2010年6月23日申請日期2010年2月4日優先權日2010年2月4日發明者劉力,劉強,劉燦群,孫國英,張春麗,李秋怡,殷米來,蘇麗靜,金霞,陳劍洪,黃超申請人:國藥控股深圳中藥有限公司