外胚間充質幹細胞的分離和培養方法
2023-09-16 08:51:35 3
專利名稱：外胚間充質幹細胞的分離和培養方法
技術領域：
本發明屬於生物細胞技術領域，涉及外胚間充質幹細胞分離培養方法。
背景技術：
在頜面部各突起的發育過程中，來源於神經管和表面外胚層結合處的神經嵴細胞(neural crest stem cell，以下簡稱NCSC)經過定向遷移、增殖，到達面突中胚層，稱為外胚間充質。在胚胎的發育過程中，外胚間充質幹細胞又可以進一步向成牙本質細胞、牙髓細胞、成骨細胞、成肌細胞、膠質細胞、神經元等多個譜系進行分化。與其它應用於組織工程的幹細胞(如胚胎幹細胞、骨髓間充質幹細胞、神經嵴細胞及神經幹細胞)相比，它具有以下優點①來源豐富，容易取材；②增殖速度快，人頜突間充質幹細胞可持續傳數十代；③可用於異體移植，臨床應用範圍廣；④在細胞因子的作用下可保持未分化狀態，自然情況下可向其它譜系進行分化；⑤在外源因子誘導下，可分化為多種終末分化的細胞，其中包括成牙本質細胞、雪旺細胞等，在組織工程牙齒和外周神經修復中具有重要的理論研究和使用價值。外胚間充質幹細胞取自生物體早期胚胎，保持了幹細胞的特性，具有較強的增殖能力，研究表明，在外源性生長因子的作用下，外胚間充質幹細胞可以分化為成牙本質細胞，還可被誘導分化為多種功能細胞，如成骨細胞、骨骼肌細胞、雪旺細胞、成牙本質細胞等，適合作為組織工程的種子細胞，與各種生物材料結合，利用該細胞的多向分化潛能，用於構建組織工程骨、肌肉、神經、牙齒，並用於缺損修復。
目前，國內外對NCSC的研究主要局限於非卵生系統中，尚未見分離、培養出NCSC的任何文獻報導及相關專利。
發明內容
鑑於NCSC具有上述如此多的優點而並未得到研究、開發和利用的現狀，本發明的目的在於提供外胚間充質幹細胞的分離培養方法。並提出本發明方法製備的NCSC的新用途。
本發明分離培養方法的特徵在於其包括外胚間充質幹細胞培養基的配製、外胚間充質幹細胞的分離和培養、外胚間充質幹細胞的純化，具體步驟有(1)外胚間充質幹細胞培養基的配製a.取商用最低必需培養液DMEM和商用培養液F12按1∶1混合製成的基礎培養液；b.向基礎培養液中加入碳酸氫鈉、胎牛血清、L-穀氨醯銨、碳酸氫鈉、青黴素/鏈黴素、鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、牛垂體提取物(BPE)和白血病抑制因子(LIF)，充分攪拌混勻；調pH為7.4-7.5；c.超淨臺抽濾消毒，4℃保存備用；(2)外胚間充質幹細胞的分離和培養a.在無菌條件下，切取自願終止妊娠的40-50天胎兒或妊娠11-12天鼠胚的上下頜突，剪切成1mm3大小，2.5g/l胰酶37℃消化；b.加入等量的含血清的培養液終止消化，吹打使組織分散成細胞懸液，離心，棄上清，加入培養液使細胞再懸浮後分裝入培養瓶中，置37℃、5％CO2的孵箱中；(3)外胚間充質幹細胞的純化a.在原代培養時，單細胞懸液接種於培養瓶中培養至大部分細胞貼壁後，棄上清，加入新的培養液繼續培養；b.細胞鋪滿瓶底時，消化傳代，再通過交聯有特異性抗體HNK-1(CD57)的磁珠分離純化獲得外胚間充質幹細胞。
上述的外胚間充質細胞的培養方法中，在基礎培養液中所加入各組分的量為成份1000ml體積胎牛血清(5-15％)50-150ml碳酸氫鈉4-6gL-穀氨醯銨 0.1-0.3g鹼性成纖維細胞生長因子 5-15μg牛垂體提取物0.1-20ml白血病抑制因子 106U青黴素/鏈黴素 50-150i.u外胚間充質幹細胞的用途在於1.外胚間充質幹細胞用於骨組織工程頜面部骨骼則主要來自顱神經嵴來源的外胚間充質幹細胞。小鼠、大鼠、人胚胎面突外胚間充質幹細胞具有成骨能力已被證實。體外實驗顯示，在含β-甘油磷酸鈉、維生素C、地塞米松的礦化誘導液中，外胚間充質細胞出現了一系列的變化。細胞形態由梭形的成纖維樣變為多角形、立方形，同時體積增大，細胞增殖速度變慢，表達I型膠原。鹼性磷酸酶活性增高及骨鈣素的表達進一步表明該細胞已分化為成骨細胞。隨培養時間的延長，礦化結節的形成證實誘導細胞已分泌礦化基質。這一系列改變表明外胚間充質細胞已被成功誘導分化為成骨細胞。將體外誘導後的細胞直接植入動物體內，或者與膠原、煅燒骨、珊瑚複合，修復骨缺損，均可見缺損區有成熟的新骨形成，並開始重建骨缺損區。表明外胚間充質幹細胞經誘導後用於構建組織工程骨並用於缺損修復是可行的。
2.胚間充質幹細胞用於肌肉組織工程肌肉組織工程的研究大都著眼於細胞移植的角度出發。成肌細胞具有較強的分化增殖能力，目前肌肉組織工程方面的研究多採用成肌細胞為種子細胞。種子細胞來源的另一途徑是通過幹細胞工程獲得相應的種子細胞。胚胎幹細胞和間充質幹細胞具有分化為肌肉細胞的能力。而外胚間充質幹細胞的研究表明，它是幹細胞肌肉組織工程種子細胞來源的又一有益補充。外胚間充質幹細胞具有分化為肌肉細胞的能力。研究表明，外胚間充質幹細胞在無分化抑制劑存在時，向平滑肌細胞分化的趨勢非常明顯，而在TGF-β作用下，分化的比例可達到95％。在DEMSO的作用下，外胚間充質幹細胞可分化為骨骼肌細胞。如果將外胚間充質幹細胞在體外誘導分化為平滑肌細胞、骨骼肌細胞，再與膠原或其他生物材料相複合，移植到體內，可以修復肌肉缺損。
3.外胚間充質幹細胞用於外周神經修復研究表明，外胚間充質幹細胞在佛絲扣林(forskolin)、牛垂體提取物的作用下，可以分化為雪旺細胞。通過定向誘導頜突間充質幹細胞定向分化為雪旺細胞，將有可能尋找到組織工程神經新的種子細胞來源。通過與研製的殼聚糖/膠原神經導管複合，橋接坐骨神經斷端，觀察神經軸突的再生，將為探索神經再生、損傷修復的治療提供新的思路和更加有效的途徑。
4.外胚間充質幹細胞用於牙組織工程除牙釉質外，包括牙本質、牙骨質、牙髓、牙周組織均來自外胚間充質幹細胞。口腔上皮與間充質相互作用，共同調控牙齒的發育。在牙胚發育的早期，局部增厚的口腔上皮形成牙板並向深層結締組織內伸延，在固定區域提供成牙信息，指導其下方及周圍的外胚間充質幹細胞向牙源性間充質細胞分化。此時的牙板上皮又稱牙源性上皮，將來發育為成釉器，並形成釉質。在牙源性上皮的誘導下，牙源性間充質緊鄰內釉上皮層的部分將分化為成牙本質細胞，並分泌牙本質基質，礦化形成牙本質，下方的牙乳頭細胞進一步分化為牙髓組織細胞，而周圍的部分牙囊細胞分化形成牙骨質，從而造成牙齒的形態學發生。外胚間充質幹細胞是牙齒組織工程最為適宜的種子細胞。作為牙齒多種結構的來源細胞，其多向分化潛能是向牙齒多種結構分化的保障。研究表明，在外源性生長因子的作用下，外胚間充質幹細胞可以分化為成牙本質細胞。
具體實施例方式
本實施例為SD大鼠頜突外胚間充質細胞的分離和培養方法，包括以下步驟1.SD大鼠頜突外胚間充質細胞的分離和原代培養斷頸處死妊娠11-12天的SD大鼠，無菌條件下剖腹取出胎鼠，Hank’s液中切取胎鼠上下面突，切碎後用2.5g/l胰酶37℃消化8分鐘，加入等量的含血清的培養液終止消化，輕輕吹打使組織分散成細胞懸液，800轉/分鐘離心6分鐘，棄上清，加入培養液使細胞再懸浮後分裝入培養瓶中，加入適量的培養液，置37℃、5％CO2的孵箱中40分鐘，倒置顯微鏡下觀察大部分細胞已經貼壁，棄上清，加入新鮮培養液繼續培養，隔日觀察細胞生長狀況，2-3日更換培養液。
2.傳代培養和初步純化細胞長滿培養瓶底時，用2.5g/l胰酶37℃消化6分鐘，在倒置顯微鏡見大部分細胞已經回縮並漂浮於培養液中，用等量含血清的培養液終止消化，離心再懸沉澱，1∶2傳代。37℃40分鐘後棄上清加入新鮮培養液常規培養。
3.免疫磁珠分離純化將製備的單細胞懸液通過磁珠篩選，所採用的特異抗體為CD57。將預處理過的磁珠放入與CD57充分結合的細胞懸液中，均勻混合後置於室溫下孵育30分鐘。將結合了磁珠的細胞懸液放入高強磁場中靜置5-10分鐘，輕輕吸去試管中的液體；將試管脫離磁場並以D-Hank液衝洗試管壁使粘附在管壁上的細胞(即CD57陽性細胞)衝洗下來製成純化細胞懸液。
4.在第5代之前，採用擴增培養基，為10％的DMEM/F12，其中添加1000U/ml的重組人LIF(Sigma公司生產)，和10ng/ml的重組人bFGF(Sigma公司生產)，5％的牛垂體提取物(Sigma公司生產)。
5.在第5代之前，將細胞應用於備種研究和生產中。
本發明方法簡單，可重複性強，操作簡便易行，為外胚間充質幹細胞及其應用的科研、教學、臨床應用等能起到不可估量和的作用，同時也孕育著巨大的社會效益和經濟效益。
權利要求
1.外胚間充質幹細胞的分離和培養方法，其特徵在於包括外胚間充質幹細胞培養基的配製、外胚間充質幹細胞的分離和培養、外胚間充質幹細胞的純化，具體步驟有(1)外胚間充質幹細胞培養基的配製a.取最低必需培養液DMEM和培養液F12按1∶1混合而成的基礎培養液；b.向基礎培養液中加入胎牛血清、L-穀氨醯銨、碳酸氫鈉、青黴素/鏈黴素、鹼性成纖維細胞生長因子、牛垂體提取物和白血病抑制因子，攪拌混勻；c.調pH為7.4-7.5，超淨臺抽濾消毒，保存備用；(2)外胚間充質幹細胞的分離和培養a.在無菌條件下，切取自願終止妊娠的40-50天胎兒或妊娠11-12天鼠胚的上下頜突，胰酶消化；b.加入等量的含血清的培養液終止消化，吹打使組織分散成細胞懸液，離心，棄上清，加入培養液使細胞再懸浮後分裝入培養瓶中，置孵箱中孵育；(3)外胚間充質幹細胞的純化a.在原代培養時，單細胞懸液接種於培養瓶中培養至大部分細胞貼壁後，棄上清，加入新的培養液繼續培養；b.細胞鋪滿瓶底時，消化傳代，再通過交聯有特異性抗體HNK-1(CD57)的磁珠分離純化獲得外胚間充質幹細胞。
2.根據權利要求1所述的外胚間充質幹細胞的分離和培養方法，其特徵在於外胚間充質幹細胞的培養方法中所用的培養基各組分的配比為(以總體積1L計)胎牛血清50-150ml、碳酸氫鈉4-6g、L-穀氨醯銨0.1-0.3g、鹼性成纖維細胞生長因子5-15ug、牛垂體提取物0.1-20ml、白血病抑制因子106u、青黴素或鏈黴素50-150i.u。
3.根據權利要求1所製備的外胚間充質幹細胞的新用途，其特徵在於外胚間充質幹細胞經誘導後用於構建組織工程骨並用於缺損修復。
4.根據權利要求1所製備的外胚間充質幹細胞的新用途，其特徵在於將外胚間充質幹細胞在體外誘導分化為平滑肌細胞、骨骼肌細胞，再與膠原或其他生物材料相複合，移植到體內，可以修復肌肉缺損。
5.根據權利要求1所製備的外胚間充質幹細胞的新用途，其特徵在於外胚間充質幹細胞通過定向誘導為雪旺細胞，可作為組織工程神經新的種子細胞來源，用於外周神經修復；通過與殼聚糖/膠原神經導管複合，可橋接坐骨神經斷端。
6.根據權利要求1所製備的外胚間充質幹細胞的新用途，其特徵在於外胚間充質幹細胞是牙齒組織工程最為適宜的種子細胞而用於牙組織工程；在外源性生長因子的作用下，外胚間充質幹細胞可以分化為成牙本質細胞。
全文摘要
本發明涉及生物細胞技術領域中的外胚間充質幹細胞的分離和培養方法，其特徵在於所述方法包括外胚間充質幹細胞培養基的配製、外胚間充質幹細胞的分離和培養、外胚間充質幹細胞的純化步驟。用本發明方法製備的外胚間充質幹細胞可用於骨組織工程、肌肉組織工程、外周神經修復和牙組織工程。本發明方法簡單，重複性強，操作簡便，為有關外胚間充質幹細胞的科研、教學、臨床應用等能起到不可估量的作用，同時孕育著巨大的社會效益和經濟效益。
文檔編號A61L31/00GK1590537SQ0313453
公開日2005年3月9日 申請日期2003年9月2日 優先權日2003年9月2日
發明者金巖, 鄧蔓菁, 張建平, 張光東 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學口腔醫學院