利用葉綠體製備狂犬病毒抗原的方法

2023-09-16 12:52:35 1

專利名稱：利用葉綠體製備狂犬病毒抗原的方法
技術領域：
本發明涉及一種抗原的製備方法，尤其涉及一種利用衣藻葉綠體製備狂犬病毒抗 原的方法，屬於狂犬病毒抗原的製備領域。
背景技術：
狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies Virus，RV)侵犯中樞神經系統引起的人獸共患致 死性腦脊髓炎，一旦發病，死亡率幾乎為100 %，對人類生命安全構成嚴重威脅。該病呈全球 性分布，亞洲尤其是我國流行較為嚴重，對人類生命安全構成嚴重威脅。疫苗免疫仍是預防 和控制狂犬病的最可靠的手段，因此對狗、貓和野生動物的大面積的預防免疫是控制和消 滅狂犬病的根本措施。目前我國獸用的狂犬病疫苗主要有滅活苗和弱毒苗。儘管傳統疫苗 在狂犬病預防控制中仍佔主導地位，但生產成本昂貴，免疫期短，疫苗製備過程中病毒逃逸 等危險因素很難避免。因此，研究和開發免疫效果好、成本低廉的新型狂犬病疫苗已成為研
J Li^^i ； ^^ °隨著分子生物學、基因工程等高新技術的發展，利用植物生物反應器生產動物疫 苗是廉價高效疫苗的可靠來源之一，受到了科學家的普遍關注，特別是植物葉綠體表達系 統由於具有外源基因表達量高、環境安全性好等優點，已成為目前植物生物反應器的研究 熱點。本發明就是利用衣藻葉綠體作為生物反應器來生產狂犬病疫苗。利用衣藻葉綠體作為表達系統表達動物疫苗是九十年代建立的，並在之後的時間 裡不斷有動物疫苗成功表達的報導。範國昌等(1999)(衣藻葉綠體表達體系的建立，科學通報，1999，44 (12) 1301-1306)構建了A型肝炎病毒VP 3P1區和C型肝炎病毒C區融合抗原基因的衣藻葉綠 體轉化載體，基因槍法轉化衣藻葉綠體。該基因在衣藻葉綠體雙啟動5』chlL-5』atpA調控 下，得到具有雙價抗原活性的融合抗原蛋白表達產物。1999年，張中林等(C肝病毒融合抗原基因NS3-C定點整合入衣藻葉綠體基因組 的研究，遺傳，1999，21 (6) 1-6)將C型肝炎病毒(HCV)兩段DNA片段，即HCV基因組非結 構NS3區抗原基因(約0. 7kb)和核心抗原C區抗原基因(約0. 6kb)的cDNA片段，中間加 入連接肽Ser-Pro-Gly-Ser的密碼子序列，構建成融合抗原基因NS3-C，再將該表達盒與選 擇標記基因aadA表達盒和衣藻葉綠體基因組同源片段連接，構建成衣藻葉綠體轉化載體 pSS6。基因槍法轉化衣藻葉綠體，經PCR和Southern雜交分析表明，融合抗原基因NS3-C 已整合到衣藻葉綠體基因組中。2003 年，Sun M 等(Foot-and-mouth disease virus VP1 protein fusedcholera toxin B subnit expressed in Chlamydomonas reinhardtiichloroplast. Biotechnology Letters, 2003, 25 =1087-1092)人成功的在衣藻葉綠體中進行了口蹄疫病毒(FMDV)VPl與 霍亂毒素B亞基(CTB)融合基因的重組和表達。經過Western blot和ELISA免疫雜交分析 表明CTBVP1融合蛋白表達量佔可溶性總蛋白量的3-4 % (lmg可溶性總蛋白含有30-40 u g 的重組蛋白)；Gm-ELISA結合分析證明衣藻葉綠體所表達的CTBVP1融合蛋白能夠正確地摺疊形成寡聚體，從而具有一定的生物學活性。2008 年 3 月 Dong-Mei He 等人(Reeombination and expression ofclassical swine fever virus (CSFV)structural protein E2 gene inChlamydomonas reinhardtii chroloplasts, Colloids and Surfaces B :Biointerfaces, 2007, 55 :26_30)成功的在衣 藻葉綠體中進行了典型的豬瘟病毒(CSFV)的結構蛋白E2的重組和表達。經過Western blot和ELISA免疫雜交分析表明，CSFV的結構蛋白E2的表達量佔衣藻細胞可溶性總蛋白 的2%。迄今為止，狂犬病毒的G基因和N基因分別已經在不同的生物反應器中進行過表 達，例如大腸桿菌、家蠶等。但這些生物反應器都存在各自的不足，例如利用大腸桿菌表達 的蛋白免疫，由於動物體內自身存在大腸桿菌，因此可能對有益的正常的大腸桿菌產生抑 製作用，另外利用家蠶表達的蛋白進行免疫，由於家蠶體內與被免疫的動物之間存在著一 些同源性較高的蛋白，因此可能產生一些非目的性的免疫反應。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種利用衣藻葉綠體表 達系統安全、高效的表達多種狂犬病毒抗原的方法。本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的利用有利於製備狂犬病毒抗原的方法，包括(1)構建狂犬病毒抗原基因衣藻葉 綠體表達載體；(2)將所構建的狂犬病毒抗原基因衣藻葉綠體表達載體轉化衣藻，篩選得 到轉化有狂犬病毒抗原基因的轉基因衣藻；(3)培養轉基因衣藻，使狂犬病毒抗原基因在 衣藻中表達，即得。上述方法中，所述狂犬病毒抗原基因包括狂犬病病毒抗原蛋白G基因(其核苷酸 序列為SEQ ID N0:1所示；)或狂犬病病毒抗原蛋白N基因(其核苷酸序列為SEQ ID NO 2所示)；所述的狂犬病毒抗原基因衣藻葉綠體表達載體可參考以下方法構建得到將狂犬 病毒抗原基因與衣藻葉綠體特異啟動子和終止子組合成狂犬病毒抗原基因表達盒；將狂犬 病毒抗原基因表達盒與衣藻葉綠體基因組中的同源片段連接，構建得到狂犬病毒抗原基因 衣藻葉綠體表達載體；所述的葉綠體特異啟動子包括但不限於atpA、atpB、pSbA、pSbD或rbcL，優選的， 所述的啟動子為atpA啟動子，所述的終止子優選為rbcL終止子。所述的同源片段優選為衣藻葉綠體基因組中的下述序列 clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2(其核苷酸序列為 SEQ ID NO :3 所示)。優選的，所述的狂犬病毒抗原基因衣藻葉綠體特異表達載體還含有選擇標記基 因，該選擇標記基因優選為細菌來源的抗菌素抗性基因，更優選為aadA基因。步驟(2)中所述的衣藻優選自(Chlamydomonas reinhardtii)，其品係為137cc ； 更優選的，所述的衣藻為處於生長對數期後期的衣藻。步驟(2)中所述的轉化方法優選為基因槍法。本發明一個優選的整體技術方案將狂犬病病毒抗原蛋白G基因連入patpY載體BamHI和Hind III之間，使G基因片段置於衣藻葉綠體基因特異啟動子5，atpA和終止子3，rbcL調控之下得到質粒patpY-G ；再將其克隆入含有aadA表達盒和同源重組片段clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2的p64D 質粒EcoRV位點，構建得到狂犬病毒G衣藻葉綠體表達載體P64D-G ；將p64D_G基因槍轉化 萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，篩選得到轉化有狂犬病病毒抗原蛋白G基因的 轉基因衣藻，其微生物保藏號是CGMCC No. 3424，其分類命名是萊茵衣藻(Chlamydomcmas reinhardtii)；保藏時間是2009年11月9日；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究 所。本發明另一個優選的整體技術方案將狂犬病病毒抗原蛋白N基因連入patpY載體BamHI和Hind III之間，使N基因 片段置於衣藻葉綠體基因特異啟動子5，atpA和終止子3，rbcL調控之下得到質粒patpY-N ； 再將其克隆入含有aadA表達盒和同源重組片段clpP-trnL-petB-chlL-rp 123-rp 12的 P64D質粒EcoRV位點，構建得到狂犬病毒G衣藻葉綠體表達載體p64D_N ；將p64D_N用基 因槍法轉化萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，篩選得到轉化有狂犬病病毒抗原 蛋白N基因的轉基因衣藻，其微生物保藏號是CGMCC No. 3423，其分類命名是萊茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)；保藏時間是2009年11月9日；保藏單位中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國 科學院微生物研究所。本發明採用基因同源重組技術，將來源於狂犬病病毒的不同基因(包括狂犬病毒 的糖蛋白G或核蛋白N)構建到由衣藻葉綠體特異啟動子atpA和終止子rbcL組合所驅動 的表達盒，利用衣藻葉綠體基因組中的clpP-trnL-petB-ChlL-rpl23-rpl2作為同源片段， 發生同源重組，通過基因槍轉化法導入衣藻葉綠體中，通過PCR、Western blot、ELISA等分 子生物學手段檢測，最終獲得轉基因衣藻，狂犬病毒的抗原基因在衣藻葉綠體中得到成功 表達，所表達的狂犬病毒的抗原蛋白佔總的可溶蛋白的2%以上；經試驗證實，所表達的重 組抗原蛋白具有良好的免疫效果，可以用於製備成狂犬病疫苗。本發明方法利用衣藻葉綠體表達系統表達狂犬病毒抗原，不僅彌補了其他生物反 應器的不足，而且還有其自身的優點第一，衣藻葉綠體能夠正確的摺疊和組裝複雜的哺乳 動物的蛋白；第二，在衣藻中，從最初的轉化到合成一定量的蛋白質需要的時間相當短。第 三，外源基因能定點整合在衣藻葉綠體基因組上。第四，外源基因在後代中可穩定表達。第 五，衣藻葉綠體基因組具有分子量小、結構簡單、不結合組蛋白等特點有利於實現分子操 作，生產的藥用蛋白不需純化，可直接作為動物添加飼料就可起到治療的效果，方便安全。本發明方法採用衣藻葉綠體表達系統在衣藻生物反應器中安全、高效的生產狂犬 病毒抗原，所表達的蛋白特異性較高，具有良好的免疫效果而且不會產生非目的性的免疫 反應。本發明抗原的製備方法的成本顯著低於傳統的製備狂犬病毒抗原方法(例如通過細 胞繁殖病毒製備狂犬病毒抗原)，無需投資建廠，無三廢，電力和水資源等能源消耗極少。由 於衣藻是無毒的，可以食用，所以本發明方法所製備的抗原，安全性極高，可直接製作疫苗 免疫動物。總體而言，本發明方法可以大幅度降低狂犬病毒抗原的生產成本，具有安全、高 效、能耗少、成本低等諸多優點。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術 人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。實驗材料I.E. coli TOPlO購自Promega公司；狂犬病毒的糖蛋白和核蛋白的基因由蘭州獸 醫研究所惠贈；Si生型萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtti)，137CC 和 paptY(patpY 的 構建方法見參考文獻楊宗岐等，人可溶性TRAIL蛋白在衣藻葉綠體中的表達，科學通報， 2006,51(12) 1400-1405)、p64D(p64D的構建方法見參考文件範國昌等，衣藻葉綠體表 達體系的建立，科學通報，1999，44(12) 1301-1306)由中國農業科學院生物技術研究所保 存；2.酶與試劑各種限制性內切酶、T4DNA連接酶、Klenow酶及其配套緩衝液購自 Promega公司；抗原檢測試劑盒購自武漢生物製品研究所基因工程室3.生化試劑IPTG、X_Gal為Promega公司產品；瓊脂糖為Sunbiotech公司產品； Tris, dNTPs購自Sigma公司；蛋白腖、酵母抽提物、胰蛋白腖均購自OXOID公司；溴化乙錠 (EB)購自Fluka公司；HRP標記的羊抗兔IgG抗體；TEMED (N，N，N』，N』 -四甲基乙二胺)購 自瑞典LKB BROMMA公司；SDS為BDH公司產品；β-巰基乙醇，Tris購自Sigma公司；考馬斯 亮蘭R-250、N，N'-甲叉雙丙烯醯胺購自瑞士 Fluka Chemie AG公司；丙烯醯胺為Aldrich 化學有限公司產品；硝酸纖維素膜Hybond-N和尼龍膜Hybond-C均為Amersham產品；4.培養基大腸桿菌培養基為LB(1%蛋白腖、0. 5%酵母提取物、NaCl， pH7. 0)；衣藻培養基為TAP培養基；5.試驗所用的健康小白鼠購自北京生物製品研究所，為6-8周齡雌性BALB/c小白 鼠°實施例1狂犬病毒抗原G基因的獲得、表達載體的構建和轉化、轉基因衣藻鑑定1、狂犬病病毒抗原蛋白G基因的克隆和表達載體的構建1.1目的基因的獲得根據已知的的狂犬病毒的G的序列，分別設計引物，並且分別引BamHI位點和XbaI 位點，兩對引物如下F Gl 5' -AGGATCCAACATGGTTCCTCAGGTTCTT-3『BamHI酶切位點 R G2 5' -ATCTAGACTACTTTCCCCAGTTCGGGAG-3『XbaI酶切位點在 0. 5mL eppendorf 管中力口入ddH2041 μ LIOXPCR buffer 5μ LIOmM dNTP1 μ L上遊引物 Gl/m0. 5μ L
下遊引物 G2/N2 0. 5 μ LLA Taq DNA 聚合酶 1 μ L狂犬病病毒DNA 1 μ L總計50 μ L反應程序
formula see original document page 71.2產物的回收用普通凝膠進行電泳，切下所需DNA條帶，稱重後放入Eppendorf管中，加入3倍 體積(v/w)的6mol/L NaI溶液，37°C下使凝膠充分溶解，再加入10 μ L玻璃奶吸附DNA，室 溫下放置5min，稍離心5s，去上清，沉澱用New Wash洗液洗滌一次，重複離心、洗滌三次，晾 幹後用30yL 0. IXTE Buffer溶解DNA，離心後取上清，將DNA保存於20°C備用。1. 3酶切和連接反應參照試劑盒說明書中各種酶的最適反應條件進行。反應體系一般包含質粒DNA 1 2μ g，l/10體積的IOX酶反應緩衝液，酶量為2-4Μ/μ g DNA,總體積一般為15 20 μ L0最適溫度(一般為37°C )下反應1 2h，用瓊脂糖凝膠電泳鑑定酶切是否完全。1.4質粒DNA或連接產物的轉化取_70°C凍存的感受態細胞，用雙手搓至大部分融化後迅速置冰上。感受態細胞 完全融化後加入質粒DNA20 IOOng或連接混合物5 μ L，輕輕混勻，冰浴30min。42°C熱激 90sec，迅速置冰上1 2min。加入ImL已溫育至37°C的LB培養基，37°C振蕩((150rpm) 培養lh。4，OOOg離心5min，去部分上清後(留150 200 μ L)塗布於含適當抗生素的LB 平板上。37°C倒置培養過夜。1. 5鹼裂解法提取質粒DNA(1)用無菌牙籤從LB平板上挑取單菌落，接種於4mL含100 μ g/mL氨卡青黴素的 LB液體培養基中，37°C，230r/min，振蕩培養過夜；(2)取1. 5mL過夜培養物於Eppendorf管內，5，OOOrpm離心5min收集菌體，棄上 清；(3)用 150 μ L Sol I 懸浮沉澱，冰浴 IOmin ；(4)加300 μ L Sol II和150 μ L氯仿，輕輕倒轉混勻後冰浴5min ；(5)加 450 μ L Sol III，倒轉混勻後冰浴 IOmin ；(6) 12，OOOrpm離心lOmin，取上清，加0. 6倍體積異丙醇，混勻後於4 °C放置 20min ；(7) 12，OOOrpm 離心 lOmin，棄上清，沉澱溶於 250 μ L TER(含 20 μ g/mL RNaseA 的 IX TE)中，37°C消化 20min，加入 300 μ L PPt 沉澱 Buffer，混勻後置 4°C 20min ；
(8) 12，OOOrpm離心lOmin，棄上清，70 %乙醇洗一次，真空乾燥沉澱，用80 μ L 0. 1ΧΤΕ(ρΗ8. 0)溶解，_20°C保存備用。1. 6重組子的鑑定酶切鑑定首先小量抽提質粒DNA，然後利用BamHI和XbaI進行酶切反應，電泳後 出現約1. 37kb的DNA條帶的質粒為重組質粒pEASY-T3-G。將重組質粒pEASY_T3_G進行雙 向測序。測序結果與預期結果一致。2衣藻葉綠體表達載體的構建質粒patpY含有衣藻葉綠體基因組特異啟動子5』 atpA和終止子3』 rbcL及 由BamHI起始的一組多克隆位點。將測序正確的陽性重組質粒pEASY_T3_G，用BamHI和 HindIII雙酶切，將回收的目的片段，連入patpY載體BamHI和Hind III之間，使G片段置 於衣藻葉綠體基因特異啟動子5』 atpA和終止子3』 rbcL調控之下，得到質粒patpY_G ；再 用EcoRV和N ot I雙酶切，並補平NotI位點，回收含有G編碼區表達盒的2. 5kbDNA片段， 將其克隆入含有aadA表達盒和同源重組片段clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2的p64D 質粒EcoRV位點，構建成編碼狂犬病毒G衣藻葉綠體表達載體p64D-G。3基因槍轉化3. 1衣藻的培養及衣藻受體細胞的準備野生型衣藻生長在TAP液體培養基中，20 25°C，160rpm,光周期12hr/12hr，參閱 Harris(Harris Ε.The Chlamydomonas source book, Acomprehensive guide to biology and laboratory use.San Diego :Academic Press,1989)。取1.5mL生長至對數後期(5 6X106 cells/mL)的衣藻於離心管中濃縮 (5，OOOrpm, 20°C，5min)，去上清，留200 μ L，塗於TAP固體平板上，3000Lux的光照條件下培 養1 2天，用無菌鏟子挖出均勻地長有一層衣藻的直徑為2 3cm的培養基塊，放入9cm 無菌平皿中央，以備轟擊。3. 2 微粒子彈(DNA coated microprojectiles)的製備稱60mg 1. Oym 的金粉(Bio-Rad)於 1. 5mL Eppendorf 管中；加入 ImL 無水乙醇， 充分渦旋(vortex)，然後靜置lOmin，10，OOOrpm離心IOsec ；小心去除上清液，加入ImL無 菌水，充分渦旋，10, OOOrpm離心lOsec，棄上清液；重複用無菌水洗滌2次；用ImL無菌的 50% (ν/ν)甘油重懸金粉顆粒。處理後的金粉可在_20°C長期保存；取50 μ 1上述製備好並已渦旋的金粉顆粒，轉入一無菌的1. 5mL印pendorf管 中，按順序加入 5μ L DNA(1 μ g/μ L)、50μ 1 2. 5mol/L CaCl2 禾口 20 μ L 0. lmol/L 亞精胺 (Free base，現配現用)；將混合物渦旋lmin，置於冰上Imin ；重複10次；置於冰上30min 以上；15，OOOrpm離心5sec，去除上清液；用250 μ L無水乙醇洗滌包被好的金粉顆粒2次， 10，OOOrpm離心lOsec，去除上清液；60 μ L無水乙醇重懸金粉顆粒。3. 3裝備基因槍(1)基因槍的準備將基因槍放置於一個較大型號的超淨工作檯上，打開超淨臺紫外燈滅菌30min以 上；用70%酒精擦淨基因槍真空室及各種元件；用浸泡消毒法將可裂膜(Ruptyre disk 1，IOOps i)、載體膜(Macrocarrier)、阻擋網(Stoppingscreen)及 Macrocarrier holders 於無水乙醇中消毒15min，然後將Rupturedisk和Macrocarrier置於無菌濾紙上，在超淨臺中吹乾；用鑷子夾住Macrocarrier holder，在酒精燈火焰上稍事灼燒後置於無菌濾紙上；待Macrocarrier holder冷卻後，用鑷子將Macrocarrier置於其中並展平。取10 μ L 包被DNA的金粉顆粒無水乙醇懸浮液，點於Macrocarrier中心位置，於超淨工作檯中吹 幹；打開電源開關、真空泵及氦氣瓶閥門；取出Macrocarrier launch assembly，擰開蓋 子，將Stopping screen在酒精燈火焰上灼燒後置於凹槽內，把Macrocarrier holder倒 扣於凹槽上，旋緊蓋子；將Rupture disk裝於固定蓋中並旋緊；將組裝好的Macrocarrier Iaunchassembly置於基因槍真空室的上數第二個格子中；將裝有衣藻培養基的培養皿置 於Target shelf中心，並將Target shelf置於真空室的上數第四個格子中，使轟擊距離為 9cm;關緊真空室小門。(2)轟擊抽真空按VAC鍵，當真空度達到25 28 inches Hg時，將VAC鍵直接鎖定在HOLD 位置；轟擊按住FIRE鍵，直至Rupture disk爆裂；再按VENT鍵，使真空表指針回零。打 開真空室小門，取出樣品。通常每個樣品轟擊2次。4轉基因衣藻的篩選4. 1轉化後衣藻的過度培養轟擊後的衣藻置於3000LUX的光照條件下培養8h(20 25°C)，再用ImL無菌 水把瓊脂塊上的衣藻洗下，塗於5皿含100 μ g/mL壯觀黴素的抗性選擇培養基(TAP+Spc 100 μ g/mL)上培養。4. 2轉化衣藻的篩選培養將塗於抗性選擇培養基上的衣藻在3000LUX的連續光照條件下培養約10天左右， 挑取單藻落，於50mL液體選擇培養基(TAP+Spc 100 μ g/mL)中培養。4. 3衣藻轉化子的同質化培養儘管衣藻細胞內只有一個葉綠體，但是葉綠體內卻含有80-100個葉綠體基因組 拷貝，最初轉化的衣藻葉綠體內既含有轉基因的基因組，也含有野生型基因組拷貝，因此它 的葉綠體基因組是異質的，需要進一步的同質化篩選。將TAP液體選擇培養基(TAP+Spc 100 μ g/mL)中培養7天左右的轉化子，重新塗布於固體抗性選擇培養基(TAP+Spc 100 μ g/mL)上培養，而後再挑取 單藻落轉到液體培養基中培養，如此重複多輪進行繼代培養，以達到提高外源基因在葉綠 體基因組中的同質化程度。5轉基因衣藻的檢測5. 1衣藻DNA的提取(1)取IOmL處於對數生長後期的衣藻培養液，5，000rpm，4°C離心5min ；(2)衣藻細胞沉澱用 350 μ L NET 溶液(0. lmol/L NaCl, 50mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.0)懸浮後，加入 25yL Proteinase K (10mg/mL)，25 μ L 20%SDS，混勻， 55°C 水浴 2h。(3)置於冰上冷卻，加入200 μ L 5M乙酸鉀(KAc)，冰上靜置30min。(4)12，000印111，41離心51^11，上清液加入等體積的酚/氯仿(1 1)抽提兩次，再 用等體積的氯仿抽提一次。水相加入2倍體積的無水乙醇，混勻後置於_20°C靜置20min。(5)12，000印111，41離心51^11，沉澱用70 %乙醇洗滌，真空乾燥後溶於30 μ L超純水中。5. 2轉基因衣藻PCR檢測(1)衣藻轉化子G編碼區DNA的PCR檢測PCR 體系ddH2015 μ L10XPCR buffer 2μ LIOmMdNTP0. 5 μ L上遊引物0. 5yL下遊引物0. 5yLTaqDNA 聚合酶0. 5 μ L衣藻總 DNAIuLTotal20 μ L反應程序為
95 0C5 min
95 °C1 min η
55 °C1 min p0 cycles
72 0C1 min30s
72 °CIOmin取4yL PCR產物上樣於瓊脂糖凝膠上電泳，在衣藻轉化子中分別擴增獲得與 預期大小完全一致的片段，而在野生型衣藻中則沒有相應的條帶出現。(2)葉綠體轉基因衣藻同質化程度的PCR檢測P5 GGTTTGCCGAACAATGTTTTTATTCCTGP6 :AGAGGAAAGTATTTAAAGCTGCTTATTC以轉基因衣藻DNA為模板，用LA Taq DNA聚合酶進行PCR擴增。PCR 體系ddH2011. 5μ LIOXPCRbuffer 2μ LIOmMdNTP4μ L上遊引物(Ρ5)0. 5μ L下遊引物(Ρ6)0. 5uLLATaqDNA 聚合酶 0· 5 μ L衣藻總 DNAIuLTotal20 μ L反應程序為95 °C5 min
95 °C1 min
1 50 °C2min L 30 cycles
72 °C4 min J
72 °C10 min擴增結果，經過10輪抗性加壓篩選後的獲得轉G基因的衣藻葉綠體轉化子，只擴 增出了一條4. 37kb的條帶，大小與預期結果相符，說明狂犬病毒的G基因連同aadA基因定 點插入到衣藻葉綠體基因組中，並達到完全同質化。5. 3衣藻總蛋白的提取(1)將生長期為對數後期的IOmL衣藻培養液，離心收集；(2)沉澱用20(^1^裂解液(2%505，5011111^8-(1 !17.5，5% β-巰基乙醇) 重懸後煮沸5min ；(3) 12000rpm，離心5min，上清加入三氯乙酸至終濃度為10%，混勻；(4) 12000rpm，離心lOmin，沉澱用90%丙酮洗滌，將大部分葉綠素抽提掉；(5)待丙酮揮發掉後，沉澱重懸於加樣緩衝液，以備蛋白分析。5. 4 Western blot 檢測(1)取總蛋白進行電泳；(2)剪下所需大小的NC膜，然後將膜轉入轉移緩衝液中至少5min ；同時也將凝膠 浸入轉移緩衝液中；(3)在電轉儀上依次鋪上濾紙、NC膜、凝膠、濾紙，用玻璃棒趕去氣泡，以1. 5mA/Gm2 凝膠面積的恆定電流轉印1. 5h ；(4)取出轉印好的膜，放入PBS中輕輕搖動洗膜IOmin ；
(5)傾去PBS，加封閉液室溫輕搖Ih ；(6)將膜浸入含第一抗體(1 1500)的封閉液中，4°C輕搖過夜；(7)將膜放入洗滌液中輕輕搖動洗膜3次，每次IOmin ；(8)將膜轉入含HRP標記的羊抗兔二抗(1 1000)的PBS中，室溫輕搖Ih ；(9)將膜放入洗滌液中輕輕搖動洗膜3次，每次IOmin ；(10)將膜轉入PBS中，輕搖洗膜2次，每次5min ；(11)將膜轉入新配的DAB顯色液中，室溫下暗處顯色5-lOmin，待有明顯的顯色條 帶時，用去離子水漂洗終止反應。結果在52kDa位置處都出現特異雜交信號條帶，而未轉基因的野生型衣藻則沒有 出現可見的信號條帶。這說明狂犬病病毒抗原G蛋白在三株衣藻轉化子的葉綠體中得到了 表達，並分別具有抗原性。5. 5ELISA 檢測(1)樣品蛋白的提取取IOmL衣藻10，OOOrpm離心5min，吸取上清；同時野生性衣 藻提取物分別作為陰性對照；(2)取100 μ L加入至96孔酶標板中(同時作1個平行對照)，4°C冰箱包被過夜；(3)第二天用洗滌液快速洗板5-6次。加入封閉緩衝液100 μ L，在一個溼度大的盒子中，室溫下保溫Ih ；(4)用洗滌液洗板3次，加入第一抗體100μ L(1 1000稀釋)，室溫反應2h ；(5)用洗滌液快速洗板5-6次。加入HRP標記的羊抗兔二抗(二抗稀釋500倍)， 室溫下反應2h ；(6)用洗滌液快速洗板5-6次，加入底物顯色溶液lOOyL。室溫下閉光反應 3_15min。經過試驗檢測，在衣藻葉綠體中所表達的重組狂犬病毒G蛋白佔總的可溶蛋白的 2%以上。5. 6動物免疫試驗(1)小白鼠免疫分組將上述重組的表達了 G蛋白的衣藻經超聲波破碎，離心去細 胞碎片，濃縮後製備為抗原，將收集純化的無菌抗原與等體積油佐劑混合試製成注射疫苗； 將初步純化的狂犬病毒G抗原用等體積的濃度為31%脂肪酸(該脂肪酸由以下體積百分 比的各組分組成棕櫚酸7. 5%、油酸20. 0%,3. 5%硬脂酸、餘量為水)混合，經超聲波乳化 後製備成口服疫苗，經口灌注，在小白鼠上進行動物試驗。0. 5mL/只經肌肉或口服途徑各 免疫小白鼠。將48隻BALB/c小白鼠隨機分成4組，即G抗原口服組、G疫苗肌肉注射組、G 抗原肌肉注射組和陰性對照組，每組12隻小白鼠。(2)免疫反應觀察於免疫注射後24h、48h和72h內，分別觀察記錄小白鼠免疫反 應症狀。(3)小白鼠抗體測定對第一次免疫後1周的小白鼠和第二次免疫後第二周、第三 周、第四周的小白鼠每組隨機取3隻剪尾採血，分離血清，混合後用寧波天潤生物藥業有限 公司生產的動物狂犬病病毒IgG抗體測定試劑盒測定抗體。通過抗原口服途徑免疫的小白鼠，在免疫後24h、48h和72h進行臨床反應觀察，每 組均未見小白鼠出現精神沉鬱、呼吸急促、採食減退以及死亡等現象。在試驗的整個過程 中，小白鼠均健康存活，表現與對照組一樣。將G抗原口服、G疫苗肌肉注射、G抗原肌肉注射1免第1周、2免第2周、2免第三 周、2免第四周採血所分離的血清用狂犬病液相阻斷ELISA檢測試劑盒檢測抗體水平，分析 抗體消長規律。結果顯示，用3種不同的方式進行免疫，在免疫後第7天未產生抗狂犬病毒 G抗原的IgG抗體，在2免後第二周，G疫苗肌肉注射和G抗原肌肉注射均產生了較高的抗 狂犬病毒G抗原的IgG抗體，其OD值分別達到0. 56和0. 61，超過了 0. 5IU/ml，表明所產生 的抗體能抵抗狂犬病毒的攻擊。而G抗原口服組未能產生抗狂犬病毒G抗原的IgG抗體， 由於抗原通過口服免疫，主要刺激黏膜免疫反應，因此其誘導產生的主要是IgA抗體，經檢 測其IgA抗體的OD值可達0. 29，較1免後1周的IgA抗體有較大的提升。在2免後第3周 和第4周，G疫苗肌肉注射和G抗原肌肉注射的抗體水平略有下降，但仍然維持在較高水平； 而G抗原口服組的I gA抗體仍然保持在2免後第2周的水平。注陰性對照為樣品稀釋液，陽性對照為試劑盒中提供的狂犬病陽性血清，其效價 達 0. 5IU/ml。綜上所述，利用衣藻葉綠體表達的狂犬病毒G抗原無轉基因生物安全隱患，同時， 用該抗原製備的疫苗具有良好的免疫效果，可以應用於免疫後的抗體檢測、注射和口服疫
田ο
實施例2狂犬病毒抗原N基因的獲得、表達載體的構建和轉化、轉基因衣藻鑑定1、狂犬病病毒抗原蛋白N基因的克隆和表達載體的構建1.1目的基因的獲得根據已知的的狂犬病毒的N的序列，分別設計引物，並且分別引BamHI位點和XbaI 位點，兩對引物如下F Nl 5' -AGGATCCATGGATGCCGACAAGAT-3『BamHI酶切位點R N2 5' -ATCTAGATTTATGAGTCATTCGAATACGT-3『XbaI酶切位點在 0. 5mL eppendorf 管中力口入ddH2041 μ LIOXPCRbuffer5μ LIOmMdNTP1 μ L上遊引物 Gl/m0. 5μ L下遊引物 G2/N20. 5 μ LLA Taq DNA 聚合酶 1 μ L狂犬病病毒DNA1 μ L總計50 μ L反應程序
95 0C5 min
95 °C1 min η
56 °C1 min 卜30 cycles
72 °C1 min30s
72 °CIOmin經過PCR產物的回收，連接，轉化，鹼裂解法提取質粒DNA，然後利用BamHI和XbaI 進行酶切反應，電泳後出現約1. 37kb的DNA條帶的質粒為重組質粒pEASY-T3-G。將重組質 粒pEASY-T3-G進行雙向測序。測序結果與預期結果一致。2衣藻葉綠體表達載體的構建質粒patpY含有衣藻葉綠體基因組特異啟動子5』 atpA和終止子3』 rbcL及由 BamHI起始的一組多克隆位點。將測序正確的陽性重組質粒pEASY_T3_N，用BamHI和Hind 111雙酶切，將回收的目的片段，連入PatpY載體BamHI和HindIII之間，使N片段置於衣藻 葉綠體基因特異啟動子5』atpA和終止子3』rbcL調控之下，得到質粒patpY-N ；再用EcoRV 和Not I雙酶切，並補平NotI位點，回收含有N編碼區表達盒的2. 35kbDNA片段，將其克隆 入含有aadA表達盒和同源重組片段clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2的p64D質粒EcoRV 位點，構建成編碼狂犬病毒N衣藻葉綠體表達載體p64D-N。3基因槍轉化4轉基因衣藻的篩選
5轉基因衣藻的檢測5.1衣藻DNA的提取5. 2轉基因衣藻PCR檢測(1)衣藻轉化子N編碼區DNA的PCR檢測PCR體系ddH2015 μ L10XPCR buffer 2μ LIOmMdNTP0. 5 μ L上遊引物0. 5yL下遊引物0. 5yLTaqDNA 聚合酶0· 5 μ L衣藻總 DNA1 μ L總計20 μ L反應程序為
95 0C5 min
95 "C1 min η
55 °C1 min p0 cycles
72 °C1 min30s
72 0CIOmin取4yL PCR產物上樣於1 %瓊脂糖凝膠上電泳，在衣藻轉化子中分別擴增獲得與 預期大小完全一致的片段，而在野生型衣藻中則沒有相應的條帶出現(2)葉綠體轉基因衣藻同質化程度的PCR檢測P5 GGTTTGCCGAACAATGTTTTTATTCCTGP6 :AGAGGAAAGTATTTAAAGCTGCTTATTC以轉基因衣藻DNA為模板，用LA Taq DNA聚合酶進行PCR擴增。PCR 體系ddH2011. 5μ L10XPCR buffer 2μ LIOmMdNTP4μ L上遊引物(Ρ5) 0. 5μ L下遊引物(Ρ6) 0. 5uLLATaqDNA 聚合酶 0. 5 μ L衣藻總 DNAIuL總計20 μ L反應程序為95 °C5 min
95 V1 min
50 0C2min L 30 cycles
72 °C4 min」
72 °C10 min擴增結果，經過10輪抗性加壓篩選後的獲得轉N基因的衣藻葉綠體轉化子，只擴 增出了一條4. 35kb的條帶，大小與預期結果相符，說明狂犬病毒的N基因連同aadA基因已 定點插入到衣藻葉綠體基因組中，並達到完全同質化。5. 3衣藻總蛋白的提取5. 4 Western blot 檢測結果在52kDa位置處都出現特異雜交信號條帶，而未轉基因的野生型衣藻則沒有 出現可見的信號條帶。這說明蛋白在三株衣藻轉化子的葉綠體中得到了表達，並分別具有 抗原性。5. 5 ELISA 檢測經過試驗檢測，狂犬病毒的N蛋白佔總的可溶蛋白的1.8%左右。5. 6動物免疫試驗(1)小白鼠免疫分組將上述重組的表達了 N蛋白的衣藻經超聲波破碎，離心去細 胞碎片，濃縮後製備為抗原，將收集純化的無菌抗原與等體積油佐劑混合試製注射疫苗；將 初步純化的狂犬病毒N抗原用等體積的濃度為31%脂肪酸(該脂肪酸由以下體積百分比的 各組分組成棕櫚酸7. 5%、油酸20. 0%,3. 5%硬脂酸、餘量為水)混合，經超聲波乳化後制 備成口服疫苗，經口灌注，在小白鼠上進行動物試驗。0. 5mL/只經肌肉或口服途徑各免疫小 白鼠。將60隻BALB/c小白鼠隨機分成4組，即N抗原口服組、N疫苗肌肉注射組、N抗原肌 肉注射組和陰性對照組，每組15隻小白鼠。(2)免疫反應觀察(3)小白鼠抗體測定通過抗原口服途徑免疫的小白鼠，在免疫後24h、48h和72h進行臨床反應觀察，每 組均未見小白鼠出現精神沉鬱、呼吸急促、採食減退以及死亡等現象。在試驗的整個過程 中，小白鼠均健康存活，而對照組全部發病。將N抗原口服、N疫苗肌肉注射、N抗原肌肉注射1免第1周、2免第2周、2免第 三周、2免第四周採血所分離的血清用寧波天潤生物藥業有限公司生產的動物狂犬病病毒 IgG抗體測定試劑盒檢測抗體水平，分析抗體消長規律。結果顯示，用3種不同的方式進行 免疫，在免疫後第7天未產生抗狂犬病毒N抗原的IgG抗體。N疫苗肌肉注射組，在2免後 第二周的抗體水平有所上升，其OD值可達0. 346，在2免後第3周和第4周，抗體基本維持 在同一水平，其OD值在0. 30左右。而N抗原注射組在2免後第2周、第3周、第4周時，抗 體水平仍然很低，其OD值基本0.24左右。N抗原口服組在2免後的第2周，產生的I gA抗 體達到0.27，在之後的2周，IgA抗體基本維持在0.2左右。(注陰性對照為樣品稀釋液， 陽性對照為試劑盒中提供的狂犬病陽性血清，其效價達0. 5IU/ml。) 綜上所述，利用衣藻葉綠體表達的狂犬病毒N抗原無轉基因生物安全隱患，同時，用該抗原製備的疫苗具有良好的免疫效果，可以應用於免疫後的抗體檢測、注射和口服疫
田OKLPI090967_2序列表中國農業科學院生物技術研究所利用葉綠體製備狂犬病毒抗原的方法008903PatentIn version 3. 111377DNARabies Virus1atggttcctc aggttctttt gtttgtactc cttctgggtt tttcgttgtg tttcgggaag 60ttccccattt acacgatacc agacgaactt ggtccctgga gccctattga catacaccat 120ctcagctgtc caaataacct ggttgtggag gatgaaggat gtaccaacct gtccgagttc 180tcctacatgg aactcaaagt gggatacatc tcagccatca aagtgaacgg gttcacttgc 240acaggtgttg tgacagaggc agagacctac accaactttg ttggttatgt C 3. C 3.3. C C 3. C3. oUUttcaagagaa agcatttccg ccccacccca gacgcatgta gagccgcgta taactggaag 360atggccggtg accccagata tgaagagtcc ctacacaatc cataccccga ctaccactgg 420cttcgaactg taagaaccac caaagagtcc ctcattatca tatccccaag tgtgacagat 480ttggacccat atgacaaatc ccttcactca agggtcttcc ctggcggaaa gtgctcagga 540ataacggtgt cctctaccta ctgctcaact aaccatgatt acaccatttg gatgcccgag 600aatccgagac caaggacacc ttgtgacatt tttaccaata gcagagggaa gagagcatcc 660aacgggaaca agacttgcgg ctctgtggat gaaagaggcc tgtataagtc tctaaaagga 720gcatgcaggc tcaagttatg tggagttctt ggacttagac ttatggatgg aacatgggtc 780gcgatgcaaa catcagatga gaccaaatgg tgccctccag atcagttggt gaatttgcac 840gactttcgct cagacgagat tgagcatctc gttgtggagg agttagtcaa gaaaagagag 900gaatgtctgg atgcattaga gtccatcatg accaccaagt cagtaagttt cagacgtctc 960agtcacctga gaaaacttgt cccagggttt ggaaaagcat ataccatatt1020ttgatggagg ctgatgctca ctacaagtca gtccggacct ggaatgagat catcccctca 1080aaagggtgtt tgaaagttgg aggaaggtgc catcctcatg tgaacggggt gtttttcaat 1140ggtataatat tagggcctga cgaccatgtc ctaatcccag agatgcaatc atccctcctc 1200cagcaacata tggagttgtt ggaatcttca gttatccccc tgatgcaccc cctggcagac 1260ccttctacag ttttcaaaga aggtgatgag gctgaggatt ttgttgaagt tcacctcccc 1320gatgtgtaca aacagatctc aggggttgac ctgggtctcc cgaactgggg aaagtag13772
〈211>1353.
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利用葉綠體製備狂犬病毒抗原的方法，包括(1)構建狂犬病毒抗原基因衣藻葉綠體表達載體；(2)將所構建的狂犬病毒抗原基因衣藻葉綠體表達載體轉化衣藻，篩選得到轉化有狂犬病毒抗原基因的轉基因衣藻；(3)培養轉基因衣藻，使狂犬病毒抗原基因在衣藻中表達，即得。
2.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於所述狂犬病毒抗原基因包括狂犬病病毒 抗原蛋白G基因或狂犬病病毒抗原蛋白N基因。
3.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的狂犬病毒抗原基因衣藻葉綠體表 達載體主要按照以下方法構建得到將狂犬病毒抗原基因與衣藻葉綠體特異啟動子和終止 子組合成狂犬病毒抗原基因表達盒；將狂犬病毒抗原基因表達盒與衣藻葉綠體基因組中的 同源片段進行連接，構建得到狂犬病毒抗原基因衣藻葉綠體特異表達載體。
4.按照權利要求3所述的方法，其特徵在於所述的葉綠體特異啟動子包括但不限於 atpA、atpB、psbA、psbD或rbcL ；所述的終止子為rbcL終止子。
5.按照權利要求3所述的方法，其特徵在於所述的同源片段為SEQIDNo 3所示。
6.按照權利要求1、3、4或5所述的方法，其特徵在於所述的狂犬病毒抗原基因衣藻 葉綠體表達載體還含有選擇標記基因；所述的選擇標記基因優選為細菌來源的抗菌素抗性 基因，更優選為aadA基因。
7.權利要求1-5任何一項方法所製備得到的狂犬病毒抗原。
8.權利要求7所述的狂犬病毒抗原在製備預防或檢測狂犬病中的用途。
9.一種轉化有狂犬病毒抗原N基因的轉基因衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)，其微 生物保藏號是CGMCC No. 3423。
10.一種轉化有狂犬病毒抗原G基因的轉基因衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)，其 微生物保藏號是CGMCC No. 3424。
全文摘要
本發明提供了一種利用葉綠體製備狂犬病毒抗原的方法，包括(1)構建狂犬病毒抗原基因衣藻葉綠體表達載體；(2)將所構建的表達載體轉化衣藻，篩選得到轉基因衣藻；(3)培養轉基因衣藻，使狂犬病毒抗原基因在衣藻中表達，即得。本發明方法採用衣藻葉綠體表達系統在衣藻生物反應器中安全、高效的生產狂犬病毒抗原，所表達的蛋白特異性高，具有良好的免疫效果且不會產生非目的性的免疫反應。本發明方法的成本顯著低於傳統的製備狂犬病毒抗原方法，無需投資建廠，無三廢，電力和水資源等能源消耗極少。本發明方法所製備的抗原，安全性極高，不需純化，可直接作為動物添加飼料就可起到治療的效果。
文檔編號A61P31/14GK101812468SQ200910238470
公開日2010年8月25日 申請日期2009年11月20日 優先權日2009年11月20日
發明者劉國憲, 張志芳, 李軼女, 沈桂芳, 胡英考 申請人:中國農業科學院生物技術研究所