單個核細胞人白細胞抗原a或b檢測移植病人免疫狀態的方法

2023-09-16 09:18:25

專利名稱：單個核細胞人白細胞抗原a或b檢測移植病人免疫狀態的方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學、免疫學檢測方法，特別涉及單個核細胞人白細胞抗原A或B檢測移植病人免疫狀態的方法。
背景技術：
隨著醫學領域科學技術的進步，能夠移植的臟器不斷增加，隨之進行臟器移植的病人越來越多。臟器移植病人的免疫狀態決定移植的成功與否及合併症是否發生，當病人出現排斥反應時應能及時處理，否則易導致移植失敗，藥物用量過小不能達到控制排斥反應的目的，如果藥物用量過大，則易使免疫抑制過度，細菌病毒感染，腫瘤發生。而目前尚未有能夠準確檢測臟器移植病人免疫狀態的任何方法，因此，臟器移植的病人所有抗免疫抗排斥的用藥量，均是根據估值或經驗確定，無法根據病人的自身情況準確確定用藥量。在目前這種狀態下，直接影響臟器移植的成功率、移植後病人的壽命及病人身體的健康狀況等。

發明內容
本發明的目的是提供一種單個核細胞人白細胞抗原A或B檢測移植病人免疫狀態的方法，它可以通過檢測臟器移植病人的外周血單個核細胞人白細胞抗原A或B的信使核糖核酸表達強度，以達到根據該強度的高低，確定病人用藥量，以此提高臟器移植的成功率及病人的身體健康狀況等。
本發明為實現上述目的，通過以下技術方案來實現單個核細胞人白細胞抗原A或B檢測移植病人免疫狀態的方法，取臟器移植病人外周血，分離淋巴細胞，提取淋巴細胞總模板核糖核酸，對外周血淋巴細胞總模板核糖核酸進行鑑定，對人白細胞抗原A或人白細胞抗原B特異性引物進行篩選得出人白細胞抗原A的上遊引物5』-CTACCCTGCGGAGATCAC-3』，下遊引物5』-AGAGAACCAGGCCAGCAAT-3』，或人白細胞抗原B的上遊引物5』-CACACTGACCTGGCAGCGGGAT-3』；下遊引物5』-AGAGCCCTGGGCACTGTCGCT-3』，進行一步法—管擴增體系，以β-肌動蛋白作為內參照，其上遊引物5』-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3』、下遊引物5』-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3』，反應體系20-30ul，其中逆轉錄酶0.2-1.5ul，耐熱擴增酶0.1-0.4ul，脫氧核苷酸0.1-0.5ul，氯化鎂1-4ul，緩衝液1-6ul，餘量是去核糖核酸酶的雙蒸水，目的片段人白細胞抗原A的上下遊引物或人白細胞抗原B的上下遊引物各0.4-2ul，以β-肌動蛋白作為內參照，上遊引物5』-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3』、下遊引物5』-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3』各0.1-1ul，模板核糖核酸4-20ul，多聚酶鏈反應儀反應參數為40-42℃ 20-40min，90-96℃ 2-5min，90-96℃ 0.5-3min，52-60℃ 0.5-3min，70-75℃ 0.5-3min，3-10個循環；90-96℃ 5-30sec，60-65℃ 10-60sec，30-45個循環，70-75℃ 3-15min，然後對擴增產物進行電泳掃描及序列分析，最後採用與上述引物相對應的螢光探針檢測人白細胞抗原A或人白細胞抗原B信使核糖核酸表達強度的高低。
所述的單個核細胞人白細胞抗原A或B檢測移植病人免疫狀態的方法，其一步法—管擴增體系中各參數可以是，以β-肌動蛋白作為內參照，其上遊引物5』-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3』、下遊引物5』-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3』，反應體系25ul，其中逆轉錄酶1ul、耐熱擴增酶0.2ul，脫氧核苷酸0.2ul，氯化鎂2.5ul，緩衝液2.5ul，其餘是去核糖核酸酶的雙蒸水，多聚酶鏈反應儀反應參數為42℃ 30min，95℃ 3min，94℃ 1min，57℃1min，72℃ 1min，5個循環；94℃ 10sec，62℃ 30sec，33個循環，72℃ 5min。
所述的單個核細胞人白細胞抗原A或B檢測移植病人免疫狀態的方法，對人白細胞抗原A的特異性引物進行篩選得出人白細胞抗原A的上遊引物5』-GGAGAGGAGCAGAGATACAC-3』，下遊引物5』-AGAACCAGGCCAGCAATG-3』。
所述的單個核細胞人白細胞抗原A或B檢測移植病人免疫狀態的方法，對人白細胞抗原A的特異性引物進行篩選得出人白細胞抗原A的上遊引物5』-GGAGAGGAGCAGAGATACAC-3』，下遊引物5』-ACCAGGCCAGCAATGATG-3』。
所述的單個核細胞人白細胞抗原A或B檢測移植病人免疫狀態的方法，對人白細胞抗原A的特異性引物進行篩選得出人白細胞抗原A的上遊引物5』-TGGAGAGGAGCAGAGATACACC-3』，下遊引物5』-TCACGGCAGCGACCACAG-3』。
所述的單個核細胞人白細胞抗原A或B檢測移植病人免疫狀態的方法，對人白細胞抗原A的特異性引物進行篩選得出人白細胞抗原A的上遊引物5』-CCCATCTCTGACCATGAG-3』，下遊引物5』-GGTGTATCTCTGCTCCTC-3』。
所述的單個核細胞人白細胞抗原A或B檢測移植病人免疫狀態的方法，對人白細胞抗原B的特異性引物進行篩選得出入白細胞抗原B的上遊引物5』-GGGCAGCTGTGGTGCCT-3』，下遊引物5』-CACTGTCGCTGCACGCAGCCT-3』。
所述的單個核細胞人白細胞抗原A或B檢測移植病人免疫狀態的方法，對人白細胞抗原B的特異性引物進行篩選得出人白細胞抗原B的上遊引物5』-CTGCCGAAGCCCCTCACCCTCT-3』，下遊引物5』-AGGACCAGACCCAGGACA-3』。
所述的單個核細胞人白細胞抗原A或B檢測移植病人免疫狀態的方法，對人白細胞抗原B的特異性引物進行篩選得出人白細胞抗原B的上遊引物5』-GCCGTCTTCCCAGTCCACCGT-3』，下遊引物5』-ATGCCCACGATGGGGACGGT-3』。
本發明的積極效果在於為臟器移植病人免疫狀態的強弱提供了一種準確的檢測方法，使醫生可以根據臟器移植病人自身的免疫狀態確定抗排斥的藥量，從而避免了因用藥量過大或過小產生的移植失敗、細菌病毒感染、腫瘤發生等嚴重後果。採用本發明的檢測方法，能夠準確掌握臟器移植病人免疫狀態的強弱，提高臟器移植成功率及病人的身體健康狀況。
具體實施例方式
本發明的檢測方法如下首先取外周血淋巴細胞(PBL)進行分離無菌抽取移植病人外周血2ml，EDTA-K2防凝。3000rpm/min離心10min(普通離心機)，4小時內完成。
以無菌吸管仔細吸取白細胞層，稀釋後緩慢加入盛有2ml淋巴細胞分離液的無菌管中，3000rpm/min離心25min(普通離心機)。
以無菌吸管小心吸取單個核細胞至一滅菌Ependoff管中，5000rpm/min離心4min(普通離心機)吸棄上清液(-80℃可長期保存)。
對淋巴細胞總模板核糖核酸(RNA)進行提取，(以下均為冰上操作，所有器材預先用去核糖核酸酶的雙蒸水處理)取出凍存的淋巴細胞加入50ulTE溶解沉澱，然後加入150ul白細胞裂解液(深圳匹基生物公司生產)，反覆吹打至細胞完全裂解。在裂解的細胞混合液中加入50ul氯仿抽提RNA，冰浴5-7min，15000rpm/min離心10min(高速冷凍離心機)。
離心後可見混合液分為三層，吸取最上層無色水相，加入等體積的異丙醇沉澱RNA，-20℃放置20-60min，13000rpm/min離心10min(4℃，高速冷凍離心機)。
棄去上清液(注意離心方向)，加入300ul預致冷的75％乙醇(去核糖核酸酶的雙蒸水配製)，13000rpm/min(4℃，高速冷凍離心機)離心10min去鹽，輕棄上清(注意離心方向)，吸水紙上吸乾。
13000rpm/min離心(高速冷凍離心機)10秒鐘，將管壁殘餘液體甩至底部，以無菌吸頭吸乾殘液，加入適量的去核糖核酸酶的雙蒸水溶解RNA。
對外周血淋巴細胞總RNA進行鑑定提取的外周血淋巴細胞總RNA，在UA-2450紫外分光光度計上測定260nm和280nm波長下RNA的吸光度，將提取的RNA在1.5％低熔點瓊脂糖凝膠變性電泳，可見5s，18s，28s三條清晰條帶，表明所提RNA濃度較純，且RNA完整無裂解，可用於逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)。
選取人白細胞抗原A(HLA-A)或人白細胞抗原B(HLA-B)特異性引物提取的RNA以不同的引物，即人白細胞抗原A上遊引物5』-CTACCCTGCGGAGATCAC-3』，下遊引物5』-AGAGAACCAGGCCAGCAAT-3』，這是本發明方法人白細胞抗原A較好的一對引物，以下各對引物均可等同使用，並可達到本發明所述的檢測效果，上遊引物5』-GGAGAGGAGCAGAGATACAC-3』，下遊引物5』-AGAACCAGGCCAGCAATG-3』。或上遊引物5』-TGGAGAGGAGCAGAGATACACC-3』，下遊引物5』-TCACGGCAGCGACCACAG-3』。或上遊引物5』-CCCATCTCTGACCATGAG-3』，下遊引物5』-GGTGTATCTCTGCTCCTC-3』。本發明人白細胞抗原B的特異性引物即上遊引物5』-GGGCAGCTGTGGTGCCT-3』，下遊引物5』-CACTGTCGCTGCACGCAGCCT-3』，這是本發明方法人白細胞抗原B中較好的一對引物，以下各對引物均可達到本發明所述檢測效果。或上遊引物5』-CTGCCGAAGCCCCTCACCCTCT-3』，下遊引物5』-AGGACCAGACCCAGGACA-3』，或上遊引物5』-GCCGTCTTCCCAGTCCACCGT-3』，下遊引物5』-ATGCCCACGATGGGGACGGT-3』，組合置於RT-PCR反應體系中擴增，擴增產物以2％瓊脂糖凝膠電泳，篩選與預期279bp片段相吻合的特異性引物。
採用一步法—管擴增體系以β-肌動蛋白作為內參照，反應體系25ul，其中逆轉錄酶1ul，耐熱擴增酶0.2ul、脫氧核苷酸0.2ul、氯化鎂2.5ul，緩衝液2.5ul，餘量是去核糖核酸酶的雙蒸水。
目的片段人白細胞抗原A或人白細胞抗原B的上下遊引物各1ul，內參照以上遊引物5』-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3』、下遊引物5』-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3』各0.3ulRNA10ul多聚酶鏈反應儀的反應參數42℃ 30min，95℃ 3min，94℃ 1min，57℃ 1min，72℃ 1min，5個循環；94℃ 10sec，62℃ 30sec，33個循環，72℃ 5min。
或以β-肌動蛋白作為內參照，反應體系20ul，其中逆轉錄酶0.2ul，耐熱擴增酶0.1ul、脫氧核苷酸0.1ul、氯化鎂1ul，緩衝液1ul，餘量是去核糖核酸酶的雙蒸水。
目的片段人白細胞抗原A或人白細胞抗原B的上下遊引物各0.4ul內參照以上遊引物5』-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3』、下遊引物5』-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3』各1ulRNA10ul，多聚酶鏈反應儀的反應參數40℃ 20min，90℃ 2min，90℃ 0.5min，52℃ 0.5min，70℃ 0.5min，3個循環；90℃ 5sec，60℃ 10sec，30個循環，70℃ 3min。
或以β-肌動蛋白作為內參照，反應體系30ul，其中逆轉錄酶0.5ul，耐熱擴增酶0.4ul、脫氧核苷酸1.5ul、氯化鎂4ul，緩衝液6ul，餘量是去核糖核酸酶的雙蒸水。
目的片段人白細胞抗原A或人白細胞抗原B上下遊引物各2ul，內參照上遊引物5』-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3』、下遊引物5』-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3』各1ul，RNA20ul，多聚酶鏈反應儀的反應參數42℃ 40min，96℃ 5min，96℃3min，60℃ 3min，75℃ 3min，10個循環；96℃ 30sec，65℃60sec，45個循環，75℃ 15min。
將上述擴增產物進行電泳掃描及序列分析多聚酶鏈反應擴增產物2％瓊脂糖凝膠電泳後，在凝膠成像系統上掃描分析。HLA-A或HLA-B互補脫氧核糖核酸在全自動測序抗原儀上測序，並用Blastn伺服器對序列進行查詢和比較。採用與本發明上述引物相對應的螢光探針檢測HLA-A或HLA-B信使核糖核酸表達強度，這個強度的高低，與臟器移植病人免疫狀態相對應，以此確定臟器移植病人免疫狀態的強弱，為抗排斥用藥量提供了準確的依據。
權利要求
1.單個核細胞人白細胞抗原A或B檢測移植病人免疫狀態的方法，取臟器移植病人外周血，分離淋巴細胞，提取淋巴細胞總模板核糖核酸，對外周血淋巴細胞總模板核糖核酸進行鑑定，其特徵在於對人白細胞抗原A或人白細胞抗原B特異性引物進行篩選得出人白細胞抗原A的上遊引物5』-CTACCCTGCGGAGATCAC-3』，下遊引物5』-AGAGAACCAGGCCAGCAAT-3』，或人白細胞抗原B的上遊引物5』-CACACTGACCTGGCAGCGGGAT-3』；下遊引物5』-AGAGCCCTGGGCACTGTCGCT-3』，然後進行一步法一管擴增體系，以β-肌動蛋白作為內參照，其上遊引物5』-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3』、下遊引物5』-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3』，反應體系20-30ul，其中逆轉錄酶0.2-1.5ul，耐熱擴增酶0.1-0.4ul，脫氧核苷酸0.1-0.5ul，氯化鎂1-4ul，緩衝液1-6ul，餘量是去核糖核酸酶的雙蒸水，目的片段人白細胞抗原A的上下遊引物或人白細胞抗原B的上下遊引物各0.4-2ul，內參照上遊引物5』-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3』、下遊引物5』-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3』各01.-1ul，模板核糖核酸4-20ul，多聚酶鏈反應儀反應參數為40-42℃20-40min，90-96℃2-5min，90-96℃0.5-3min，52-60℃0.5-3min，70-75℃0.5-3min，3-10個循環；90-96℃5-30sec，60-65℃10-60sec，30-45個循環，70-75℃3-15min，然後對擴增產物進行電泳掃描及序列分析，最後採用與上述引物相對應的螢光探針檢測人白細胞抗原A或人白細胞抗原B信使核糖核酸表達強度的高低。
2.根據權利要求1所述的單個核細胞人白細胞抗原A或B檢測移植病人免疫狀態的方法，其特徵在於一步法-管擴增體系中各參數是，以β-肌動蛋白作為內參照，其上遊引物5』-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3』、下遊引物5』-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3』，反應體系25ul，其中逆轉錄酶1ul、耐熱擴增酶0.2ul，脫氧核苷酸0.2ul，氯化鎂2.5ul，緩衝液2.5ul，其餘是去核糖核酸酶的雙蒸水，多聚酶鏈反應儀反應參數為42℃30min，95℃3min，94℃1min，57℃1min，72℃1min，5個循環；94℃10sec，62℃30sec，33個循環，72℃5min。
3.根據權利要求1或2所述的單個核細胞人白細胞抗原A或B檢測移植病人免疫狀態的方法，其特徵在於對人白細胞抗原A的特異性引物進行篩選得出人白細胞抗原A的上遊引物5』-GGAGAGGAGCAGAGATACAC-3』，下遊引物5』-AGAACCAGGCCAGCAATG-3』。
4.根據權利要求1或2所述的單個核細胞人白細胞抗原A或B檢測移植病人免疫狀態的方法，其特徵在於對人白細胞抗原A的特異性引物進行篩選得出人白細胞抗原A的上遊引物5』-GGAGAGGAGCAGAGATACAC-3』，下遊引物5』-ACCAGGCCAGCAATGATG-3』。
5.根據權利要求1或2所述的單個核細胞人白細胞抗原A或B檢測移植病人免疫狀態的方法，其特徵在於對人白細胞抗原A的特異性引物進行篩選得出人白細胞抗原A的上遊引物5』-TGGAGAGGAGCAGAGATACACC-3』，下遊引物5』-TCACGGCAGCGACCACAG-3』。
6.根據權利要求1或2所述的單個核細胞人白細胞抗原A或B檢測移植病人免疫狀態的方法，其特徵在於對人白細胞抗原A的特異性引物進行篩選得出人白細胞抗原A的上遊引物5』-CCCATCTCTGACCATGAG-3』，下遊引物5』-GGTGTATCTCTGCTCCTC-3』。
7.根據權利要求1或2所述的單個核細胞人白細胞抗原A或B檢測移植病人免疫狀態的方法，其特徵在於對人白細胞抗原B的特異性引物進行篩選得出人白細胞抗原B的上遊引物5』-GGGCAGCTGTGGTGCCT-3』，下遊引物5』-CACTGTCGCTGCACGCAGCCT-3』。
8.根據權利要求1或2所述的單個核細胞人白細胞抗原A或B檢測移植病人免疫狀態的方法，其特徵在於對人白細胞抗原B的特異性引物進行篩選得出人白細胞抗原B的上遊引物5』-CTGCCGAAGCCCCTCACCCTCT-3』，下遊引物5』-AGGACCAGACCCAGGACA-3』。
9.根據權利要求1或2所述的單個核細胞人白細胞抗原A或B檢測移植病人免疫狀態的方法，其特徵在於對人白細胞抗原B的特異性引物進行篩選得出人白細胞抗原B的上遊引物5』-GCCGTCTTCCCAGTCCACCGT-3』，下遊引物5』-ATGCCCACGATGGGGACGGT-3』。
全文摘要
本發明公開了一種單個核細胞人白細胞抗原A或B檢測移植病人免疫狀態的方法，取臟器移植病人外周血，分離淋巴細胞，提取淋巴細胞總模板核糖核酸，對外周血淋巴細胞總模板核糖核酸進行鑑定，對人白細胞抗原A或人白細胞抗原B特異性引物進行篩選，然後進行一步法一管擴增體系，以上、下遊引物作為內參照，然後對擴增產物進行電泳掃描及序列分析，最後採用與上述引物相對應的螢光探針檢測人白細胞抗原A或人白細胞抗原B抗原表達強度的高低。它可以通過檢測臟器移植病人的外周血單個核細胞人白細胞抗原A或B的抗原表達強度，以達到根據該強度的高低，確定病人用藥量，以此提高臟器移植的成功率及病人的身體健康狀況等。
文檔編號G01N33/53GK1710423SQ20041007585
公開日2005年12月21日 申請日期2004年12月30日 優先權日2004年12月30日
發明者鄒雄, 張義, 楊曉靜, 秦緒珍, 莊學偉, 單寧寧, 王洪春 申請人:山東大學齊魯醫院