狂犬病毒病毒樣顆粒及其製備方法

2023-09-16 12:52:20

專利名稱：狂犬病毒病毒樣顆粒及其製備方法
技術領域：
本專利涉及一種或多種狂犬病毒蛋白，利用體外重組方式表達或其他方式，形成具有一定空間結構的病毒樣顆粒。該顆粒具有狂犬病毒的重要抗原特徵，並能通過誘導T 細胞免疫及B細胞免疫產生足夠抵抗病毒攻擊的能力。該顆粒的安全性和毒株構建的方便性均優於目前正在使用的全細胞滅活狂犬病疫苗。該顆粒能廣泛用於相關多聯多價疫苗研製、狂犬病毒相應抗原抗體體外檢測及外源蛋白載體等方面。本專利還涉及一種該病毒樣顆粒的純化濃縮方式及鑑定方法。
背景技術：
病毒樣顆粒(Virus-Like Particles，VLPs)是含有某種病毒的一個或多個結構蛋白的空心顆粒，沒有病毒的核酸，不能自主複製，其在形態上與真正病毒粒子相同或相似， 可通過和病毒感染一樣的途徑呈遞給免疫細胞，有效地誘導機體的免疫系統產生免疫保護反應。狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies Virus)引起的一種人畜共患傳染病。全世界每年約有6萬人死於狂犬病。我國每年狂犬病發病人數在印度之後，居世界第二位，近幾年每年約1，000 1，200萬人接受狂犬病暴露後接種。目前本病幾乎無有效的治療辦法，只能通過接種疫苗來預防。自巴斯德首次製成狂犬病弱毒疫苗以來，世界各國不斷完善並研製出了多種安全有效的人用、獸用狂犬病疫苗。狂犬疫苗的發展經歷了神經組織(羊腦、鼠腦)滅活苗、原代細胞培養疫苗(例如雞胚、鴨胚、地鼠腎細胞培養滅活疫苗)等。由於目前的狂犬病疫苗均為滅活疫苗，其安全性存在隱患。2004年，Pasteur公司因新型狂犬疫苗 Imovax中含有活性的PM病毒，召回了若干批次產品。這又一次引起人們對狂犬疫苗為安全性問題的思考。由於VUs沒有感染性，作為免疫原，它可通過和病毒感染一樣的途徑呈遞給免疫細胞，有效地誘導機體的免疫系統產生免疫保護反應，而宿主、病毒和疫苗因素共同決定VUs產生的機體防護水平。目前活病毒疫苗的缺陷就是一旦病毒活性恢復，安全性不能保證。但VUs疫苗沒有感染性，穩定性好，不易失活，具有廣闊的發展前景。加之VLP 類似於真正病毒粒子的形態和空間結構，不僅能誘導受體產生體液免疫，也能產生細胞免疫[參見 Bryce Chacherian, Virus-like particles :Flexible platform for vaccine development. Expert Rev. Vaccines 6 (3)，381-39(^2007)]。同時,作為一種抗原的承載平臺，便於利用基因工程或化學的方法進行修飾，或結合多種抗原已形成新的聯合疫苗。這使得利用VLP作為新型疫苗的候選物有著先天的優勢。此外，利用VLP良好的抗原特性及空間構象，也可作為基因治療載體，通過插入外源蛋白表位，釋放外源蛋白而達到特異性治療的目的；或可作為抗原以檢測血清中的特異性抗體，在臨床血清學診斷中發揮重要的作用。病毒的衣殼蛋白一般具有天然的自我裝配能力。近年來發現多數病毒的衣殼蛋白基因在真核表達系統以及少數病毒的衣殼蛋白基因在原核表達系統中都能夠有效地實現自我組裝。利用各種表達系統表達多種病毒重組結構蛋白，利用結構蛋白的自組裝特性形成病毒樣顆粒的方法已在多種病毒上成功實現，並同時表現出很好的保護性。例如人和動物的免疫缺陷病毒、流感病毒、人乳頭狀瘤病毒、麻疹病毒、B型肝炎病毒和漢坦病毒等。通過表達形成的病毒樣顆粒，顆粒大小一般在20 150nm之間。Sang-Moo Kang等人利用Hmi株流感病毒HA和Ml蛋白同時表達，形成的VLP免疫小鼠後，不僅能保護A/ PR8/34 (HlNl)的攻擊，同時也具有對A/WSN/33 (HlNl)野毒株的攻擊[參見Fu-Shi Quan, Chunzi Huang, Richard W. Compans, and Sang—Moo Kang. Virus-Like Particle Vaccine Induces Protective Immunity against Homologous and Heterologous Strains of Influenza Virus. JOURNAL OF VIROLOGY. 2007,81(7) :3514-3524]。同樣 H3N2 和 H9N2 的VLP在此之前也相繼被構建並表現出很好的保護性[參見Galarza，J. Μ.，Τ. Latham, and A. Cupo. 2005. Virus-like particle (VLP) vaccine conferred complete protection against a lethal influenza virus challenge. Viral Immunol. 18 :244-251.及Pushko, P. , Τ. Μ. Tumpey, F. Bu, J. Knell, R. Robinson, and G. Smith. 2005. Influenza virus-like particles comprised of the HA, NA, and Mlproteins of H9N2influenza virus induce protective immune responses in BALB/cmice. Vaccine 23:5751-5759·]。2006 年 Merck 公司研製的 HPV6、11、16、18 四價 VLP Gardasil 疫苗獲得美國 FDA 許可且開始投放市場。這為VLP的研製與應用帶來了希望。匹茲堡大學疫苗研究中心的 Ted Ross博士在2009年109屆美國微生物年會上展示的數據表示，構建的流感VLP在免疫原性和免疫持久性上均優於現有疫苗。80年代以來，基於安全性的考慮，人們陸續對狂犬病毒的亞單位狂犬疫苗和重組疫苗產生重視。Wistar研究所的mmner在對純化的G蛋白研究後，說明了 Gs (可溶性G蛋白)和G蛋白之間存在58個AA的丟失帶來15倍的抗原性的降低。同時，限於當時的技術水平，E. Coli表達的重組G蛋白由於產量和糖基化的原因，不能達到有效的保護 [參見 WILLIAM H. WUNNER, et al. Rabies Subunit Vaccines. J. gen. Virol. (1983)，64， 1649-1656. ]。1989年I^rehaud利用杆狀病毒表達CVS株中的G蛋白，感染4 後G表達量最高，2X IO9感染的Sf8細胞能產生Mmg G蛋白。12 120 μ g(大約IO6 IO7細胞)免疫小鼠14天後，能抵抗104LD50CVS的攻擊(藥典3部上疫苗的效價測定是100LD50CVS)。 低劑量的檢測中，12ng(大約103細胞)也能抵抗CVS攻擊，10 100細胞能推遲小鼠死亡時 |、司[參見 Christophe Prehaud, et al. Immunogenic and protective properties of rabies virus glycoprotein expressed by baculovirus vectors. VIROLOGY,173, 390-399(1998).]。1992年，Pasteur研究所的Tordo利用杆狀病毒表達狂犬病毒屬的 Mokola病毒G蛋白，106Sf9細胞中能表達至少3. 2yg的G蛋白，而5X104細胞(大約 160ng)G 蛋白能起到保護作用[參見 Noel Tordo, et al. Structure and expression in baculovirus of Mokola virus glycoprotein :An efficient recombinant vaccine. Virology，194,59-69(1993).]。1991年，傅振芳在杆狀病毒中表達了 N蛋白。其表達N 蛋白的目的是G蛋白屬膜蛋白，難以純化，且純化時需要加入對人體不利的去汙劑成分 (Triton)。同時，利用成本低廉的N蛋白作為初免，有可能作為暴露前預防的備選。2X108 細胞能產生大約5mg的N蛋白。加上完全弗式佐劑，能產生高於純化RNP的免疫效果。但此文章中未出現和G蛋白的比較以及小鼠攻擊實驗[參見Z. F. Fu，et al. Rabies virusnucleoprotein expression in and purified from insect cells is efficacious as a vaccine. PNAS，88，2001-2005 (1991) · ]。1999 年而 Pasteur 研究所的 Perrin 對 G 蛋白和 N蛋白的免疫原性進行了比較，並明確的指出N蛋白僅僅增加中和抗體的產生，而並不能單獨的刺激機體產生中和抗體。Perrin同樣利用昆蟲病毒表達G和N。在106細胞中，上清表達約5yg G蛋白，而沉澱中回收2. 9yg G蛋白。上清中的蛋白400ng免疫小鼠14天後， RFFIT檢測中和抗體3. 2IU(雖然明顯低於1 μ g的滅活疫苗產生的中和抗體22. 6IU)[參見 Pierre Perrin, et al. Is there an advantage to including the nucleoprotein in a rabies glycoprotein subunit vaccine ？ Vaccine,17(1999),1549-1557.]。利用痘苗病毒或者腺病毒作為載體也取得了很大的突破。扈連良利用偽狂犬病毒作為載體，表達狂犬病毒G蛋白，但免疫效果與滅活疫苗相差明顯。最近，Pasteur研究所與巴西Butantan研究所合作，開展了生產級的果蠅細胞表達G蛋白的工作，目前發表的文章是70 640ng/ml的產量並能以IOOng左右的免疫達到80%對CVS攻擊的保護。傳統的狂犬病毒亞單位疫苗說考慮的僅是能表達具有刺激機體產生中和抗體的G 蛋白的表達，而對表達G蛋白的空間構象和如何形成更具免疫保護效力空間結構的研究極度缺乏。截至目前為止，尚無研究機構發表體外重組表達狂犬病毒病毒樣顆粒的相關研究。

發明內容
本發明的任務是提供一種狂犬病毒病毒樣顆粒，該狂犬病毒病毒樣顆粒具備穩定均一的空間結構，其外膜蛋白包含狂犬病毒糖蛋白，能誘導機體產生具有保護性水平的細胞免疫及體液免疫。該病毒樣顆粒不含任何狂犬病毒染色體核酸成分，避免了可能因加入滅活劑引入的質量風險，該病毒樣顆粒能利用現有的純化技術方便進行純化。實現本發明的技術方案是本發明提供的這種狂犬病毒病毒樣顆粒，包括但不限於狂犬病毒糖蛋白(G)和狂犬病毒基質蛋白(M)，其中狂犬病毒糖蛋白(G)和狂犬病基質蛋白(M)可來源於重組蛋白或利用狂犬病毒培養液所裂解、分離、純化方法得到，所述的重組蛋白可以是利用原核表達系統或真核的表達系統表達的重組蛋白。狂犬病毒糖蛋白(G)和狂犬病基質蛋白(M)的核酸或蛋白序列來源狂犬病毒CVS株、aG株、CTN株、PV株或其他能實現形成顆粒組裝及狂犬病毒保護能力的其他狂犬病毒毒株。典型的CVS序列可參見GenBank中序列，GQGQ918139. 1。 其中M96-3104bp為M蛋白編碼序列，3320-4894bp為G蛋白編碼序列。發明提供的這種狂犬病毒病毒樣顆粒還可以有脂質雙層膜。本發明提供的狂犬病毒病毒樣顆粒加上輔助配方可製成藥用組合物，所述的輔助配方可以是保護劑、穩定劑、佐劑及相應溶劑。本發明提供的這種狂犬病毒病毒樣顆粒可以按以下步驟製備步驟一狂犬病毒M蛋白及G蛋白的獲得及克隆，構建重組杆狀質粒pFD_MG ；步驟二 利用重組杆狀質粒pFD-MG構建重組杆狀病毒rV_MG ；步驟三利用重組杆狀病毒rV_MG製備狂犬病毒病毒樣顆粒。本發明實施例提供了製備本發明提供的這種狂犬病毒病毒樣顆粒的具體方法。本發明中實施例1利用杆狀病毒表達系統表達重組狂犬病毒G蛋白和M蛋白，利用其特性自主裝配，形成具有均一空間結構的病毒樣顆粒。因其的特性，該病毒樣顆粒兼具亞單位和重組疫苗的安全性和狂犬病毒顆粒誘導T細胞免疫及B細胞免疫的高效性的同時，避免傳統全細胞滅活疫苗中的可能潛在質量風險。本發明提供的狂犬病毒病毒樣顆粒具備穩定均一的空間結構，其外膜蛋白包含狂犬病毒糖蛋白，能誘導機體產生具有保護性水平的細胞免疫及體液免疫。該病毒樣顆粒不含任何狂犬病毒染色體核酸成分，避免了可能因加入滅活劑引入的質量風險。該病毒樣顆粒能利用現有的純化技術方便進行純化。本發明從原理上規避了傳統滅活疫苗可能存在的因加入滅活劑引入的質量風險。 同時，由於其簡單快速的構建、製備方式，能更方便快速的設計製造針對新出現毒株的新型疫苗。並且，基於本發明的原理，易於在該顆粒基礎上逐漸多聯、多價新型疫苗。鑑於該顆粒的特質，能廣泛的替代現有的諸如相關抗原抗體檢測、功能蛋白載體等大量實用技術中的相關關鍵原材料。


圖1是狂犬病毒基因組結構示意圖，圖中線段表示狂犬病毒基因組，空心箭頭表示基因組中基因成分。如圖可見，狂犬病毒基因組由5個基因構成，全長約121Λ，基因組長約121Λ，從3'到5'端依次為編碼N、P、M、G、L蛋白的5個基因，各個基因間還含非編碼的間隔序列。其中N蛋白編碼核糖核蛋白；P基因編碼的磷酸化蛋白；M蛋白編碼基質蛋白；G 基因編碼糖蛋白，L蛋白編碼依賴RNA的RNA聚合酶。圖2是狂犬病毒結構切面模式示意圖，其中數字標識1為膜外糖蛋白G，2為基質蛋白M，3為脂質雙層膜，4為病毒基因組。如圖所示，病毒外形呈彈狀，一端純園，一端平凹， 有囊膜，內含核衣殼呈螺旋對稱。G基因編碼的G蛋白是構成病毒表面刺突糖蛋白，具有凝集紅細胞的特性，是狂犬病病毒與細胞受體結合的結構，在狂犬病病毒致病與免疫中起著關鍵作用；M蛋白編碼基質蛋白，參與形成包膜結構。圖3是本發明狂犬病毒病毒樣顆粒切面結構示意圖，其中數字標識1為膜外糖蛋白G，2為基質蛋白M，3為脂質雙層膜。不同於上述圖2所示天然狂犬病毒結構，狂犬病毒病毒樣顆粒因不包含病毒基因組成分，坍塌為中空球形。圖4是實施例1中重組杆狀病毒質粒pFD-M的構建策略圖。如圖所示，狂犬病毒 M基因通過RT-PCR和TA克隆過程，形成重組TA克隆質粒pMD_M。然後通過酶切、連接、轉化等亞克隆方法，形成重組杆狀病毒質粒pFD_M。圖中重組杆狀病毒質粒pMD_M質粒中Amp 為氨苄青黴素抗性基因，Rv-M表示來源於狂犬病毒的M基因，Kpn I標識的是Kpn I酶切位點。重組杆狀病毒質粒pFD_M質粒中fl表示質粒複製原點，Amp表示氨苄青黴素抗性基因， Gen標識慶大黴素抗性基因，Rv-M表示來源於狂犬病毒的M基因，pPIO表示杆狀病毒pPIO 基因啟動子，HSV表示單純皰疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus-thymidine kinase. HSV-tk)基因終止子。Tn7L與Tn7R表示細菌Tn7轉座子轉座位點，該位點的存在促進質粒與Bacmid發生同源重組便於在杆狀病毒中引入重組基因。Kpn I所示為Kpn I酶切位點。圖5是實施例1中重組杆狀病毒質粒pFD_G構建策略圖，如圖所示，狂犬病毒G基因通過RT-PCR和TA克隆過程，形成重組TA克隆質粒pMD_G。然後通過酶切、連接、轉化等亞克隆方法，形成重組杆狀病毒質粒pFD_G。圖中重組TA克隆質粒pMD_G中Amp為氨苄青黴素抗性基因，Rv-G表示來源於狂犬病毒的G基因，Hind III標識的是Hind III酶切位
6點，Spe I標識的是Spe I酶切位點。重組杆狀病毒質粒pFD_G中Π表示質粒複製原點， Amp表示氨苄青黴素抗性基因，Gen標識慶大黴素抗性基因，Rv-G表示來源於狂犬病毒的G 基因，PPH表示ρΡΗ多角體啟動子，SV40表示猿猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40，SV40)基因終止子，Tn7L與表示Tn7轉座位點，該位點的存在促進質粒與Bacmid 發生同源重組便於在杆狀病毒中引入重組基因。Hind III標識的是Hind III酶切位點， Spe I標識的是Spe I酶切位點。圖6是實施例1中重組杆狀病毒質粒pFD_MG構建策略圖。如圖所示，通過酶切、 連接、轉化等亞克隆方法，將重組TA克隆質粒pMD_M中的狂犬病毒M基因亞克隆至重組杆狀病毒質粒pFD_G中的相應位置。其中組TA克隆質粒pMD_M中Amp為氨苄青黴素抗性基因，Rv-M表示來源於狂犬病毒的M基因，Kpn I標識的是Kpn I酶切位點。重組杆狀病毒質粒pFD_G中fl表示質粒複製原點，Amp表示氨苄青黴素抗性基因，Gen標識慶大黴素抗性基因，Rv-G表示來源於狂犬病毒的G基因，ρΡΗ表示ρΡΗ多角體啟動子，SV40表示猿猴空泡病毒 40(Simian vacuolating virus 40，SV40)基因終止子，Tn7L 與 Tn7R 表示 Tn7 轉座位點， 該位點的存在促進質粒與Bacmid發生同源重組便於在杆狀病毒中引入重組基因。HindIII 標識的是HindIII酶切位點，Spe I標識的是Spe I酶切位點。pFD_MG質粒中fl表示質粒複製原點，Amp表示氨苄青黴素抗性基因，Gen標識慶大黴素抗性基因，Rv-M表示來源於狂犬病毒的M基因，Rv-G表示來源於狂犬病毒的G基因，pPIO表示杆狀病毒pPIO基因啟動 ψ, HSV ^Tr^itM^'^n^MWllkM (herpes simplex virus-thymidine kinase. HSV-tk) 基因終止子，pPH表示ρΡΗ多角體啟動子，SV40表示猿猴空泡病毒40 (Simian vacuolating virus 40，SV40)基因終止子，Tn7L與表示Tn7轉座位點，該位點的存在促進質粒與 Bacmid發生同源重組便於在杆狀病毒中引入重組基因，Knp I標識的是Kpn I酶切位點， Hind III標識的是HindIII酶切位點，Spe I標識的是Spe I酶切位點。圖7是實施例1中重組TA克隆質粒pMD_M及pMD_G瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中，泳道1為DNA分子量標記，泳道2為重組TA克隆質粒pMD_G，泳道3為重組TA克隆質粒pMD_ G經HindIII和Spe I雙酶切後產物，泳道4為重組TA克隆質粒pMD_M，泳道5為重組TA 克隆質粒pMD_M經Kpn I酶切後產物。如圖所示，重組TA克隆質粒pMD_M及重組TA克隆質粒pMD_G均在理論位置有明顯條帶。重組TA克隆質粒？1 _6經見11(1 III和Spe I雙酶切後出現2. 6kb及1. 5kb兩條條帶，與原始質粒及狂犬病毒M蛋白大小一致。PMD_M經Kpn I酶切後產生2. 6kb及0. 6kb兩條條帶，與原始質粒及狂犬病毒M蛋白大小一致。此圖說明按照實施例1的步驟和圖3 4所述的策略，重組TA克隆質粒pMD_G及 pMD_M的構建與預期一致。圖8是實施例1中重組杆狀病毒質粒pFD_M、pFD_G和pMD_MG瓊脂糖凝膠電泳圖。 圖中泳道1為DNA分子量標記，泳道2為重組杆狀病毒質粒pFD_MG，泳道3為重組杆狀病毒質粒pFD_MG經HindIII和Spe I雙酶切後產物，泳道4為重組杆狀病毒質粒pFD_MG經 Kpn I酶切後產物，泳道5為重組杆狀病毒質粒pFD_G，泳道6為重組杆狀病毒質粒pFD_G 經HindIII和Spe I雙酶切後產物，泳道7為重組杆狀病毒質粒pFD_M，泳道8為重組杆狀病毒質粒pFD_M經Kpn I酶切後產物。如圖所示，重組杆狀病毒質粒pFD_M、pFD_G和pFD_ MG質粒均在理論大小位置有明顯條帶，重組杆狀病毒質粒pFD_MG和pFD_G在經過Hind III 和Spe I雙酶切後，形成兩條明顯條帶，條帶位置與空載體及狂犬病毒G基因大小一致。重組杆狀病毒質粒pFD_MG和pFD_M經Kpn I酶切後形成明顯兩條帶，條帶大小與空載體及狂
犬病毒M基因大小一致。上述凝膠電泳圖表明根據實施例1的步驟和圖3 5所述的策略，重組杆狀病毒質粒pFD_M、pFD_G和pMD_MG構建與預期一致。圖9是實施例1中重組杆狀病毒質粒pFD_M、pFD_G和pMD_MG PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1為DNA分子量標記，泳道2為重組杆狀病毒質粒pFD_MG PCR反應後產物，泳道3為重組杆狀病毒質粒pFD_G PCR反應後產物，泳道4為重組杆狀病毒質粒pFD_ M PCR反應後產物。G和M所示為狂犬病毒G基因和M基因理論位置。如圖所示，重組杆狀病毒質粒pFD_MG經PCR反應後，出現兩條明顯電泳帶，分別與狂犬病毒G基因及狂犬病毒 M基因大小一致；重組杆狀病毒質粒pFD_G和pFD_M經PCR反應後，均只有單一條帶，分別與狂犬病毒G基因及狂犬病毒M基因大小一致。上述PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果證實狂犬病毒G基因及狂犬病毒M基因按照圖 3 5的策略重組至重組杆狀病毒質粒pFD_M、pFD_G和pMD_MG。圖10是按照實施例3進行濃縮、純化後，本發明狂犬病毒病毒樣顆粒的掃描電鏡圖，圖中標尺中每一小格表示lOOnm。如圖所示，在經過濃縮、純化後，能形成形態、大小均一的具有一定空間結構的顆粒，顆粒中間由於不含任何核酸成分，形成空洞，因此在經過負染後，顯示黑色。而顆粒表面有顯示明顯蛋白聚集。圖11是實施例4中，狂犬病毒G蛋白夾心法ELISA檢測工作曲線，圖中，縱坐標表示檢測450吸光度的檢測結果，橫坐標表示標準樣品不同稀釋度的理論IU值。由圖可見隨著標準樣品的IU值的增加，ELISA檢測的450nm吸光度也相應增加。 利用一定的非線性回歸的方法，能根據工作曲線對平行試驗樣本檢測的450nm吸光度回歸相應的IU值。由於此方法利用抗狂犬病毒G蛋白的單克隆抗體進行板條的包埋，因此利用此種方法檢測狂犬病毒G蛋白具有極高的敏感性和特異性。圖12是按照實施例4中所述方法，本發明狂犬病毒病毒樣顆粒免疫小鼠後並經標準攻擊毒株(CVQ攻擊後存活率與傳統滅活疫苗、重組G蛋白、空白對照的比較。圖中，不同線段表示不同天數後小鼠存活率的變化。」 *」和」 **」表示統計學上的差異。如圖所示， 空白對照組10隻小鼠在10天後發病全部死亡。這說明如無外源免疫原接種，小鼠不能抵抗CVS毒株的攻擊。傳統滅活疫苗在觀察14天後無死亡，說明在傳統疫苗接種後能產生保護性抗體。病毒樣顆粒和重組G蛋白免疫後在觀察14天後，也能產生一定的保護，死亡小鼠分別為1隻及2隻，均在國家規定的80%保護率範圍內。從統計學分析結構來說，傳統滅活疫苗、病毒樣顆粒和重組G蛋白均與空白對照有明顯顯著差異(P <0.01)，但之間沒有統計學差異。儘管如此，從本實驗保護率上，本發明狂犬病毒病毒樣顆粒免疫保護力優於重組 G蛋白。圖13為按照實施例4中方法，本發明狂犬病毒病毒樣顆粒免疫兩次後，中和抗體生成情況與傳統滅活疫苗、重組G蛋白及空白對照的比較。圖中縱坐標為血清中和抗體的幾何平均滴度，橫坐標為檢測時間。不同的線段表示不同的免疫原。根據WHO建議，保護性水平為0. 5IU。免疫原在0周初免，1周進行加強。如圖所示，傳統滅活疫苗、本發明狂犬病毒病毒樣顆粒和重組G蛋白均在免疫後刺激小鼠產生一定的具有保護性的中和抗體。而空白對照無法產生高於保護性水平的中和抗體。同時，根據圖中所示結果，本發明狂犬病毒病毒樣顆粒免疫後生成保護性中和抗體滴度與傳統滅活疫苗接近，且遠高於重組G蛋白免疫後產生的中和抗體。這與上述圖11 12 中攻擊實驗結果一致。也同時說明本發明狂犬病毒病毒樣顆粒作為疫苗備選物所產生的保護性功能與傳統滅活疫苗基本一致，而遠高於重組G蛋白。圖14是按照實施例4中方法，本發明狂犬病毒病毒樣顆粒免疫小鼠後，CD4+和 ⑶8+T細胞生成情況與傳統滅活疫苗、重組G蛋白及空白對照的比較。圖中縱坐標表示檢測的細胞比例，橫坐標分為3組，分別是⑶4+T細胞、⑶8+T細胞和⑶4+T細胞與⑶8+T細胞的比例。不同的免疫原以不同的柱表示。如圖所示，傳統滅活疫苗組和本發明狂犬病毒病毒樣顆粒組在免疫後，刺激機體產生的CD4+T細胞的數量遠高於陰性對照組和重組G蛋白組，並且在統計學上存在明顯顯著差異(P <0.001，圖中以「**」表示)和明顯差異(P < 0. 05,圖中以「*」表示)。在刺激小鼠產生⑶8+T細胞上，上述4種不同類別的免疫原雖沒有統計學差異，但傳統滅活疫苗組和本發明狂犬病毒病毒樣顆粒組也高於陰性對照組和重組G蛋白組。一般認為，CD4+T細胞數量的增加反應小鼠在免疫原刺激後體液免疫反應水平，而CD8+T細胞數量的增加反應小鼠在免疫原刺激後細胞免疫反應水平。因此傳統滅活疫苗組和本發明狂犬病毒病毒樣顆粒組均能在免疫小鼠後，產生高的體液免疫反應，同時也能產生一定的細胞免疫反應。
具體實施例方式下面結合實施例描述本發明。實施例1重組狂犬病毒M蛋白及G蛋白的獲得及克隆1.狂犬病毒CVS病毒株RNA提取1)預配製試劑a)含carrier RNA的緩衝液AVE的配製將310 μ 1緩衝液AVE加入裝有310 μ g carrier RNA的小管中，得到濃度為1 μ g/μ 1的溶液。b)緩衝液AWl的配製向未使用的緩衝液AWl (19ml)中加入25ml乙醇 (96-100% )，使其終體積到達44ml。c)緩衝液AW2的配製向未使用的緩衝液AW2 (13ml)中加入30ml乙醇 (96-100% )，使其終體積到達43ml ；2)取 1. 5ml Ep 管，加入 554. 4 μ 1 緩衝液 AVL 及 5. 6 μ 1 含 carrier RNA 的緩衝液 AVE,混勻。3)向Ep管中加入150 μ ICVS病毒液，振蕩混勻15s，室溫靜置lOmin。4)短暫離心去除掛壁水珠。5)向Ep管中加入560 μ 1乙醇(96-100% )，振蕩混勻15s，短暫離心去除掛壁水珠。6)加630 μ 1液體到帶2ml套管的spin column中，室溫8000 rpm Imin,棄除液體。7)將剩餘的630 μ 1液體加入上述帶2ml套管的spin column中，室溫8000 rpm lmin，棄除液體並置換新的套管。8)向spin column中加入500 μ 1緩衝液AWl，室溫8000 rpm lmin，棄除液體並置換新的套管。9)向 spin column 中加入 500 μ 1 緩衝液 AW2，室溫 14000 rpm 3min，棄除液體。10)再次室溫14000 rpm Imin以確保液體去除乾淨。11)將spin column置於1. 5ml Ep管中，向其中加入40 μ 1緩衝液AVE，室溫靜置Imin後8000rpm lmin，取出液體再次加入spin column中，室溫靜置Imin後8000 rpm lmin。12)取離心溶液，加入0. 5 μ IRNA酶抑制劑，_20°C凍存備用。2.狂犬病毒RNA的逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)1)取PCR管，加入提取15 μ 1 RNA及2μ 1逆轉錄通用引物(10μΜ)，72 5min後 10°C 5min,以破壞RNA 二級結構。2)配製逆轉錄反應體系，總體積25 μ 1，如下5XReaction Buffer 5μ 1dNTP Mixture(IOmM) 1 μ 1AMV Reverse Transcriptase 1 μ 1RNasin Ribonuclease Inhibitor 1 μ 1補去離子水至 25 μ 13)逆轉錄反應程序如下42°C lh,95°C 5min，4°C 5min ；4)取另三個PCR管，配製PCR反應體系，總體積50 μ 1，組成如下IOXBuffer 5 μ 1dNTP Mixture (2. 5mM) 5 μ 1上遊引物(10μΜ)2μ1下遊引物(10μΜ)2μ1cDNA 模板 3 μ 1Pfu DNA Polymerase 0. 5 μ 1補去離子水至50 μ 1G 蛋白特異性上遊引物ataac tagta tggtt cctca ggttc ttttgG 蛋白特異性下遊弓I物tacaa gcttt aacag tctgat ctcac ctccM 蛋白特異性上遊引物atagg tacca tgaac gttct acgca agatM 蛋白特異性下遊引物:tacgg tacct tattc tagaa gcaga gaga5)PCR 反應程序如下95°C 5min，循環 30 次(95 °C 30s, 57 °C 30s, 72 °C 4min)， 72°C 10min,4°C IOmin06)1%瓊脂糖凝膠電泳a)稱取一定量瓊脂糖，加入適量TAE緩衝液，放入微波爐中加熱溶解，配成濃度的瓊脂糖凝膠。b)按每100ml凝膠加入5 μ 1 Gold View染料，向瓊脂糖凝膠中加入相應體積Gold View。c)待瓊脂糖凝膠冷卻至不燙手(60°C左右)，倒入模具內。d)待瓊脂糖完全凝固，拔出模具中的齒槽，置入含TAE緩衝液的電泳槽中，加入樣品(1μ 1 5Χ上樣緩衝液+5μ 1樣本)，接通電源，設置恆定電壓120V，電泳時間約40min。
e)電泳完畢後，ImageQuant 300凝膠成像系統紫外檢測結果。3. G和M目的片段的T-A克隆3.1凝膠回收PCR產物1)用鋒利的刀片切下G和M目的條帶，儘量減少凝膠的尺寸，棄除多餘的凝膠。2)在無色的Ep管中稱量膠，1質量的膠加3體積的QG緩衝液，如IOOmg凝膠加入 300 μ IQG緩衝液。3) 50°C孵育IOmin (直到見膠溶解)促使溶解可每2_;3min震搖管。4)膠完全溶解後，檢查混合物的顏色是否為黃色，(類似與QG Buffer)若其為橘色或紫色，加10μ 1的3Μ sodium acetate ph5. 0混合直至變黃。5)將QIAquick柱於2ml的收集管中6)加樣本於QIAquick柱，離心lmin。柱能裝的最大體積為800 μ 1，對於> 800 μ 1
的可再次裝柱再次離心。7)棄透過液，QIAquick柱可放回原收集管。8)力口 0. 5ml 的 QG Buffer 到 QIAquick 柱並離心 lmin。9)洗脫加0. 75ml的PE Buffer到QIAquick柱，離心lmin。因為DNA產物將用於鹽敏感的實驗粘端連接，因此在離心之前將柱平衡2-5min。10)棄除透過液，並再次離心QIAquick柱lmin，殘留的乙醇(來自PE Buffer)將不能被清除乾淨，除非在離心之前的透液已清除乾淨。11)將QIAquick柱放在1. 5ml的離心管。12) DNA回收為了提高DNA的濃度，可加30 μ 1的蒸餾水於QIAquick柱膜的中心， 平衡lmin，離心lmin。為保證DNA的有效洗脫，如果用水，則水的PH應在7. 0-8. 5之間。13)純化的G禾Π M的DNA保存於_20°C備用。3. 2 平端 G 和 M PCR 產物加 A-Tai 1 ing1)平端G禾口 M的PCR純化產物2yg力口入1μ 1 TaqDNA聚合酶IOXBuffer(含 MgCl2)，並加入dATP至終濃度0. 2mM ；2)加入5個單位TaqDNA聚合酶，加入去離子水至終體積為10 μ 1 ；3)70°C孵育 30min ；4)加尾產物可用於後續的連接反應或保存於-20°C備用。3. 3G和M片段的TA克隆1)短暫離心pMD18-T Simple載體，純化並加A尾的G和M片段及DNA插入對照管，使內容物匯集到管底。2)充分混勻各種成分，目的片段載體的摩爾比按3 1進行連接。3)如下體系連接反應
標準反應陽性對照T4DNA連接酶緩衝液5μ 15μ 1PMD18-T 載體(50ng)1μ 11μ 1PCR產物(G和M)3μ 1-插入DNA對照-2μ 1T4DNA連接酶1μ 11μ 1補加去離子水10 μ 110 μ 1
4)短暫離心使連接反應混勻後，16°C連接16-1他。3. 4 轉化1)將含AMP的LB平板及SOC培養基平衡至室溫。2)離心使連接反應內容物匯集到管底，取2μ 1連接反應產物加到置於冰上的 1. 5mlEp管中，向另一置於冰上的1. 5mlEp管加入未酶切的質粒以測定感受態細胞的連接效率。3)將凍存的T0P10高感受態細胞從_70°C冰箱中取出，置於冰上至融化，輕輕震蕩離心管使之混勻。4)向步驟2中每個Ep管中加入50 μ 1高感受態細胞。5)輕輕震蕩Ep管混勻，冰浴30min。6)在精確的42°C水浴中熱擊60s (不要震動)。7)迅速將管移到冰浴中，使細胞冷卻anin。8)每管連接反應轉化細胞中加入平衡至室溫的950 μ ISOC培養基，而轉化未酶切的質粒的細胞中加入900 μ ISOC培養基。9)在 37°C震蕩培養 150rpm 1. 5h。10)將每個轉化的培養基100 μ 1塗到LB/AMP/IPTG/X-GAL平板上。11)將平板於 370C 12-16h 培養。4.質粒提取1)分別挑取G和M質粒轉化平板上的單菌落各6-8個並分別加入至6ml LB+AMP 液體培養基中，37°C恆溫搖床中200rpm培養12 16h ；取細菌培養液於1. 5ml Ep管中， IOOOOg離心lmin，棄上清，並倒立用吸水紙吸盡菌液；2)以250 μ 1 Buffer Pl重懸細菌並轉移到離心管中(保證RNase A已加到Buffer P1，重懸沉澱時未見明顯細菌凝塊，若IyseBlue到Buffer P1，用之前搖勻保證其混勻，細菌應該震蕩或用吸管上下吹打混勻)；3)加Buffer P2到離心管中，通過上下倒置試管4_6次(通過上下倒置混勻而非震蕩，震蕩導致DNA的剪切，也可上下倒置直到溶液變粘，較清，但此過程不要超過5min。如果IyseBlue到Buffer Pl中，在加Buffer P2後會發現細胞上清會變蘭，混勻也為類似的顏色，如果上清中有部分仍為無色或仍可見細菌團塊，繼續混勻直到可見同樣的顏色)；4)加350 μ 1 Buffer N3並通過倒置試管4_6次混勻(為避免局部沉澱，在加 Buffer N3後立即混勻，若大於5ml的菌液則需要顛倒10次，此時溶液為渾濁雲霧狀。如果 IyseBlue到Buffer Pl則溶液由藍色變為無色，無色指示SDS已被有效沉澱)；5)離心 IOmin 13000rpm(17900g)可見白色的團塊；6)取上述上清於QIApr印column中，離心30_60s棄透過液；7)加 Buffer PE 並離心 30_60s ；8)棄透過液並再次離心lmin，除去殘餘洗脫液；9)置QIApr印column於乾淨的1. 5ml的Ep管中，為洗脫DNA力Π 50 μ 1去離子水於QIApr印column的中心，靜置lmin，離心lmin，收集洗脫液，凍存於_20°C備用。5.重組質粒pMD-G和pMD-M的酶切鑑定酶切體系如下
權利要求
1.一種狂犬病毒病毒樣顆粒，包括但不限於狂犬病毒糖蛋白G和狂犬病毒基質蛋白M。
2.根據權利要求1所述的犬病毒病毒樣顆粒，其特徵在於還有脂質雙層膜。
3.根據權利要求1或2所述的狂犬病毒病毒樣顆粒，其特徵在於，所述的狂犬病毒糖蛋白G和狂犬病基質蛋白M來源於重組蛋白或利用狂犬病毒培養液所裂解、分離、純化方法得到。
4.根據權利要求3所述的狂犬病毒病毒樣顆粒，其特徵在於，所述的重組蛋白是利用原核表達系統或真核的表達系統表達的重組蛋白。
5.根據權利要求1所述的狂犬病毒病毒樣顆粒，其特徵在於，狂犬病毒糖蛋白G和狂犬病基質蛋白M的核酸或蛋白序列來源狂犬病毒CVS株、aG株、CTN株、PV株或其他能實現形成顆粒組裝及狂犬病毒保護能力的其他狂犬病毒毒株。
6.一種藥用組合物，包由權利要求1所述狂犬病毒病毒樣顆粒和輔助配方組成，所述的輔助配方是可以是保護劑、穩定劑或佐劑。
7.—種狂犬病毒病毒樣顆粒的製備方法，包括以下步驟步驟一狂犬病毒M蛋白及G蛋白的獲得及克隆，構建重組杆狀質粒pFD_MG ；步驟二 利用重組杆狀質粒PFD-MG構建重組杆狀病毒rV_MG ；步驟三利用重組杆狀病毒rV_MG製備狂犬病毒病毒樣顆粒。
全文摘要
本發明提供了一種狂犬病毒病毒樣顆粒，由狂犬病毒糖蛋白G和狂犬病毒基質蛋白M構成，具備穩定均一的空間結構，其外膜蛋白包含狂犬病毒糖蛋白全部或部分片段，能誘導機體產生具有保護性水平的細胞免疫及體液免疫。其內不含任何狂犬病毒染色體核酸成分，無添加入滅活劑引入的質量風險。該病毒樣顆粒能利用現有的純化技術方便進行純化，從原理上規避了傳統滅活疫苗可能因加入滅活劑引入的質量風險。同時，由於其簡單快速的構建、製備方式，能更方便快速的設計製造針對新出現毒株的新型疫苗。基於本發明原理，易於在該顆粒基礎上形成多聯、多價新型疫苗，能廣泛的替代現有的諸如相關抗原抗體檢測、功能蛋白載體等大量實用技術中的相關關鍵原材料。
文檔編號C12N7/01GK102533680SQ20111017174
公開日2012年7月4日 申請日期2011年6月24日 優先權日2011年6月24日
發明者劉雄, 吳傑, 喻剛, 夏志武, 施金蓉, 楊曉明, 段凱, 胡迪超, 邱阿明, 黃曉媛 申請人:武漢生物製品研究所有限責任公司