重組豬偽狂犬病毒毒株及其製備方法
2023-09-16 12:48:35
重組豬偽狂犬病毒毒株及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種重組豬偽狂犬病毒毒株，重組豬偽狂犬病毒（Herpesviridae）毒株，CCTCCNO：V201345。本發明是在偽狂犬病毒載體的基礎上加入了綠色螢光蛋白標籤，構建了表達綠色螢光蛋白gG缺失的通用轉移載體PG，含有偽狂犬病病毒自身晚期基因gG啟動子、CMV啟動子、SV40Poly(A)且上下遊側翼分別為0.8kb和l.7kb，完全可以滿足同源重組的需要。EGFP不僅可以作為基因表達的指示劑，而且在其上所帶有的多克隆位點內插入了豬IL-18基因，實現了將不同表達框通過一個共同的載體相連而構建，是作為兩個表達框單獨表達的，其外源基因的表達量與兩個表達框連接的方向關係密切。
【專利說明】重組豬偽狂犬病毒毒株及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及病毒學【技術領域】，具體涉及一株表達豬圓環病毒2型0RF2基因和豬IL-18基因的重組豬偽狂犬病毒及其製備方法。
【背景技術】
[0002]豬圓環病毒(Porcine circovirus,PCV)是迄今為止發現的最小動物病毒之一。可根據PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列將PCV分為PCVl和PCV2兩個基因型。PCVl廣泛存在於豬體內及豬源細胞系中，無致病性，不能引起細胞病變；PCV2具有致病性，主要引起斷奶仔豬多系統衰竭症候群(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)。豬由PCV2感染而引起的各種疾病已遍布世界各地，給世界養豬業帶來巨大損失。豬圓環病毒2型有兩個主要的開放閱讀框ORFl和0RF2，其中0RF2基因是PCV2的主要結構蛋白基因，編碼病毒的衣殼蛋白，可自我裝配成病毒樣粒子，並且0RF2蛋白中含有可中和病毒的中和抗原表位，已成為目前PCV2疫苗研究的主要候選基因。PCV2疫苗的研究，目前已有PCV2滅活疫苗、PCV2DNA疫苗、亞單位疫苗和嵌合病毒疫苗，但有關病毒活載體疫苗的報導相對較少。
[0003]偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)屬抱疫病毒科ct抱疫病毒亞科,是引起豬繁殖障礙的主要病原之一。其危害主要表現為母豬流產，產死胎、木乃伊胎及新生仔豬死亡等症候群，臨床以產死胎為主。該病毒基因組龐大，其容量可高達40kb，具有足夠的空間允許外源基因的穩定插入，並且重組病毒在增殖的同時可穩定表達外源基因，從而提供對偽狂犬病毒和其它相應傳染病的抵抗力，具有一個優良活病毒載體的基本特徵。其中最引人注目的是表達豬瘟病毒主要保護性抗原E2基因的重組偽狂犬病毒，目前此疫苗株的遺傳穩定性，外源基因對病毒增殖的影響以及生物安全性均已得到論證，有望投入生產使用。
[0004]白細胞介素18(Interleukin_18，IL-18)是從被熱滅活痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)感染和脂多糖(LPS)誘發的中毒性休克小鼠肝臟提取液中獲得的一種由應激誘生的蛋白，其誘生IFN-Y的能力很強，因而最初被稱為IFN-Y誘生因子(Interferon gamma inducing factor, IGIF)。1996 年成功從鼠 cDNA 庫中篩選到人的IGIF基因，並在大腸桿菌中表達，因其序列與所有已知的細胞因子不同，且生物活性多樣，故將其正式命名為白細胞介素18。IL-18能誘導IFN-Y大量分泌表達，促進T細胞增殖及Thl細胞的免疫應答，增強NK細胞的殺傷活性，抑制Th2類細胞因子的生成，具有廣泛的生物學效應，在免疫調節、抗腫瘤、抗病原微生物感染中具有十分重要的作用。 [0005]綠色螢光蛋白(GFP)存在於發光水母體內，是一種吸收藍光或紫外光後發出綠色螢光的天然蛋白質。同以往常用的報告基因LacZ、CAT、螢光素酶基因以及其它抗生素基因相比，GFP不需要任何外源性底物和輔助因子，無毒、無汙染、穩定，當受到紫外光或藍光激發時，GFP發射綠色螢光。因此其被廣泛應用於分子生物學研究。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種重組豬偽狂犬病毒毒株，分類命名:表達PCV20RF2基因和豬IL-18基因的重組豬偽狂犬病毒PRV-PCV2-1L18 PG018,拉丁文學名:Herpesviridae。保藏單位:中國典型培養物保藏中心，保藏單位簡稱:CCTCC,保藏單位地址:湖北省武漢市武昌區珞珈山路16號武漢大學，保藏日期:2013年11月18日，保藏編號CCTCC NO:V201345o
[0007]本發明的技術方案是:一種重組豬偽狂犬病毒毒株，重組豬偽狂犬病毒(Herpesviridae)毒株，CCTCC NO:V201345。
[0008]所示的重組豬偽狂犬病毒毒株的製備方法，以pGEMT-1L-18為模板，擴增豬IL-18基因，利用重組技術插入到含有PCV20RF2基因的重組豬偽狂犬病毒轉移質粒PGO中，構建載體PG018，將豬偽狂犬病毒弱毒株感染ST細胞後，再轉染重組質粒PG018，經蝕斑純化得到重組豬偽狂犬病毒。
[0009]所述構建載體PG018的步驟如下:
[0010]①根據重組質粒pGEMT-1L-18中豬IL-18基因片段設計I對引物，所述引物序列為:
[0011]上遊引物序列:5』-TAAGATCTATGGCTGCTGAACCGGA-3』,
[0012]下遊引物序列:5』-CGCCAGATCTCTAGTTCTTGTTTTG-3，；
[0013]②豬IL-18的PCR擴增
[0014]以pGEMT-1L-18為模板進行PCR擴增，體系如下:
[0015]
【權利要求】
1.一種重組豬偽狂犬病毒毒株，其特徵在於:重組豬偽狂犬病毒(Herpesviridae)毒株，CCTCC NO:V201345o
2.如權利要求1所述的重組豬偽狂犬病毒毒株的製備方法，其特徵在於:以pGEMT-1L-18為模板，擴增豬IL-18基因，利用重組技術插入到含有PCV2 0RF2基因的重組豬偽狂犬病毒轉移質粒PGO中，構建載體PG018，將豬偽狂犬病毒弱毒株感染ST細胞後，再轉染重組質粒PG018，經蝕斑純化得到重組豬偽狂犬病毒。
3.根據權利要求2所述的所述的重組豬偽狂犬病毒毒株的製備方法，其特徵在於:所述構建載體PGO18的步驟如下: ①根據重組質粒pGEMT-1L-18中豬IL-18基因片段設計I對引物，所述引物序列為: 上遊引物序列:5』 - TAAGATCTATGGCTGCTGAACCGGA-3』, 下遊引物序列:5』 - CGCCAGATCTCTAGTTCTTGTTTTG -3』 ； ②豬IL-18的PCR擴增 以pGEMT-1L-18為模板進行PCR擴增，體系如下:
4.根據權利要求2所述的所述的重組豬偽狂犬病毒毒株的製備方法，其特徵在於:所述轉染重組質粒PG018的步驟如下:用B10MIGA無內毒素質粒小提試劑盒提取質粒PG018至I μ g/ μ L備用，復甦細胞，轉染前24h將ST細胞傳至第3代，將細胞懸液加到6孔板中，先用PRV疫苗株接種至90%的ST細胞，吸附1.5h後，將質粒PGO18進行轉染，置37°C、5%CO2下培養5h後，吸棄孔內培養液，每孔加入1.5mL細胞維持液，於37°C、5% CO2下繼續培養36h，收穫病變細胞，反覆凍融3次用於重組病毒的篩選。
5.根據權利要求2所述的所述的重組豬偽狂犬病毒毒株的製備方法，其特徵在於:所述蝕斑純化的步驟如下:將轉染獲得的病毒液按10 - ^ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'Κ6進行稀釋，各取400 μ L接種到ST細胞長至單層的6孔板中，置於37°C細胞培養箱內吸附1.5h後，每孔加入2mL低熔點營養瓊脂糖，培養48h，此時在螢光顯微鏡的藍光(波長42(T490nm)下能觀察到綠色和無特殊螢光顏色的兩種病毒蝕斑，在螢光顯微鏡下用巴氏吸管吸取綠色蝕斑，加入DMEM維持液於-20° C反覆凍融3次，然後將收穫的病毒液接種到含單層ST細胞的24孔細胞培養板內至90%以上的細胞發生病變時收毒，將每孔收集的病毒提取DNA並進行PCR擴增，選擇PCR陽性的病毒進行下一輪的蝕斑純化，直至獲得純淨的重組病毒PG018。
【文檔編號】C12N7/01GK103952379SQ201410104923
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年3月20日 優先權日:2014年3月20日
【發明者】陳紅英, 鄭蘭蘭, 崔保安, 郭曉慶, 魏戰勇, 朱前磊 申請人:河南農業大學