α－異麥芽糖基葡糖基糖形成酶,其製備方法和用途的製作方法

2023-10-05 18:37:59 2

專利名稱：α－異麥芽糖基葡糖基糖形成酶,其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶(isomaltosylglucosaccharide-forming enzyme)，其製備方法和用途，更具體地說，涉及一種新的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶，產生該酶的方法，利用該酶的α-葡糖基轉移方法，利用該酶和α-異麥芽糖基轉移酶兩者產生具有環{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}結構的環四糖的方法，以及包含這些糖的組合物。
現有技術已經知道由葡萄糖分子作為組成糖的糖，例如，從作為原料的澱粉產生的澱粉部分水解物，包括直鏈澱粉，澱粉糊精，麥芽糖糊精，麥芽寡糖(maltooligosaccharide)以及異麥芽寡糖。並且，已知這些糖在其分子末端通常具有還原性和非還原性基團，和顯示出還原性。一般來說，澱粉部分水解物可以用葡萄糖當量(DE)指數表述，該當量是基於乾物質的還原力的一種尺度。已知具有比較高的值的那些通常具有比較低的分子量，比較低的粘性，強的甜度和反應性性質，與含氨基的物質(例如胺基酸和蛋白質)的易反應性，其可以引起褐變和產生不愉快的氣味，並且容易引起變質。為了改進這些缺陷，長期需要用於降低或消除還原力而不改變葡萄糖分子作為澱粉部分水解物構成糖的方法。例如，在美國化學會雜誌，Vol 71，pp.353-358(1949)中公開的方法。已報導了經接觸來源於微生物軟化芽胞桿菌的澱粉酶從澱粉形成由經由α-1，4葡萄糖苷鍵連接在一起的6-8個葡萄糖分子組成的α-，β-以及γ-環糊精的方法。現在，這些環糊精以工業規模生產，並利用其固有的性質，例如非還原性，無味以及包裹能力用於不同的領域。如所公開的，例如在日本專利公開143,876/95和213,283/95(由與本申請相同的申請人提出)中公開的那些，已知通過將非還原糖形成酶和海藻糖釋放酶與澱粉部分水解物(例如麥芽寡糖)接觸，產生由經由α，α-連接鍵連接在一起的兩個葡萄糖分子組成的海藻糖的方法。現在海藻糖已經從澱粉工業化生產，並利用其有利的非還原性，中等和高質量的甜度用於不同的領域。如以上所描述的，具有二個葡糖聚合度(DP)的海藻糖以及具有6-8的DP的α-，β-以及γ-環糊精以工業規模生產，並利用它們有利的性質使用。然而，非-或低-還原糖的類型是有限的，因此需要不同於這些糖的更多不同的糖。
前不久，報導了一種由葡萄糖單位組成的環四糖的新類型。歐洲生物化學雜誌，Vol.226，pp.641-648(1994)顯示了通過將水解酶，alternanase，與經由交替α-1，3和α-1，6鍵和葡萄糖分子連接的alternan接觸，接著在有機溶劑甲醇存在下結晶，形成具有環{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}結構的環四糖(本說明書中全文可以稱為環四糖)的方法。
環四糖和具有環狀結構的糖顯示出穩定揮發性有機化合物，不引起氨基羰基反應的包含能力。因此，人們期望它們得到使用和加工，少擔心褐變和變質。
然而，產生該糖所需的原料alternan和alternanase不易獲得，並且用於它們的生產的微生物也不易獲得。
在這樣的條件下，本發明發明人通過將原料具有作為非還原端連接鍵的α-1，6糖苷鍵(glucosidic linkage)、並且具有至少為3的葡糖聚合度的糖(在說明書全文中可以稱為α-異麥芽糖基葡糖基糖)與α-異麥芽糖基轉移酶接觸，成功地產生了環四糖，該轉移酶特異性地水解α-異麥芽糖基部分和其餘的葡糖基糖部分，然後將α-異麥芽糖基部分轉移到其受體上形成環四糖，如在日本專利申請149,484/2000和229,557/2000中公開的。α-異麥芽糖基轉移酶是這樣一種酶，其由α-異麥芽糖基葡糖基糖通過α-異麥芽糖基轉移反應形成環四糖，並且具有下列物理化學性質
(1)作用從具有至少為3的葡糖聚合度，並且具有作為非還原端連接鍵的α-1，6糖苷鍵和作為非還原端連接鍵以外的連接鍵的α-1，4糖苷鍵兩者的糖形成具有環{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}結構的環四糖；(2)分子量當在十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)上測定時，具有約82,000到約136,000道爾頓的分子量；(3)等電點(pI)當用兩性電解質在等電泳上測定時，具有約3.7到約8.3的等電點。
(4)最適溫度當在pH 6.0下溫育30分鐘時，具有約45℃到約50℃的最適溫度；(5)最適pH當在35℃溫育30分鐘時，具有約5.5到約6.5的最適pH；(6)熱穩定性當在pH 6.0下溫育60分鐘時，具有約45℃或更低溫度下的熱穩定範圍；(7)pH穩定性當在4℃溫育24小時時，具有在約3.6到約10.0的pH穩定範圍。
就環四糖的原料糖而言，其從豐富和低價格的澱粉產生應當是合乎需要的，然而，由於α-異麥芽糖基轉移酶不直接作用於澱粉，實際上使用了下列方法首先將澱粉轉化成具有上述特定結構的α-異麥芽糖基葡糖基糖，例如相對低分子量的異麥芽寡糖，如潘糖和異麥芽糖基麥芽糖，然後在α-異麥芽糖基轉移酶的作用下形成環四糖。
已經發現，當用潘糖作為環四糖的原料時，基於幹固體的重量(d.s.b.)，從原料的產率是約44％。同樣地，用異麥芽糖基麥芽糖作為原料的情況下，環四糖的產率約為31％(d.s.b.)，而用澱粉作為原料的情況下，它們應當與酶，例如α-澱粉酶，澱粉脫支酶，β-澱粉酶和α-葡萄糖苷酶接觸，形成相對低分子量的異麥芽糖基寡糖，包括潘糖，環四糖的產率低至約15％(d.s.b.)。
雖然從澱粉實際產生環四糖的是可行的(即使具有這樣低的產率)，但其生產價格可以是較高的。在這樣的情況下，需要建立採用容易得到的原料(例如澱粉)以相對高的產率產生環四糖的新的方法。
發明描述本發明的目的在於提供一種α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶，其製備方法，可由其獲得的環四糖，包括環四糖的糖以及它們的用途。
為了達到上述目的，本發明發明人廣泛地篩選了微生物，其產生可用於從澱粉原料以比較高的產率製備環四糖之新酶，期望得到這樣一種酶。結果他們意外地發現從土壤分離的芽孢桿菌屬或節桿菌屬的微生物，如圓孢芽孢桿菌(Bacillus globisporus)C9菌株，圓孢芽孢桿菌C11菌株，圓孢芽孢桿菌N75菌株以及球形節桿菌(Arthrobacterglobiformis)A19菌株(下文稱為″菌株C9″，″菌株C11″，″菌株N75″以及″菌株A19″)，它們形成α-異麥芽糖基轉移酶(如日本專利申請149,484/2000和229,557/2000中公開的)以及新的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶(本發明發明人所追求的)兩者。經首先發現以下事實，發明人完成了本發明通過將相對低分子量的葡糖基糖(包括澱粉部分水解物)與α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶接觸，環四糖的產率(本發明發明人瞄準的目標)可以大大提高；揭示了α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的性質以及α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的製備方法；利用α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的α-葡糖基轉移反應，產生α-異麥芽糖基葡糖基糖的方法；環四糖或包含環四糖的糖組合物，其可由利用α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶獲得；以及產生這些糖的方法。本發明發明人也獲得了含有環四糖或包含環四糖的糖組合物的食物，化妝品和藥物，由此完成了本發明。
附圖簡要描述

圖1是當用高效液相色譜測定時，經由來源於微生物圓孢芽孢桿菌C9菌株的α-異麥芽糖基轉移酶獲得的糖的洗脫模式。
圖2是環四糖的核磁共振譜(1H-NMR)，所說的環四糖是經採用來源於微生物圓孢芽孢桿菌C9菌株的α-異麥芽糖基轉移酶的酶促反應獲得的。
圖3是環四糖的核磁共振譜(13C-NMR)，所說的環四糖是經採用來源於微生物圓孢芽孢桿菌C9菌株的α-異麥芽糖基轉移酶的酶促反應獲得的。
圖4代表環四糖的結構，即，環{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→)。
圖5顯示溫度對來源於微生物圓孢芽孢桿菌C9菌株的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶酶促活性的影響。
圖6顯示pH對來源於微生物圓孢芽孢桿菌C9菌株的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶酶促活性的影響。
圖7顯示來源於微生物圓孢芽孢桿菌C9菌株的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的熱穩定性。
圖8顯示來源於微生物圓孢芽孢桿菌C9菌株的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的pH穩定性。
圖9顯示溫度對來源於微生物圓孢芽孢桿菌C9菌株的α-異麥芽糖基轉移酶酶促活性的影響。
圖10顯示pH對來源於微生物圓孢芽孢桿菌C9菌株的α-異麥芽糖基轉移酶酶促活性的影響。
圖11顯示來源於微生物圓孢芽孢桿菌C9菌株的α-異麥芽糖基轉移酶的熱穩定性。
圖12顯示來源於微生物圓孢芽孢桿菌C9菌株的α-異麥芽糖基轉移酶的pH穩定性。
圖13顯示溫度對來源於微生物圓孢芽孢桿菌C11菌株的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶酶促活性的影響。
圖14顯示pH對來源於微生物圓孢芽孢桿菌C11菌株的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶酶促活性的影響。
圖15顯示來源於微生物圓孢芽孢桿菌C11菌株的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的熱穩定性。
圖16顯示來源於微生物圓孢芽孢桿菌C11菌株的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的pH穩定性。
圖17顯示溫度對來源於微生物圓孢芽孢桿菌C11菌株的α-異麥芽糖基轉移酶酶促活性的影響。
圖18顯示pH對來源於微生物圓孢芽孢桿菌C11菌株的α-異麥芽糖基轉移酶酶促活性的影響。
圖19顯示來源於微生物圓孢芽孢桿菌C11菌株的α-異麥芽糖基轉移酶的熱穩定性。
圖20顯示來源於微生物圓孢芽孢桿菌C11菌株的α-異麥芽糖基轉移酶的pH穩定性。
圖21顯示溫度對來源於微生物圓孢芽孢桿菌N75菌株的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶酶促活性的影響。
圖22顯示pH對來源於微生物圓孢芽孢桿菌N75菌株的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶酶促活性的影響。
圖23顯示來源於微生物圓孢芽孢桿菌N75菌株的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的熱穩定性。
圖24顯示來源於微生物圓孢芽孢桿菌N75菌株的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的pH穩定性。
圖25顯示溫度對來源於微生物圓孢芽孢桿菌N75菌株的α-異麥芽糖基轉移酶酶促活性的影響。
圖26顯示pH對來源於微生物圓孢芽孢桿菌N75菌株的α-異麥芽糖基轉移酶酶促活性的影響。
圖27顯示來源於微生物圓孢芽孢桿菌N75菌株的α-異麥芽糖基轉移酶的熱穩定性。
圖28顯示來源於微生物圓孢芽孢桿菌N75菌株的α-異麥芽糖基轉移酶的pH穩定性。
圖29顯示溫度對來源於微生物球形節桿菌A19菌株的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶酶促活性的影響。
圖30顯示pH對來源於微生物球形節桿菌A19菌株的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶酶促活性的影響。
圖31顯示來源於微生物球形節桿菌A19菌株的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的熱穩定性。
圖32顯示來源於微生物球形節桿菌A19菌株的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的pH穩定性。
圖33顯示溫度對來源於微生物球形節桿菌A19菌株的α-異麥芽糖基轉移酶酶促活性的影響。
圖34顯示pH對來源於微生物球形節桿菌A19菌株的α-異麥芽糖基轉移酶酶促活性的影響。
圖35顯示來源於微生物球形節桿菌A19菌株的α-異麥芽糖基轉移酶的熱穩定性。
圖36顯示來源於微生物球形節桿菌A19菌株的α-異麥芽糖基轉移酶的pH穩定性。
圖37顯示溫度對來源於微生物分枝節桿菌(Arthrobacter ramosus)S1菌株的α-異麥芽糖基轉移酶酶促活性的影響。
圖38顯示pH對來源於微生物分枝節桿菌S1菌株的α-異麥芽糖基轉移酶酶促活性的影響。
圖39顯示來源於微生物分枝節桿菌S1菌株的α-異麥芽糖基轉移酶的熱穩定性。
圖40顯示來源於微生物分枝節桿菌S1菌株的α-異麥芽糖基轉移酶的pH穩定性。
圖41利用本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶經酶促反應獲得的α-異麥芽糖基麥芽三糖的核磁共振譜(1H-NMR)。
圖42利用本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶經酶促反應獲得的α-異麥芽糖基麥芽四糖的核磁共振譜(1H-NMR)。
圖43利用本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶經酶促反應獲得的α-異麥芽糖基麥芽三糖的核磁共振譜(13C-NMR)。
圖44利用本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶經酶促反應獲得的α-異麥芽糖基麥芽四糖的核磁共振譜(13C-NMR)。
圖45為本發明的環四糖晶體(五到六水合物)顯微鏡照片在屏幕上顯示的可見中間圖。
圖46是當用x-光粉末衍射分析測定時，晶體形式的本發明的環四糖(五到六水合物)的x-光衍射光譜。
圖47是當用熱重量分析測定時，晶體形式的本發明的環四糖(五到六水合物)的熱重量分析曲線。
圖48是當用x-光粉末衍射分析測定時，晶體形式的本發明的環四糖一水合物的x-光衍射光譜。
圖49是當用熱重量分析測定時，晶體形式的本發明的一水合物的熱重量分析曲線。
圖50是當用x-光粉末衍射分析測定時，經在40℃下真空乾燥獲得的本發明的環四糖(五到六水合物)的無水晶體粉末的x-光衍射光譜。
圖51是當用x-光粉末衍射分析測定時，經在120℃下真空乾燥獲得的本發明的環四糖(五到六水合物)的無水晶體粉末的x-光衍射光譜。
圖52是當用熱重量分析測定時，本發明的無水環四糖粉末的熱重量分析曲線。
實施本發明的最好方式以下是產生本發明的新的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的菌株C9，菌株C11，菌株N75以及菌株A19的鑑定結果，鑑定試驗按照日本科學學會出版社(日本東京)出版(1985)的由Takeji Hasegawa編輯的「Biseibutsu-no-Bunrui-to-Dotei」(微生物的分類和鑑定方法)中描述的方法進行。菌株C9A.形態學當在27℃在營養肉湯瓊脂上培養時的細胞特徵通常以0.5-1.0×1.5-5μm棒形存在，不表現出任何多態性，具有運動性，形成胞內一端球形孢子和膨脹的孢子囊，並且革蘭氏染色陽性；B.培養性質(1)在27℃在營養肉湯瓊脂平板上培養時形成的菌落的特徵形狀在兩天培養後具有1-2毫米直徑的環形菌落邊緣全緣隆起半球形光澤暗淡表面光滑顏色不透明和淡黃色(2)在27℃在營養肉湯瓊脂斜面培養時形成的菌落的特徵；生長中等程度形狀放射狀(3)在27℃在營養肉湯瓊脂平板上穿刺培養時形成的菌落的特徵；液化瓊脂平板。C.生理學性質(1)VP-試驗 陰性(2)吲哚形成 陰性(3)從硝酸形成氣體 陽性(4)澱粉水解 陽性(5)色素形成 不形成任何可溶性色素(6)脲酶 陽性(7)氧化酶 陽性(8)過氧化氫酶 陽性(9)生長條件 在5.5-9.0的pH和10-35℃的溫度下生長(10)需氧 需氧的(11)碳源利用和酸形成碳源 利用 酸形成D-葡萄糖 + +甘油 + +蔗糖 + +乳糖 + +注符號″+″意指是的或陽性。
(12)DNA的鳥嘌呤(G)加胞嘧啶(C)百分含量40％參照伯傑氏系統細菌學手冊，第二卷(1986)，將這些細菌學性質與已知微生物的那些性質比較。結果揭示出所述的微生物被鑑定為圓孢芽孢桿菌物種的微生物。該微生物具有沒有在任何文獻中公開的下列特徵形成α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶(其從澱粉部分水解物產生α-異麥芽糖基葡糖基糖)和α-異麥芽糖基轉移酶(其通過轉移α-異麥芽糖基殘基由α-異麥芽糖基葡糖基糖產生環四糖)兩者。
基於這些結果，本發明發明人將這一微生物命名為″圓孢芽孢桿菌C9″，於2000年4月25日將其保藏在國立高級產業科學和技術研究所國際專利生物保藏中心(International Patent Organism DepositaryNational Institute of Advanced Industrial Science and Technology)(Tsukuba Central 6，1-1，Higashil-Chome Tsukuba-shi，Ibarakiken，305-8566，日本)。該微生物的保藏在同一天由該單位以保藏號FERMBP-7143接受。菌株C11A.形態學當在27℃在營養肉湯瓊脂上培養時的細胞特徵通常以0.5-1.0×1.5-5μm棒形存在，不表現出任何多態性，具有運動性，形成胞內一端球形孢子和膨脹的孢子囊，並且革蘭氏染色陽性；B.培養性質(1)在27℃在營養肉湯瓊脂平板上培養時形成的菌落的特徵形狀在兩天培養後具有1-2毫米直徑的環形菌落邊緣全緣隆起半球形光澤暗淡表面平滑顏色不透明和淡黃色(2)在27℃在營養肉湯瓊脂斜面培養時形成的菌落的特徵；生長中等程度形狀放射狀(3)在27℃在營養肉湯瓊脂平板上穿刺培養時形成的菌落的特徵；
液化瓊脂平板。C.生理學性質(1)VP-試驗 陰性(2)吲哚形成 陰性(3)從硝酸形成氣體 陽性(4)澱粉水解 陽性(5)色素形成 不形成任何可溶性色素(6)脲酶 陽性(7)氧化酶 陽性(8)過氧化氫酶 陽性(9)生長條件 在5.5-9.0的pH和10-35℃的溫度下生長(10)需氧 需氧的(11)碳源利用和酸形成碳源 利用酸形成D-葡萄糖++甘油++蔗糖++乳糖++注符號″+″意指是的或陽性。
(12)DNA的鳥嘌呤(G)加胞嘧啶(C)百分含量39％參照伯傑氏系統細菌學手冊，第二卷(1986)，將這些細菌學性質與已知微生物的那些性質比較。結果揭示出所述的微生物被鑑定為圓孢芽孢桿菌物種的微生物。該微生物具有沒有在任何文獻中公開的下列特徵形成α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶(其從澱粉部分水解物產生α-異麥芽糖基葡糖基糖)和α-異麥芽糖基轉移酶(其通過轉移α-異麥芽糖基殘基由α-異麥芽糖基葡糖基糖產生環四糖)兩者。
基於這些結果，本發明發明人將這一微生物命名為″圓孢芽孢桿菌C11″，於2000年4月25日將其保藏在國立高級產業科學和技術研究所國際專利生物保藏中心(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi l-ChomeTsukuba-shi，Ibarakiken，305-8566，日本)。該微生物的保藏在同一天由該單位以保藏號FERM BP-7144接受。菌株N75A.形態學當在27℃在營養肉湯瓊脂上培養時的細胞特徵通常以0.5-1.0×1.5-5μm棒形存在，不表現出任何多態性，具有運動性，形成胞內一端球形孢子和膨脹的孢子囊，並且革蘭氏染色陽性；B.培養性質(1)在27℃在營養肉湯瓊脂平板上培養時形成的菌落的特徵形狀在兩天培養後具有1-2毫米直徑的環形菌落邊緣全緣隆起半球形光澤暗淡表面平滑顏色不透明和淡黃色(2)在27℃在營養肉湯瓊脂斜面培養時形成的菌落的特徵；生長中等程度形狀放射狀(3)在27℃在營養肉湯瓊脂平板上穿刺培養時形成的菌落的特徵；液化瓊脂平板。C.生理學性質(1)VP-試驗 陰性(2)吲哚形成 陰性(3)從硝酸形成氣體 陽性(4)澱粉水解 陽性(5)色素形成 不形成任何可溶性色素(6)脲酶 陰性(7)氧化酶 陽性(8)過氧化氫酶 陽性
(9)生長條件 在5.7-9.0的pH和10-35℃的溫度下生長(10)需氧 需氧的(11)碳源利用和酸形成碳源利用酸形成D-葡萄糖 ++甘油 ++蔗糖 ++乳糖 ++注符號″+″意指是的或陽性。
(12)DNA的鳥嘌呤(G)加胞嘧啶(C)百分含量 40％參照伯傑氏系統細菌學手冊，第二卷(1986)，將這些細菌學性質與已知微生物的那些性質比較。結果揭示出所述的微生物被鑑定為圓孢芽孢桿菌物種的微生物。該微生物具有沒有在任何文獻中公開的下列特徵形成α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶(其從澱粉部分水解物產生α-異麥芽糖基葡糖基糖)和α-異麥芽糖基轉移酶(其通過轉移α-異麥芽糖基殘基由α-異麥芽糖基葡糖基糖產生環四糖)兩者。
基於這些結果，本發明發明人將這一微生物命名為″圓孢芽孢桿菌N75″，於2001年5月16日將其保藏在國立高級產業科學和技術研究所國際專利生物保藏中心(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi l-ChomeTsukuba-shi，Ibarakiken，305-8566，日本)。該微生物的保藏在同一天由該單位以保藏號FERM BP-7591接受。菌株A19A.形態學(1)當在27℃在營養肉湯瓊脂上培養時的細胞特徵通常以0.4-0.8×1.0-4.0μm棒形存在，表現出多態性，不具有運動性，不形成胞子，並且革蘭氏染色陽性；(2)當在27℃在EYG瓊脂平板上培養時的細胞特徵表現出桿菌和球菌的生長循環B.培養性質
(1)在27℃在營養肉湯瓊脂平板上培養時形成的菌落的特徵形狀在一天培養後具有2-3毫米直徑的環形菌落邊緣全緣隆起半球形光澤暗淡表面平滑顏色不透明和淡黃色(2)在27℃在營養肉湯瓊脂斜面培養時形成的菌落的特徵；生長中等程度形狀絲狀(3)在27℃在營養肉湯瓊脂平板上穿刺培養時形成的菌落的特徵；不液化瓊脂平板。C 生理學性質(1) 澱粉水解 陰性(2) 色素形成 不形成可溶性色素(3) 脲酶 陽性(4) 氧化酶 陽性(5) 過氧化氫酶 陽性(6) 氧需求 需氧的(7) 細胞壁的主要二胺基酸 賴氨酸(8) 細胞壁的肽聚糖型 賴氨酸-丙氨酸(9) 細胞壁的N-醯基類型 乙醯基(10)細胞壁的糖組份 半乳糖，葡萄糖，鼠李糖以及甘露糖(11)維生素需求 陰性(12)DNA的鳥嘌呤(G)加胞嘧啶(C)百分含量62％(13)DNA-DNA同源性當與球形節桿菌ATCC 8010比較時，具有66.5％的DNA-DNA同源性參照伯傑氏系統細菌學手冊，第二卷(1986)，將這些細菌學性質與已知微生物的那些性質比較。結果揭示出所述的微生物被鑑定為球形節桿菌物種的微生物。該微生物具有沒有在任何文獻中公開的下列特徵形成α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶(其從澱粉部分水解物產生α-異麥芽糖基葡糖基糖)和α-異麥芽糖基轉移酶(其通過轉移α-異麥芽糖基殘基由α-異麥芽糖基葡糖基糖產生環四糖)兩者。
基於這些結果，本發明發明人將這一微生物命名為″球形節桿菌A19″，於2001年5月16日將其保藏在國立高級產業科學和技術研究所國際專利生物保藏中心(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi l-ChomeTsukuba-shi，Ibarakiken，305-8566，日本)。該微生物的保藏在同一天由該單位以保藏號FERM BP-7590接受。
在本發明中，可以適當地使用芽孢桿菌屬(Bacillus)，節桿菌屬(Arthrobacter)和其它屬的任何微生物以及它們的突變體，只要它們形成α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶。通過以本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的物理化學性質為指徵，利用用於微生物篩選的常規方法，這些微生物可以容易地篩選到。
來源於節桿菌屬微生物(在下文中稱為″菌株S1″)(本發明發明人從Okayama-shi，Okayama，日本，土壤中分離到)的α-異麥芽糖基轉移酶可以作為α-異麥芽糖基轉移酶有利地用於本發明，這種酶從α-異麥芽糖基葡糖基糖通過轉移α-異麥芽糖基殘基產生環四糖。鑑定試驗按照日本科學學會出版社(日本東京)出版(1985)的由Takeji Hasegawa編輯的「Biseibutsu-no-Bunrui-to-Dotei」(微生物的分類和鑑定方法)中描述的方法進行。菌株S1A.形態學(1)當在27℃在營養肉湯瓊脂上培養時的細胞特徵通常以0.3-0.7×0.8-3.5μm棒形存在，表現出多態性，不具有運動性，不形成胞子，並且革蘭氏染色陽性；(2)當在27℃在EYG瓊脂平板上培養時的細胞特徵表現出桿菌和球菌的生長循環B.培養性質
(1)在27℃在營養肉湯瓊脂平板上培養時形成的菌落的特徵形狀在一天培養後具有2-3毫米直徑的環形菌落邊緣全緣隆起半球形光澤暗淡表面平滑顏色不透明和淡黃色(2)在27℃在營養肉湯瓊脂斜面培養時形成的菌落的特徵；生長中等程度形狀絲狀(3)在27℃在營養肉湯瓊脂平板上穿刺培養時形成的菌落的特徵；不液化瓊脂平板。C 生理學性質(1) 澱粉水解 陰性(2) 色素形成 不形成可溶性色素(3) 脲酶 陽性(4) 氧化酶 陽性(5) 過氧化氫酶 陽性(6) 氧需求 需氧的(7) 細胞壁的主要二胺基酸 賴氨酸(8) 細胞壁的肽聚糖型 賴氨酸-丙氨酸(9) 細胞壁的N-醯基類型 乙醯基(10) 細胞壁的糖組份半乳糖，葡萄糖，鼠李糖以及甘露糖(11) 維生素需求 陰性(12) DNA的鳥嘌呤(G)加胞嘧啶(C)百分含量65％(13) DNA-DNA同源性當與分枝節桿菌(Arthrobacter ramosus)ATCC 13727比較時，具有84.4％的DNA-DNA同源性參照伯傑氏系統細菌學手冊，第二卷(1986)，將這些細菌學性質與已知微生物的那些性質比較。結果揭示出所述的微生物被鑑定為分枝節桿菌種的微生物。該微生物具有沒有在任何文獻中公開的下列特徵形成α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶(其從澱粉部分水解物產生α-異麥芽糖基葡糖基糖)和α-異麥芽糖基轉移酶(其通過轉移α-異麥芽糖基殘基由α-異麥芽糖基葡糖基糖產生環四糖)兩者。
基於這些結果，本發明發明人將這一微生物命名為″分枝節桿菌S1″，於2001年5月16日將其保藏在國立高級產業科學和技術研究所國際專利生物保藏中心(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi l-ChomeTsukuba-shi，Ibarakiken，305-8566，日本)。該微生物的保藏在同一天由該單位以保藏號FERM BP-7592接受。
在本發明中，分枝節桿菌S1的任何突變體都可以適當地用於本發明，只要它形成α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶。通過以可用於本發明的α-異麥芽糖基轉移酶的物理化學性質為指徵，利用用於微生物篩選的常規方法，這樣的突變體可以容易地篩選到。
任何營養培養基都可以用於本發明，只要上述微生物在其中可以生長並產生α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶；可以任意使用合成的和天然的營養培養基。在本發明中有用的碳源是微生物為其生長而同化的那些這樣的例子是來源於植物的澱粉和植物糖原；來源於動物和微生物的糖原和支鏈澱粉；糖，如葡萄糖，果糖，乳糖，蔗糖，甘露糖醇，山梨糖醇以及糖蜜；和有機酸，如檸檬酸和琥珀酸。這些碳源在營養培養基中的濃度依據它們的種類適當地改變。在本發明中有用的氮源是，例如，無機氮化合物，如銨鹽和硝酸鹽；和含有機氮的物質，如尿素，玉米漿，酪蛋白，蛋白腖，酵母提取物以及牛肉膏。在本發明中有用的無機組份是，例如，鈣鹽，鎂鹽，鉀鹽，鈉鹽，磷酸鹽以及錳，鋅，鐵，銅，鉬以及鈷的其它鹽。如果必要，胺基酸和維生素可以適當地組合使用。
用於本發明的微生物在需氧條件下，通常在4-40℃的溫度範圍內，更優選地，在20-37℃範圍內，在4-10的pH下，更優選地，在5-9的pH下培養。用於本發明的培養時間設定為微生物的生長起始所要求的時間或更長，優選地為10-150小時。在營養培養基中的溶氧濃度(DO)無具體限制，但通常在0.5-20ppm範圍內，並且其可以藉助於控制通氣水平，攪拌，增加氧到空氣中以及增加發酵罐內部壓力保持在所述範圍內。培養自由地以分批或連續方式進行。
在微生物培養完成之後，收集本發明的酶。因為酶的活性在細胞和無細胞培養液兩者中發現，後者可被收集作為粗酶溶液而且完整的培養液可以用作粗酶溶液。常規的液-固分離方法可以用於從培養物除去細胞；離心培養液，用塗布濾膜，帶有平面濾膜或空心纖維的濾器過濾培養液的方法可以適當地用來從培養液除去細胞。如上所述，無細胞培養液可以用作粗酶溶液，然而，它們可以在使用之前用硫酸銨鹽析，丙酮和醇沉澱，真空濃縮，平面膜和中空纖維濃縮來濃縮。
包含本發明的酶的無細胞溶液和它們的濃縮物可以完整使用，或者在用常規方法使酶固定後使用。在這種情況下，例如，利用離子交換劑的綴合方法，利用樹脂和膜的共價鍵合/吸附方法以及利用高分子量物質的包含方法都可以適當地使用。
酶溶液通常包含本發明α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶。如果必要，可以在用常規方法分離/純化之後使用本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶。作為例子，根據本發明的電泳同質α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶可以這樣獲得將培養液中的酶鹽析成濃縮物，透析濃縮的粗酶，通過採用樹脂「SEPABEADS FP-DA13」的陰離子交換柱色譜，採用「SEPHACRYL HR S-200」的親和色譜，採用「BUTYL-TOYOPEARL 650M」的疏水色譜以及採用「SEPHACRYL HR S-200」的親和色譜的順序色譜純化透析的溶液。
本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶具有特徵性的物理化學性質，即它可從具有至少為2的葡糖聚合度並且在非還原端具有作為連接鍵的α-1，4糖苷鍵(glucosidic linkage)的原料糖，經由α-葡糖基轉移形成如下糖，該糖具有至少為3的葡糖聚合度，並且具有作為非還原端連接鍵的α-1，6糖苷鍵和作為非還原端連接鍵以外的連接鍵的α-1，4糖苷鍵兩者，而實質上不增加原料糖還原力；所說的酶不具有形成葡聚糖的能力；並且受EDTA(乙二胺四乙酸)抑制。更具體地說，該酶具有以下顯示的物理化學性質；具有至少為2的葡糖聚合度並且在非還原端具有作為連接鍵的α-1，4糖苷鍵的糖包括，例如，選自下組的一種或多種糖麥芽寡糖，麥芽糖糊精，澱粉糊精，直鏈澱粉，支鏈澱粉，可溶性澱粉，膠化澱粉以及糖原(1)活性經葡基從具有至少為2的葡糖聚合度並且在非還原端具有作為連接鍵的α-1，4糖苷鍵的糖形成如下糖，後者具有至少為3的葡糖聚合度，並且具有作為非還原端連接鍵的α-1，6糖苷鍵和作為非還原末端連接鍵以外的連接鍵的α-1，4糖苷鍵兩者，而實質上不增加原料糖還原力；(2)分子量當在SDS-PAGE上測定時，具有約74,000到約160,000道爾頓的分子量；(3)等電點(pI)當用兩性電解質在等電聚焦電泳(isoelectrophoresis)上測定時，具有約3.8到約7.8的等電點。
(4)最適溫度當在pH 6.0下溫育60分鐘時，具有約40℃到約50℃的最適溫度；當存在1mM Ca2+在pH 6.0下溫育60分鐘時，具有約45℃到約55℃的最適溫度；當在pH 8.4下溫育60分鐘時，具有60℃的最適溫度；當存在1mM Ca2+在pH 8.4下溫育60分鐘時，具有65℃的最適溫度；(5)最適pH當在35℃溫育60分鐘時，具有約6.0到約8.4的最適pH；(6)熱穩定性當在pH 6.0下溫育60分鐘時，具有約45℃或更低溫度的熱穩定區；當存在1mM Ca2+在pH 6.0下溫育60分鐘時，具有約50℃或更低溫度的熱穩定區；當在pH 8.0下溫育60分鐘時，具有約55℃或更低溫度的熱穩定區；當存在1mM Ca2+在pH 8.0下溫育60分鐘時，具有約60℃或更低溫度的熱穩定區；
(7)pH穩定性當在4℃溫育24小時時，具有在約4.5到約10.0的pH穩定區。
(8)N-末端胺基酸序列酪氨酸-纈氨酸-絲氨酸-絲氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬醯胺-亮氨酸-異亮氨酸，組氨酸-纈氨酸-絲氨酸-丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬醯胺-亮氨酸-亮氨酸，丙氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-纈氨酸-穀氨醯胺-精氨酸-丙氨酸-穀氨醯胺-苯丙氨酸-穀氨醯胺-絲氨酸-甘氨酸。
本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶有用的底物包括具有1，4-糖苷鍵的多糖，如澱粉，支鏈澱粉，直鏈澱粉和糖原；以及可由用澱粉酶，酸，等部分水解上述多糖獲得的澱粉部分水解物，如澱粉糊精，麥芽糖糊精以及麥芽寡糖。這些具有α-葡糖苷連接鍵的葡糖基糖可以進一步用分支酶(EC 2.4.1.18)，例如底物的分支酶處理。用澱粉酶處理的葡糖基糖的澱粉部分水解物的例子是用如在《澱粉酶和相關酶手冊》(Pergamon出版社，日本東京(1988)出版)中公開的α-澱粉酶(EC3.2.1.1)，β-澱粉酶(EC 3.2.1.2)，麥芽三糖形成酶(EC 3.2.1.116)，麥芽四糖形成酶(EC 3.2.1.60)，麥芽五糖形成酶，和麥芽六糖形成澱粉酶(EC 3.2.1.98)水解的那些。在製備澱粉部分水解物的情況下，可以任意使用脫支酶，如支鏈澱粉酶(EC 3.2.1.41)和異澱粉酶(EC 3.2.1.68)。
作為底物的澱粉包括來源於農作物的地上澱粉，如玉米，小麥以及稻米澱粉；以及地下澱粉，如土豆，甜土豆以及木薯澱粉。更優選地，這些澱粉使用時被膠化和/或液化成液態形式。部分水解程度越低，環四糖的產率越高，因此，DE設定到約20的水平或更低，優選地，約12或更低以及更優選地，約5或更低。
本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的轉移反應的受體包括了上述底物本身，單糖如葡萄糖，木糖，半乳糖，果糖，阿拉伯糖，巖藻糖，山梨糖以及N-乙醯氨基葡萄糖；寡糖如海藻糖，異麥芽糖，異麥芽三糖，纖維二糖，龍膽二糖，乳糖以及蔗糖；以及其它如麥芽糖醇和L-抗壞血酸。
底物的濃度沒有特別限定，本發明的酶促反應甚至在低至0.1％(w/w)(此後在本說明書中，「％(w/w)」縮寫為「％」，除非有特別註明)的濃度下進行，然而，百分之一或更高的濃度是用於工業規模產生優選地的。底物溶液可以是以懸浮液形式的那些，其包含不完全溶解的不溶性底物。底物濃度優選地是40％或更低，更優選地是30％或更低。
用於本發明的酶促反應的溫度是進行酶促反應的那些，即，不超過約65℃的那些，更優選地是約30℃到約55℃。用於酶促反應的pH通常設定為4.5-10，優選地約5.5到約9。用於酶促反應的時間可以依據酶促反應效率適當被設定。
通過將由上述酶促反應形成的α-異麥芽糖基葡糖基糖與α-異麥芽糖基轉移酶接觸，環四糖以令人滿意產率產生。可以使α-異麥芽糖基轉移酶在上述作用並且滅活本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶後作用在底物上。優選地，這些α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶可以組合使用，以便促進從澱粉或其部分水解物以約30％(d.s.b.)或更高的高產率產生環四糖以及以約80％(d.s.b.)，或更高的產率從糖原產生環四糖。基於兩種酶的反應性質，可以按下述估計上述結合使用的的環四糖的形成機制(1)本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶作用在如下糖的非還原端的α-1，4葡糖基殘基上，以釋放葡萄糖殘基，所說的糖具有至少兩個葡萄糖聚合併且在非還原端具有作為連接鍵的α-1，4糖苷鍵，如澱粉，糖原以及澱粉部分水解物；然後釋放的葡萄糖殘基分子間轉移到其它糖的葡萄糖C-6上的羥基基團上，形成在非還原端具有α-異麥芽糖基殘基的糖；(2)α-異麥芽糖基轉移酶作用於在非還原端具有α-異麥芽糖基殘基的糖，然後分子間把此殘基轉移到在非還原端具有α-異麥芽糖基殘基的其它糖的葡萄糖殘基C-3上的羥基基團上，形成在非還原端具有異麥芽糖基-1，3-異麥芽糖基殘基的糖；(3)α-異麥芽糖基轉移酶作用於在非還原端具有異麥芽糖基-1，3-異麥芽糖基殘基的糖，以便通過分子間轉移作用從糖釋放異麥芽糖基-1，3-異麥芽糖基殘基，然後環化所釋放的異麥芽糖基-1，3-異麥芽糖基糖成為環四糖；以及(4)通過步驟(1)(3)，環四糖從所產生的沒有異麥芽糖基-1，3-異麥芽糖基殘基的糖形成，通過依次重複步驟(1)到(3)，環四糖的產率高度提高。
如上所解釋的，可以估計，當組合使用時，本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶重複作用在它們的底物上，以增加環四糖的產率。
在環四糖形成反應期間，其它糖轉移酶任選可以有利地組合使用，以改進環四糖的產率；當使兩種類型的酶，即，α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶作用在，例如，約15％的澱粉部分水解物溶液上時，環四糖以約55％的產率產生，而使用三種類型的酶，即，α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶以及環麥芽糖糊精葡聚糖轉移酶(cyclomaltodextrin glucanotransferase)時，在與以上相同的條件下，增加環四糖的最大產率約5-10％，達到約60-65％的改進的產率。
在形成的環麥芽糖糊精的情況下，可以通過使用微生物的培養方法產生，所說的微生物能夠產生α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶兩者，所說的轉移酶特異性地水解由α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶形成的α-異麥芽糖基葡糖基糖的α-異麥芽糖基部分和其餘α-葡糖基糖部分之間的連接鍵，並把釋放的α-異麥芽糖基部分轉移到受體。
作為用於上述使用微生物的方法的培養基，任何合成或天然培養基都可以使用，只要它們含有具有至少為2的葡糖聚合度和在非還原端具有作為連接鍵的α-1，4糖苷鍵的糖，並且其中微生物可以生長。至於其它培養微生物的條件，可以使用用來形成本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的那些。
通過上述酶促反應與培養獲得的培養物可以完整地作為包含環四糖或環四糖糖組合物的溶液使用。一般來說，在使用之前，可以採用單獨或組合的下列純化方法對它們進行純化活性炭脫色，H或OH形式的離子交換樹脂脫鹽以及柱色譜如離子交換柱色譜，用活性炭的柱色譜以及矽膠柱色譜，用有機溶劑如醇和丙酮的分離，採用適當的可分離性的膜分離，使用酶(如澱粉酶，包括α-澱粉酶，β-澱粉酶，葡糖澱粉酶(EC3.2.1.3)以及α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20))的剩餘糖水解，通過酵母發酵或鹼處理除去剩餘糖的水解。
特別是，離子交換柱色譜優選地用作工業規模的產生方法；強酸性陽離子交換樹脂柱色譜，公開於如日本專利公開23,799/83和72,598/83中。用柱色譜，汙染糖可以除去，以便有利地產生具有改進含量目標糖的環四糖或包含它的糖組合物。在這種情況下，固定床，移動床以及半移動床方法可以適當使用。
所產生的環四糖與包含它的糖組合物可以適當地濃縮成糖漿產品，並任選地將它們進一步乾燥成粉狀產品。
為了產生環四糖晶體，例如，在95℃或更低的溫度下，優選地在10-90℃溫度下，在0.1-20％d.s.b環四糖晶體種子存在時，將具有約30-90％濃度和約至少50％純度環四糖的高環四糖含量溶液置於結晶罐(任選存在有機溶劑)中，然後在攪拌下逐漸冷卻，以獲得糖膏(massecuites)。收集環四糖晶體和具有這樣的晶體的糖漿的方法包括，例如，常規方法，如分離，塊粉碎，流態化粒化和噴霧乾燥法。
根據本發明所產生的環四糖是穩定的，高質量的，低甜度，非還原性白色粉末，甚至與下列物質混合或加工時幾乎沒有褐變，無氣味，不變質該物質特別是，例如含胺基酸的物質，如胺基酸，寡肽以及蛋白質。
因為環四糖具有包含能力，它有效地抑制風味組份和有效組份擴散和變質，並且穩定地保持它們。為了這一目的，如果必要，組合使用環四糖和其它環狀糖，如環糊精，分支環糊精，環葡聚糖以及環果聚糖，可以有利地改進環四糖包含能力的水平。在本發明中有用的上述環狀糖，如環糊精不應該限定成具有高純度的那些，並且可以有利地是相對低純度的環四糖，如包含大量麥芽糖糊精與環糊精的澱粉部分水解物。
因為環四糖不被澱粉酶和α-葡萄糖苷酶水解，所以，當口頭使用時，它實質上不被身體同化。該糖實質上也不被腸道微生物同化，因此它可以用作非常低熱量的水溶性飲食纖維。環四糖實質上也可以用作甜味劑，基本上不造成齒齲，因為它簡直不被齒齲誘導微生物同化。該糖抑制粉狀產品的粘著和凝固。本發明的環四糖本身是一種具有滿意穩定性而無毒性、害處和副作用的天然甜味劑，並且因為這些，其可以有利地用於片劑、糖衣片劑，與賦形劑，例如支鏈澱粉，羥乙基澱粉和聚乙烯吡咯烷酮組合。此外，環四糖具有控制滲透能力的性質，填充能力，賦予光澤能力，保溫能力，粘性，對其它糖的結晶阻止能力，無實質上的可發酵性等等。
這樣，本發明的環四糖和包含它的糖組合物在各種組合物，如食品，菸草，香菸，飼料，寵物食品，化妝品以及藥物中，可以任意用作甜味劑，味道改善劑，質量改善劑，穩定劑，脫色預防劑，賦形劑，等等。
本發明的環四糖和包含它的糖組合物可以與一種或多種其它甜味劑結合使用，例如，粉化的糖漿，葡萄糖，異構化糖，蔗糖，麥芽糖，海藻糖，蜂蜜，楓樹糖，山梨糖醇，麥芽醇，二氫查耳酮，斯替維苷，α-葡基斯替維苷，Momordica grosvenori甜味劑，甘草甜素，祝馬丁，L-天冬氨醯基L-苯丙氨酸甲基酯，糖精，丁磺氨K，sucralose，甘氨酸以及丙氨酸；以及填料如糊精，澱粉以及乳糖。特別是，環四糖和包含它的糖組合物可以適當地與一種或多種低熱甜味劑，如內消旋赤蘚糖醇，木糖醇以及麥芽糖醇組合用作低熱甜味劑，飲食甜味劑等；或者與一種或多種相對高甜度的甜味劑，如α-葡糖基斯替維苷，祝馬丁，L-天冬氨醯基L-苯丙氨酸甲基酯，糖精，丁磺氨K以及sucralose結合使用。
本發明的環四糖和包含它的糖組合物可以任意地原封不動地使用，或者在與填料、賦形劑，結合劑等混合後，並形成具有不同形狀，如顆粒，球體，平板，立方體以及片狀的產品後使用。
本發明的環四糖和包含它的糖組合物與其它具有酸味，酸性，鹹味，美味，澀性以及苦味的有味物質很好地調好；並且具有令人滿意的高酸和熱耐受性。這樣，它們可以極好地用作甜味劑，味道改善劑，質量改善劑，等等，以增甜和/或改進一般食品的味道和質量，這些食品例如，醬油，粉狀醬油，味噌，″funmatsu-味噌″(一種粉狀味噌)，″moromi″(一種精煉的清酒)，″hishio″(一種精煉的醬油)，″furikake″(一種熟化的魚粉)，蛋黃醬，調味品，醋，″sanbai-zu″(一種糖調味汁，醬油和醋)，″funmatsu-sushi-su″(sushi的粉狀醋)，″chuka-nomoto″(一種中國魚的即時混合物)，″tentsuyu″(日本深度脂肪油炸食品的調味汁)，″mentsuyu″(日本細麵條調味汁)，調味汁，醬，″yakinik-no-tare″(日本烤肉的調味汁)，咖哩roux，即時燉湯混合物，即時湯混合，″dashi-no-moto″(一種即時儲備混合物)，混合調味品，″mirin″(一種甜餅)，″shin-mirin″(一種合成的mirin)，片狀糖以及咖啡糖。
本發明的環四糖和包含它的糖組合物也可以任意地用於下列食品的增甜和/或改進味道和質量″Wagashi″(日本蛋糕)，如″senbei″(稻米餅乾)，″arare″(稻米蛋糕塊)，″okoshi″(小米和稻米蛋糕)，″gyuhi″(澱粉糊狀物)，″mochi″(稻米糊狀物)和等，″manju″(具有豆果醬的小麵包)，″ufro″(一種甜稻米果子凍)，″an″(大豆醬)等，″yokan″(一種大豆的甜果子凍)，″mizu-yokan″(一種軟adzuki豆果子凍)，″kingyoku″(一種yokan)，果凍，pao de Castella以及″amedama″(一日本太妃糖)；西方糕餅，如小麵包，餅乾，小甜點，餡餅，布丁，黃油奶油，乳蛋糕奶油，奶油蓬鬆餅，華夫餅乾，海綿蛋糕，油炸圈餅，巧克力，咀嚼樹膠，焦糖糖果，奶油杏仁糖以及冰糖；凍結甜食，如冰激凌與sherbet；糖漿，如″kajitsu-no-syrup-zuke″(一種保存的水果)和″korimitsu″(削刮冰的糖漿)；糊狀物，如麵粉糊狀物，花生糊狀物以及水果糊狀物；加工的水果和蔬菜，如果醬，″syrup-zuke″(泡菜水果)以及″toka″(保存的)；泡菜和鹽漬產品，如″fukujin-zuke″(紅色小蘿蔔泡菜)，″bettarazuke″(一種整株新鮮小蘿蔔泡菜)，″senmai-zuke″(一種片塊新鮮小蘿蔔泡菜)以及″rakkyo-zuke″(鹽漬冬蔥)；泡菜和鹽漬產品的預混合，如″takuan-zuke-no-moto″(一種鹽漬小蘿蔔預混合物)以及″hakusai-zuke-no-moto″(一種新鮮白油菜泡菜預混合物)；肉產品，如火腿與香腸；魚肉產品，如魚火腿，魚香腸，″kamaboko″(一種蒸魚糊狀物)，″chikuwa″(一種魚糊狀物)以及″tenpura″(一種日本深度脂肪油炸魚糊狀物)；″chinmi″(調味品)，如″uni-no-shiokara″(海頑童鹽腸)，″ika-noshiokara″(槍烏賊的鹽腸)，″su-konbu″(加工過的昆布)，″saki-srume″(乾燥的槍烏賊帶)，″fugu-no-mirin-boshi″(乾燥的mirin-seasoned河豚)，熟化魚粉，如太平洋鱈，海鯉科食用魚，小蝦，等的；″tsukudani″(在醬油中煮沸的食品)，如紫菜類，可食用的野植物，乾燥槍烏賊，小魚以及牡蠣；日常菜，如″nimame″(烹調的大豆)，馬鈴薯色拉以及″konbu-maki″(昆布卷)；牛奶產品；罐裝和瓶裝產品，如肉，魚肉，水果以及蔬菜的那些；醇飲料，如合成的，發酵酒，sake，水果酒，發光醇飲料，啤酒；軟飲料，如咖啡，可可，汁液，碳酸鹽飲料，酸奶飲料以及包含乳酸菌的飲料；即時食品，如即時布丁混合物，即時熱蛋糕混合物，即時汁液或軟飲料，即時咖啡，″sokuseki-shiruko″(把adzuki豆湯與稻米蛋糕即時混合)以及即時湯混合物；以及其它食品和飲料，如嬰兒固體食品，食療食品，健康/滋補飲料，肽類食品以及凍結食品。本發明的環四糖和包含它的糖組合物可以任意延長或保持新鮮烤制日本和西方糖食的味道與風味，並改進動物和寵物如家養動物，家禽，蜂蜜蜜蜂，蠶以及魚的飼料和寵物食品的口味；而且，它們也可以任意作為甜味劑，味道改善劑，調味劑，質量改善劑和穩定劑以用在漿狀物或糊狀物形式的其它產品，如菸草，香菸，牙膏，口紅，胭脂，唇油，內服液態藥，片劑，錠劑，滴狀鱈肝油，軟糖，口服清涼劑，漱口劑，化妝品以及藥物中。當用作質量改善劑或穩定時，本發明的環四糖和包含它的糖組合物可以任意地用於易於喪失其有效組份與活性的生物學活性物質以及包含生物學活性物質的健康食品和藥物中。這樣的生物學活性物質的例子是包含淋巴因子，如α-，β-或γ-幹擾素，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，腫瘤壞死因子-β(TNF-β)，巨噬細胞遷移抑制因子，集落刺激因子，轉移因子以及白細胞介素2的液態製劑；包含激素如胰島素，生長激素，促乳素，紅細胞生成素以及卵泡刺激激素的液態製劑；生物學製劑如BCG疫苗，日本腦炎疫苗，麻疹疫苗，活小兒麻痺症疫苗，天花疫苗，破傷風類毒素，竹葉青屬抗毒素以及人類免疫球蛋白；抗生素如青黴素，紅黴素，氯黴素，四環素，鏈黴素以及卡那黴素硫酸鹽；包含維生素如硫胺素，核黃素，L-抗壞血酸，鱈肝油，類胡蘿蔔素，麥角甾醇以及生育酚的液態製劑；高度不飽和脂肪酸和其酯衍生物如EPA，DHA以及花生四烯酸；酶如脂肪酶，彈性蛋白酶，尿激酶，蛋白酶，β-澱粉酶，異澱粉酶，葡聚糖酶以及乳糖酶的溶液；抽提物如人參抽提物，猛海龜抽提物，小球藻屬抽提物，蘆薈抽提物以及蜂膠抽提物；以及蜂王漿。通過使用本發明的環四糖和包含它的糖組合物，上述生物學活性物質以及活微生物如病毒，乳酸菌以及酵母的其它漿狀物可以任意製備成液體，糊狀物，固形物形式的健康食品和藥物，其具有令人滿意的高穩定性和質量，不擔心喪失或失活其有效成份與活性。
如上所述，當與其它組份(一般外用)一起使用時，下列作用和特性也有效地發揮抑制揮發或保持芬芳和風味組份，抑制脫水收縮、其它糖的結晶以及蛋白質、脂質以及活性組份變質，保持溼潤以及穩定乳化狀態，其由環四糖和包含它的糖組合物發揮；以及穩定性和填料賦予能力的特性，其是環四糖和糖固有的。
類似於其它天然存在的糖，因為本發明的環四糖和包含它的糖組合物在使用到皮膚上時幾乎不刺激皮膚，在皮膚中有效地保持溼潤，所以它們可以有利地摻入到外用皮膚組合物中使用。在外用皮膚組合物中，本發明的環四糖和包括的糖組合物通常用於與下列一種或多種皮膚學上適用的其它組份適當地組合使用油和脂質，蠟，碳氫化合物，脂肪酸，酯，醇，表面活性劑，染料，香味劑，激素，維生素，植物抽提物，動物抽提物，微生物抽提物，鹽，紫外吸收劑，光致敏染料，抗氧劑，防腐劑/殺菌劑，止汗劑/防臭劑，提神劑，螯合劑，皮膚增白劑，抗炎劑，酶，糖，胺基酸以及增稠劑。例如，在化妝品領域中，外用皮膚組合物可以洗液膏，乳狀洗液，凝膠，粉末，漿狀物或者塊狀物的形式提供，例如，清潔化妝品，如肥皂，化妝皂，皮膚洗滌粉，洗面霜，洗面劑，身體香波，身體洗液，香波以及洗髮粉；頭髮化妝品，如成套洗劑，頭髮噴劑，潤髮油，髮乳，髮蠟，髮膠，發液，頭髮滋補劑，頭髮洗劑，生髮劑，頭髮染料，頭皮處理劑，頭髮化妝品，增光髮油，髮油以及梳頭油；基礎化妝品，如化妝洗劑，雪花膏，潤膚霜，潤膚洗劑，膠凍，膠凍擦劑，糊狀洗劑，粉末，清潔霜，冷霜，手霜，手洗劑，乳狀洗劑，保溼液，剃鬚前/後洗劑，剃鬚後霜，剃鬚後泡沫，剃鬚前霜以及嬰兒油形式的化妝盒；補充化妝品，如以液體，霜或固體形式的粉底，滑石粉，嬰兒粉，體粉末，香料粉，化妝基料，以霜，糊狀物，液體，固體或粉末形式的粉料，眼影，眼霜，睫毛油，眉筆，睫毛化妝品，口紅，口紅洗劑；芳香化妝品，如芳香劑，膏狀/粉狀芳香劑，科隆香水(eau deColognes)，香水Colognes以及香水(eau de toilette)；日曬和防曬化妝品如防曬霜，防曬洗劑以及防曬油；指甲化妝品，如修指甲材料，修腳材料，指甲顏料，指甲漆以及指甲化妝品材料；眼線膏化妝品；口紅和唇膏，如唇膏，唇油，糊狀胭脂以及唇上光劑；口腔化妝品，如牙膏和口洗滌劑；以及沐浴化妝品，如浴鹽/油以及沐浴化妝材料。在藥物領域中，外用皮膚組合物可以以溼敷布，噴射劑，敷貼劑，浴劑，粘著劑，軟膏，糊狀物，塗擦劑，洗劑以及泥敷劑的形式提供。
可以和環四糖和包含它的糖組合物一同摻入外用皮膚組合物的其它組份的具體例子是油和脂肪，包括在室溫下為液體形式的植物油，如鱷梨油，杏仁油，橄欖油，芝麻油，紅花油，大豆油，山茶油，桃仁油，蓖麻油以及棉子油；在室溫下為固體形式的植物脂肪，如可可脂肪，棕櫚脂/油以及植物蠟；以及動物油，如貂油，蛋黃油以及海龜油。
在本發明中有用的蠟的例子是，植物蠟如hohoba油，巴西棕櫚蠟以及小燭樹蠟；動物蠟如鯨蠟油，Baird’s槌鯨油，蜂蠟，鯨油以及羊毛脂；以及礦物油如褐煤蠟。
在本發明中有用的碳水化合物是，例如，礦物碳水化合物，如石蠟或固體石蠟，液態石蠟，地蠟，微晶蠟以及礦脂；以及動物碳氫化合物，如角鯊烷和角鯊烯。
在本發明中有用的脂肪酸的例子是月桂酸，豆蔻酸，棕櫚酸，硬脂酸，油酸，山嵛酸，十一碳烯酸，羊毛脂脂肪酸，硬羊毛脂脂肪酸，軟羊毛脂脂肪酸，異硬脂酸以及其衍生物。
在本發明中有用的醇類是，例如，高級醇，包括多元醇，如月桂醇，鯨蠟醇，seto十八烷醇，十八烷醇，油醇，二十二烷醇，羊毛脂醇，氫化羊毛脂醇，己基癸醇，辛基十二烷醇以及聚乙二醇；低級醇，包括多元醇，如乙醇，丙醇，異丙醇，丁醇，乙二醇，丙二醇以及甘油；以及它們的衍生物。
在本發明中有用的酯的例子是，月桂酸己基酯，豆蔻酸異丙基酯，豆蔻酸十四烷基酯，豆蔻酸鯨蠟基酯，豆蔻酸辛基十二烷基酯，棕櫚酸異丙基酯，硬脂酸丁基酯，膽甾醇硬脂酸酯，膽甾醇乙酸酯，膽甾醇n-乳酸酯，膽甾醇己酸酯，膽甾醇月桂酸酯，膽甾醇肉豆蔻酸酯，膽甾醇棕櫚酸酯，膽甾醇硬脂酸酯，膽甾醇12-羥基硬脂酸酯，油酸癸酯，油酸辛基十二烷基酯，羊毛脂脂肪酸異丙基酯，甘油三豆蔻酸酯，丙二醇二油酸酯，乳酸肉豆蔻基酯，乳酸鯨蠟基酯，羊毛脂乙酸酯，二甲基辛酸己基癸基酯以及它們的衍生物。
在本發明中有用的表面活性劑是，例如，陰離子表面活性劑，如月桂酸鋅，豆蔻酸鋅，棕櫚酸鋅，硬脂酸鎂，十二烷基硫酸鈉，聚氧乙烯月桂基醚硫酸鈉，三乙醇胺聚氧乙烯月桂基醚硫酸鹽，聚氧乙烯鯨蠟基醚磷酸鹽，聚氧乙烯烷基苯基醚磷酸鹽，N-十二烷基肌氨酸鈉，椰子脂肪酸肌氨酸三乙醇胺，椰子脂肪酸鈉甲基牛磺酸以及大豆磷脂；陽離子表面活性劑如氯化硬脂醯三甲基銨，氯化二硬脂醯二甲基銨，氯化苯甲烴銨，氯化鯨蠟基吡啶鎓，溴化烷基異喹啉鎓以及溴化十二烷基二甲基2-苯氧乙基銨；兼性離子表面活性劑如β-月桂基氨基丙酸鈉，甜菜鹼月桂基二甲基氨基乙酸酯以及2-烷基-N-羧甲基-N-羥乙基咪唑啉鎓甜菜鹼；非離子型表面活性劑如甘油一硬脂酸酯，自乳化的，甘油一硬脂酸酯，親脂的脫水山梨糖醇一月桂酸酯，脫水山梨糖醇一油酸酯，蔗糖脂肪酸酯，十一碳烯酸一乙醇胺，椰子油二乙醇胺，聚乙二醇一油酸酯，乳酸肉豆蔻基酯，乳酸鯨蠟基酯，聚氧乙烯鯨蠟基醚，聚氧乙烯辛基苯基醚，聚氧乙烯山梨糖醇一月桂酸酯，聚氧乙烯脫水山梨糖醇一月桂酸酯，聚氧乙烯脫水山梨糖醇一硬脂酸酯，聚氧乙烯脫水山梨糖醇三油酸酯，聚氧乙烯山梨糖醇四油酸酯，聚氧乙烯蓖麻油以及聚氧乙烯氫化蓖麻油；以及它們的衍生物。
在本發明中有用的染料例子是，紅焦油染料如，赤蘚紅，莧菜紅，玫瑰紅，酸性紅，色澱紅C，立索紅，若丹明，亮色澱紅，曙紅YS，紫胺R，亮堅牢深紅，麗春紅R，橙色焦油染料如二溴螢光素，永久橙，赤蘚紅黃NA以及橙色I；黃色焦油染料如酒石黃，晚霞黃，螢光素鈉，聯苯胺黃G，萘酚黃S以及黃AB；綠色焦油染料如固綠FCF，茜素菁藍綠F，淺綠SF黃以及萘酚綠B；藍色焦油染料如亮藍FCF，靛藍胭脂紅，靛藍，專利藍NA，carbanthrene藍以及蘇丹藍；棕色焦油染料如間苯二酚棕；紫色焦油染料如茜素紫；黑色焦油染料如萘酚藍黑；無機顏料，如氧化鋅，氧化鈦，氫氧化鈷，氫氧化鋁，滑石，陶土，雲母，皂土，紫羅蘭錳以及雲母鈦；類胡蘿蔔素顏料，如β-類胡蘿蔔素，番茄紅素以及藏紅花素；黃酮類顏料，如sisonine，藏紅花黃，芸香苷以及櫟精；黃素顏料，如核黃素；醌顏料，如胭脂蟲紅，茜素以及shikonin；以及它們的衍生物。
一般在外用皮膚用品中使用的香料粗略地可以分成天然植物以及動物香料，合成香料以及它們適當組合的混合物。動物香料的例子包括麝香，靈貓酮以及龍涎香。植物香料，例如，蒸溜物，即，可由蒸餾獲得精油，例如，用水蒸發茴香種子，羅勒葉，藏茴香果，肉桂皮，胡荽種子，燻衣草花，肉豆蔻種子，薄荷葉，玫瑰花，迷迭香花、種子及葉，以及麝香草葉；一般依據性質和方法分類成純淨物，樹脂狀物質，含油樹脂和酊劑的抽提物。合成香料的例子是苯乙酮，茴香醚，苄基醇，乙酸丁基酯，樟腦，檸檬醛，香茅醇，枯茗醛，蒿腦，乙基香蘭酮，醋酸香葉酯，linarol，薄荷醇，甲基對-甲酚，水楊酸甲基酯，乙酸苯基酯，香蘭素以及它們的衍生物。在本發明中，可以任意使用與以上所述香料適當組合的組合物。
在本發明中有用的激素包括，例如，卵泡激素如雌酮和雌二醇；促孕素，如孕甾酮和孕烯醇酮；以及腎上腺皮質激素如可的松，氫化可的松以及潑尼松龍。在本發明中有用的維生素是，例如，維生素A類化合物如視黃醇，視黃酸，α-，β-和γ-胡蘿蔔素以及它們的衍生物；維生素B類化合物如硫胺素(維生素B1)，核黃素(維生素B2)，維生素B6，包括吡哆醇，吡哆醛以及吡哆胺以及它們的衍生物；維生素C類化合物如L-抗壞血酸，2-O-α-D-葡糖基-L-抗壞血酸，L-抗壞血酸和葡糖基-L-抗壞血酸的醯基衍生物，別名親脂性維生素C，以及L-抗壞血酸的其它酸衍生物如L-抗壞血酸的硫酸酯；維生素D類化合物如麥角骨化醇，膽鈣化醇以及它們的衍生物；以及維生素E類化合物如α-，β-和γ-和δ-生育酚，α-，β-和γ-和δ-tocotrienol以及它們的衍生物。
除了以上提到的用作香料的植物抽提物之外，在本發明中有用的植物抽提物的例子是，抽提物如春黃菊，鼠尾草，蘆薈，深紅鼠尾草，Angelica keiskei，鱷梨樹，蕁麻，茴香，烏龍茶，coak樹皮，大麥，咖啡黃葵(Abelmoschus esculentus)，甜胡椒，海草，木瓜，甘草，溫桲子，梔子，Sasa albo-marginata，肉桂，紅茶，米糠，發酵米糠，Stevia rebaudiana，芹菜，日本綠色龍膽，大豆，麝香草，茶，普通山茶，日本當歸，玉米，胡蘿蔔，Rosa rugosa，hinoki(日本柏樹)，絲瓜，紅花，松樹，桃子，桉樹，爬行虎耳草，yuzu(圓佛手柑)，百合花，薏苡，艾類植物，Cyanophta(藍綠藻類)，海草，蘋果，粘質沙雷氏菌以及萵苣的那些；以及從植物分離的化合物如扁柏酚，甘菊環，葉綠素以及甘草甜素。在本發明中有用的動物抽提物包括胎盤抽提物。
微生物的抽提物的例子是酵母提取物。在本發明的外用皮膚組合物有用的鹽有利地包括可以一般用於常規外用皮膚組合物的那些以及海水，深海水，海水乾燥組份以及天然鹽，包括液體形式的那些，如礦物鹽。
在本發明中有用的紫外吸收劑包括，例如，對-氨基苯甲酸，對-二甲基氨基苯甲酸乙己基酯，對-甲氧基肉桂酸乙己基酯，2-(羥基-5-甲苯基)苯並三唑，oxibenzozone，尿刊酸，尿刊酸乙酯以及它們的衍生物；能夠遮蔽紫外線的有機物質如5-氯尿嘧啶以及鳥嘌呤胞嘧啶。在本發明中有用的光敏染料的例子是2，2』[3』-[2-(3-庚基-4-甲基-2-亞噻唑啉-2-基)亞乙基]亞丙烯基]雙[碘化3-庚基-4-甲基噻唑啉鎓]別名″PLATONIN″，碘化2-[2-(3-庚基-4-甲基-2-亞噻唑啉-2-基)次甲基]-3-庚基-4-甲基噻唑啉鎓別名″PIONIN″，6-[2-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]乙烯基]-1-乙基-2-甲基吡啶鎓別名″TAKANAL″，碘化2-(2-苯胺乙烯基)-3，4-二甲基-噁唑啉鎓″LUMINEX″以及其衍生物。
除上述具有抗氧化能力的化合物之外，在本發明中有用的抗氧劑包括，例如，沒食子酸丙酯，沒食子酸丁酯，沒食子酸辛酯，沒食子酸十二酯，去甲二氫愈創木酸(NDGA)，叔丁基羥基苯甲醚(BHA)，丁基化羥基甲苯(BHT)，4-羥基甲基-1-2，6-二叔丁基苯酚以及它們的衍生物。
除上述的具有滅菌或殺菌活性的化合物之外，在本發明中有用的防腐劑和殺菌劑的例子包括，酚類化合物如苯酚，對氯間甲酚，樹脂酚，對氧代苯甲酸以及甲酚；酸化合物包括以鹽形式的那些，如苯甲酸，山梨酸，水楊酸以及硼酸；滷化雙酚，如六氯苯，硫雙二氯酚以及二氯苯；醯胺如3，4，4』-三氯carvaniride，十一碳烯酸一乙醇胺；季銨化合物如氯化苯甲烴銨，氯化苄甲乙氧銨以及氯化decalinium；氯己定鹽酸鹽，1-羥基吡啶-2-硫酮，溶菌酶氯化物；以及它們的衍生物。
在本發明中有用的止汗劑/除臭藥是，例如，氯化鋁，氯化鋅，氯羥基鋁，鋁氯羥基尿囊素鹽，鋁二羥基尿囊素鹽以及鋁氯水合物。在本發明中有用的提神物的例子包括薄荷醇，薄荷/歐薄荷油，樟腦，百裡酚，螺烷醇以及甲基水楊酸。在本發明中有用的螯合劑，例如，乙二胺四乙酸的衍生物，三聚磷酸，六異丁烯酸，二氫乙基甘氨酸，檸檬酸，酒石酸，葡糖酸以及糖酸。
除上述具有皮膚增白活性的化合物之外，在本發明中有用的皮膚增白劑是，例如，核酸如反義寡核苷酸，包括酪氨酸酶基因的反義寡核苷酸；曲酸，乳酸，鄰氨基苯甲酸，香豆素，苯並三唑，咪唑啉，嘧啶，二噁唑，呋喃，吡喃酮，煙酸，熊果苷，貝加靈，貝加因，小檗鹼以及它們的衍生物；黑色素形成抑制劑，酪氨酸酶形成抑制劑以及酪氨酸酶抑制劑。
除上述具有抗炎活性的那些之外，在本發明中有用的抗炎劑的例子包括，例如，尿囊素，尿囊素乙醯基-DL-甲硫氨酸，β-甘草次酸尿囊素鹽，魚石脂，吲哚美辛，乙醯水楊酸，苯海拉明氯化物，愈創藍油烴，camazulene，氯苯那敏順丁烯二酸鹽，甘草甜素，甘草次酸以及orentalgromurel抽提物。在本發明中有用的酶的例子是來自芽孢桿菌屬和鏈黴菌屬微生物和酵母的那些；以及來源於植物和動物的那些，如蛋白酶，脂肪酶以及溶菌酶。
在本發明中有用的糖是例如，寡糖如蔗糖，麥芽糖，果糖，乳糖以及海藻糖；環四糖以外的環狀糖，如環糊精；糖醇如麥芽糖醇，山梨糖醇，甘露糖醇，木糖醇以及阿拉伯糖醇；多糖如透明質酸，硫酸軟骨素，支鏈澱粉，纖維素，澱粉，葡聚糖，果膠，角叉菜膠，瓜爾膠，玉米漿，阿拉伯樹膠，黃蓍膠，黃原膠以及殼多糖，它們的衍生物和部分水解物。在本發明中有用的胺基酸是甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，胱氨酸，天冬醯胺，穀氨醯胺，2-吡咯烷酮-5-羧酸，羥基脯氨酸，哌可酸，肌氨酸，高半胱氨酸，高絲氨酸，瓜氨酸，天冬氨酸，穀氨酸，半胱氨酸磺酸，精氨醯琥珀酸，精氨酸，賴氨酸，組氨酸，鳥氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，脯氨酸，β-丙氨酸，牛磺酸，β-氨基丁酸，γ-氨基丁酸，和它們的鹽。
除上述具有粘性賦予能力的化合物之外，在本發明中有用的增稠劑包括，例如，水溶性高分子物質如溫桲子，藻酸鈉，陽離子化纖維素，羥乙基纖維素，羧甲基纖維素，羧甲基澱粉，丙二醇藻酸鹽，膠原，角蛋白，羥丙基三甲基銨氯化物醚，聚乙烯醇，聚乙烯基吡咯烷酮，聚乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物，聚乙烯亞胺，聚丙烯酸鈉，聚乙烯基甲基醚以及羧乙烯基聚合物；電解質，如氯化鈉，氯化鉀以及硫酸鈉；以及油料。
雖然上述例子不會完全覆蓋上述例證性化合物/組份的匹配的鹽(如果它們有這樣的鹽)，但任何外用皮膚劑可接受的鹽(以上例證性的鹽以外的)都可以任意用於本發明。
將本發明的環四糖或包含它的糖組合物摻入上述組合物的方法是這樣的方法，其可以在完成它們的加工之前將環四糖和糖組合物摻入到各種組合物中，並且其可以適當選自下列常規方法混合，揉合，溶解，熔化，浸透，滲入，分散，敷塗，塗布，噴霧，注射，結晶以及固化。優選摻入最後組合物的環四糖或包含它的糖組合物的量通常在至少0.1％的量，希望至少1％。
下列實驗詳盡地解釋本發明實驗1通過培養製備非還原性環四糖將由5％(w/v)″PINE-DEX#1″(日本東京Matsutani化學公司市售的澱粉部分水解物)，1.5％(w/v)″ASAHIMEAST″(日本東京AsahiBreweries有限公司市售的酵母提取物)，0.1％(w/v)磷酸氫二鉀，0.06％(w/v)磷酸鈉十二水合物，0.05％(w/v)硫酸鎂七水合物，和水組成的液體培養基以100ml的量置於500-ml錐形瓶中，121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻，然後接種圓孢芽孢桿菌C9菌株，FERM BP-7143，接著在旋轉振蕩條件下於27℃和230rpm培養48小時，離心所形成的培養液，以除去細胞獲得上清液。將上清液120℃高壓滅菌15分鐘，然後冷卻，經離心除去不能溶解的物質，獲得上清液。
為了在上清液中檢查糖，使用正丁醇，吡啶以及水的混合物溶液(＝6∶4∶1)為展開劑，「KIESELGEL 60」(一種美國Rahway的Merck公司出售的用於TLC的鋁板(20×20cm))為薄層板經矽膠薄層色譜(在下文中縮寫為「TLC」)從上清液分離。
分離的總糖經硫酸-甲醇法著色，還原糖經聯苯胺-苯胺法檢測，非還原糖在前面的檢測方法上為陽性，但在後面的檢測方法上為陰性。並具有0.31的Rf值。
將檢測之前的約90ml上清液調節到pH 5.0和45℃，在與每克1,500單位「TRANSGLUCOSIDASE L AMANOTM」(一種日本Aichi的Amano藥物公司出售的α-葡萄糖苷酶)，每克75單位葡糖澱粉酶固體(日本京都的Nagase生物化學有限公司出售的)混合後，溫育24小時。此後，所形成的培養物通過添加氫氧化鈉調整到pH 12，煮沸2小時，以便分解剩餘的還原糖。之後通過過濾除去不溶性物質，所產生的溶液用″DIAION PK218″和″DIAION WA30″，日本東京Mitsubishi化學工業有限公司出售的陽離子交換樹脂，以及日本東京Mitsubishi化學工業有限公司出售的″DIAIONSK-1B″和″AMBERLITE IRA411″，日本東京的日本Organo公司出售的陰離子交換樹脂，脫色和脫鹽，接著以活性炭脫色，膜過濾，蒸發器濃縮，真空凍幹，獲得約0.6克(d.s.b.)糖粉。
在高效液相色譜(在下文簡作″HPLC″)上的糖分析在10.84分鐘洗脫時間發現一個單一峰，如圖1所示，揭示糖具有99.9％或更高的高純度。HPLC採用日本東京Showa Denko K.K.的″SHOWDEX KS-80l柱″，在60℃的柱溫，0.5毫升/分鐘水流速，日本東京Tosoh公司出售的″RI-8012″差示折射計進行。
當用Somogyi-Nelson’s法測定糖的還原力時，還原力在可檢測的水平之下，揭示樣品實質上是非還原糖。實驗2非還原糖的結構分析以實驗1的方法獲得的非還原糖快原子轟擊質譜(稱為″FABMS″)明顯檢測到質量數為649的加質子分子離子，這意味這一糖具有648的質量數。
根據常規方式，用硫酸水解糖，然後進行糖組成分析。結果僅檢測到D-葡萄糖，揭示糖是由D-葡萄糖分子組成的或考慮到上述質量數，是由四個D-葡萄糖分子組成的環四糖。
糖的核磁共振分析(稱為″NMR″)給出如圖2所示的1H-NMR光譜和如圖3所示的13C-NMR光譜，將這些光譜與已知的糖比較，揭示它們與以下一種非還原的環狀糖相符「歐洲生物化學雜誌」(EuropeanJ.Biochemisty)pp.641-648(1994)中公開的環{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}。這些數據確認本發明的糖是在圖4所示的環四糖，即，環{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}。實驗3從圓孢芽孢桿菌C9(菌株C9)產生α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶將由4.0％(w/v)″PINE-DEX#4″，日本東京Matsutani化學公司市售的澱粉部分水解物，1.8％(w/v)″ASAHIMEAST″，日本東京AsahiBreweries有限公司市售的酵母提取物，0.1％(w/v)磷酸氫二鉀，0.06％(w/v)磷酸鈉十二水合物，0.05％(w/v)硫酸鎂六水合物，和水組成的液體培養基以分別100ml的量置於各500-ml錐形瓶中，121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻，然後接種圓孢芽孢桿菌C9菌株，FERM BP-7143，接著在旋轉振蕩條件下於27℃和230rpm培養48小時進行種子培養。
將約20L用於上述種子培養的新製備的相同液體培養基置於30 L發酵罐，加熱滅菌，然後冷卻到27℃，用1％(v/v)種子培養物接種，接著在通氣攪拌條件下於27℃和pH 6.0-8.0培養48小時。在培養完成之後，將具有約0.45單位/ml本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶，約1.5單位/mlα-異麥芽糖基轉移酶以及約0.95單位/ml環四糖形成活性的所形成的培養物在10,000rpm下離心30分鐘，以獲得18L上清液。當測量酶促活性時，所述的上清液具有約0.45單位/ml本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶，即，約8,110單位的總酶促活性；約1.5單位/mlα-異麥芽糖基轉移酶，即，約26,900單位的總酶促活性；以及約0.95單位/ml環四糖形成活性，即，約17,100單位的總酶促活性。
這些酶的活性按以下所述測定通過在100mM乙酸鹽緩衝液(pH6.0)中溶解麥芽三糖，給出濃度為2％(w/v)的底物溶液，添加0.5ml酶溶液的至0.5ml底物溶液中，在35℃下酶促反應混合溶液60分鐘，通過10分鐘煮沸暫停反應混合物，以實驗1中公開的HPLC定量測定在反應混合物中形成的異麥芽糖基麥芽糖和麥芽糖中的麥芽糖，由此測定本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的酶促活性。α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的一單位活性被定義為在上述酶促反應條件下每分鐘形成一微摩爾麥芽糖的酶量。在整個說明書中，α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的酶促活性意指如上測定的單位。
通過在100mM乙酸鹽緩衝液(pH6.0)中溶解潘糖，給出濃度為2％(w/v)的底物溶液，添加0.5ml酶溶液的至0.5ml底物溶液中，在35℃下酶促反應混合溶液30分鐘，通過10分鐘煮沸暫停反應混合物，以葡萄糖氧化酶方法定量測定在反應混合物中形成的環四糖與葡萄糖中的葡萄糖，由此測定本發明的α-異麥芽糖基轉移酶的酶促活性。α-異麥芽糖基轉移酶的一單位活性被定義為在上述酶促反應條件下每分鐘形成一微摩爾葡萄糖的酶量。在整個說明書中，α-異麥芽糖基轉移酶的酶促活性意指如上測定的單位。
通過在50mM乙酸鹽緩衝液(pH6.0)中溶解″PINE-DEX#100″，日本東京Matsutani化學公司市售的澱粉部分水解物，給出濃度為2％(w/v)的底物溶液，添加0.5ml酶溶液的至0.5ml底物溶液中，在35℃下酶促反應混合溶液60分鐘，通過10分鐘煮沸暫停反應混合物，進一步向所形成的混合物中添加1毫升50mM乙酸鹽緩衝液(pH5.0)以及70單位/ml″TRANSGLUCOSIDASE L AMANOTM″(一種由日本Aichi的Amano藥物公司出售的α-葡萄糖苷酶)，27單位/ml日本京都Nagase生物化學公司出售的葡糖澱粉酶，在50℃下溫育60分鐘，通過在100℃下加熱10分鐘滅活剩餘的酶，並以類似實驗1的HPLC定量測定環四糖，由此測定本發明的環四糖形成活性。環四糖形成活性的一單位活性被定義為在上述酶促反應條件下每分鐘形成一微摩爾環四糖的酶量。在整個說明書中，環四糖形成活性意指如上測定的活性(單位)。實驗4從圓孢芽孢桿菌C9製備酶實驗4-1將實驗3的上清液18 L用80％飽和硫酸銨鹽析，使其在4℃下靜置24小時，所形成的沉澱在10,000rpm下由離心30分鐘收集，溶解在10mM磷酸緩衝液(pH7.5)中，對新製備的相同緩衝液透析，以獲得約400毫升具有8,110單位的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶，24,700單位的α-異麥芽糖基轉移酶和約15,600單位的環四糖形成活性的粗酶溶液。將粗酶溶液用1,000ml″SEPABEADS FP-DA13″凝膠(一種日本東京的Mitsubishi化學工業公司出售的離子交換樹脂)進行離子交換色譜。α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶與環四糖作為沒有吸附在離子交換樹脂上的非吸附組份被洗脫掉。所產生的酶溶液對具有1M硫酸銨的10mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)透析，離心透析溶液除去雜質，並用500ml″SEPHACRYLHR S-200″(一種由Amersham公司，Div.Amersham International，Arlington Heights，IL，USA出售的凝膠)進行親和色譜。酶促活性組份吸附在凝膠上，當依次用硫酸銨從1M減少至0M的線性梯度，麥芽四糖從0mM增加至100mM的線性梯度洗脫時，α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶以及α-異麥芽糖基轉移酶分別洗脫，即，前者由在約30mM的麥芽四糖線性梯度洗脫以及後者由在約0M的硫酸銨線性梯度洗脫。這樣，分別收集具有根據本發明的α-異麥芽糖基-轉移活性的組份和α-異麥芽糖基葡糖基糖-形成活性的那些。在任何上述組份中沒有發現任何環四糖形成活性，這說明具有α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶的上述組份的混合物溶液也具有環四糖形成活性，也說明由澱粉部分水解物形成環四糖的活性由上述兩種類型酶活性共同作用發揮。
用於分別純化本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶的方法在以下描述實驗4-2α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的純化將在實驗4-1中獲得的本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶組份對包含1M硫酸銨的10mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)透析。將透析溶液離心，以除去不溶性雜質，將所產生的上清液用350ml″BUTYL-TOYOPEARL 650M″(日本東京Tosoh公司出售的凝膠)進行疏水色譜。酶吸附在凝膠上，但用硫酸銨從1M減少至0M的線性梯度洗脫時，在約0.3M硫酸銨時被洗脫，其後收集有酶活性的組份。將組份集中，並再一次對包含1M硫酸銨的10mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)透析。所產生的透析溶液經離心除去雜質，並用″SEPHACRYL HR S-200″凝膠的親和色譜純化酶。在每一純化步驟中的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的酶活性，比活性以及產率的數量在表1中顯示。
表1酶*活性酶*的比活性 產率純化步驟(單位) (單位/mg蛋白質)(％)培養上清液 8,110 0.12 100硫酸銨鹽析後的透析溶液7,450 0.56 91.9從離子交換柱色譜的洗脫物 5,850 1.03 72.1親和柱色譜的洗脫物4,040 8.72 49.8疏水柱色譜的洗脫物3,070 10.6 37.8親和柱色譜的洗脫物1,870 13.6 23.1注符號″*″意指本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶。
最後純化的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶樣品在用7.5％(w/v)聚丙烯醯胺凝膠凝膠電泳上進行純度測定，在凝膠上檢測到為單一蛋白質的帶，即，一個高純度的酶樣品。實驗4-3α-異麥芽糖基轉移酶的純化將已經在實驗4-1中被親和色譜與具有α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的組份分離的α-異麥芽糖基轉移酶組份對包含1M硫酸銨的10mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)透析。所產生的透析溶液經離心除去雜質，用″SEPHACRYL HR S-200″凝膠進行親和色譜。在每一純化步驟中的α-異麥芽糖基轉移酶的酶活性，比活性以及產率的數量在表2中顯示。
表2酶*活性酶*的比活性 產率純化步驟(單位)(單位/mg蛋白質) (％)培養上清液26,9000.41100用硫酸銨鹽析後的透析溶液 24,7001.8591.8從離子交換柱色譜的洗脫物 19,4003.4172.1親和柱色譜的洗脫物 13,40018.649.8疏水柱色譜的洗脫物 10,00021.337.2親和柱色譜的洗脫物 6,460 26.924.0注符號″*″意指本發明的α-異麥芽糖基轉移酶。實驗5α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶的性質實驗5-1α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的性質對在實驗4-2的方法獲得的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶純化樣品用7.5％(w/v)聚丙烯醯胺凝膠進行SDS-PAGE，通過與平行電泳標準分子標記(由比利時布魯塞爾的Bio-Rad實驗室公司出售)的動力學比較確定分子量，說明酶具有約140,000±20,000道爾頓的分子量。
新製備的上述純化的樣品的用包含2％(w/v)兩性電解質的凝膠(由Amersham公司，Div.Amersham International，Arlington Heights，IL，USA出售)進行等電聚焦電泳，然後測定蛋白質帶與凝膠的pH以測定酶的等電點，揭示酶具有5.2±0.5的等電點。
溫度和pH對α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶活性的影響依據酶活性測定方法測定，其中在存在或缺乏1mM Ca2+下測定溫度的影響。這些結果顯示在圖5(溫度影響)和圖6(pH影響)中。當在pH6.0下溫育60分鐘時，酶的最適溫度是約40℃(在缺乏1mM Ca2+下)和約45℃(在存在1mM Ca2+下)。當在35℃下溫育60分鐘時，酶的最適pH是約6.0到約6.5。酶的熱穩定性通過以下方法測定在存在或缺乏1mM Ca2+時在所設定的溫度下溫育在20mM乙酸鹽緩衝液(pH6.0)中的待試酶溶液60分鐘，以水冷卻所產生的酶溶液，測定每一溶液的剩餘酶活性。酶的pH穩定性通過以下方法測定在4℃在具有所設定的pH的50mM緩衝液中保持待試酶溶液24小時，調節每一種溶液的pH到6.0，測定每一種溶液的剩餘酶活性。這些結果分別在圖7(熱穩定性)和圖8(pH穩定性)中顯示。結果，在1mM Ca2+缺乏時酶具有不超過約35℃的熱穩定性，在1mM Ca2+存在時酶具有不超過約40℃的熱穩定性，以及約4.5到約9.0的pH穩定性。
根據酶活性測定法，在存在1mM各種金屬離子的情況下測定金屬離子對α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶活性的影響。結果在表3中顯示。
表3金屬離子 相對活性(％)金屬離子相對活性(％)無100Hg2+4Zn2+92 Ba2+65Mg2+100Sr2+80Ca2+115Pb2+103Co2+100Fe2+98Cu2+15 Fe3+97Ni2+98 Mn2+111Al3+99 EDTA20如表3的結果所顯示的，酶活性大大地被Hg2+，Cu2+和EDTA抑制，也被Ba2+和Sr2+抑制。也發現酶被Ca2+和Mn2+活化。
由″蛋白質測序儀473A型″(一種美國Foster市應用生物系統公司的儀器)進行的酶的N-末端胺基酸序列的序列分析揭示該酶在N-末端區具有SEQ ID NO1的部分胺基酸序列，即，酪氨酸-纈氨酸-絲氨酸-絲氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬醯胺-亮氨酸-異亮氨酸。實驗5-2α-異麥芽糖基轉移酶的性質對在實驗4-3的方法獲得的α-異麥芽糖基轉移酶純化樣品用7.5％(w/v)聚丙烯醯胺凝膠進行SDS-PAGE，通過與平行電泳標準分子標記(由比利時布魯塞爾的Bio-Rad實驗室公司出售)的動力學比較確定分子量，說明酶具有約112,000±20,000道爾頓的分子量。
新製備的上述純化的樣品的用包含2％(w/v)兩性電解質的凝膠(由Amersham公司，Div.Amersham International，Arlington Heights，IL，USA出售)進行等電聚焦電泳，然後測定蛋白質帶與凝膠的pH以測定酶的等電點，揭示酶具有5.5±0.5的等電點。
溫度和pH對α-異麥芽糖基轉移酶活性的影響依據酶活性測定方法測定。這些結果顯示在圖9(溫度影響)和圖10(pH影響)中。當在pH6.0下溫育30分鐘時，酶的最適溫度是約45℃。當在35℃下溫育30分鐘時，酶的最適pH是約6.0。酶的熱穩定性通過以下方法測定在所設定的溫度下溫育在20mM乙酸鹽緩衝液(pH6.0)中的待試酶溶液60分鐘，以水冷卻所產生的酶溶液，測定每一溶液的剩餘酶活性。酶的pH穩定性通過以下方法測定在4℃在具有所設定的pH的50mM緩衝液中保持待試酶溶液24小時，調節每一種溶液的pH到6.0，測定每一種溶液的剩餘酶活性。這些結果分別在圖11(熱穩定性)和圖12(pH穩定性)中顯示。結果，酶具有不超過約40℃的熱穩定性，約4.0到約9.0的pH穩定性。
根據酶活性測定法，在存在1mM各種金屬離子的情況下測定金屬離子對α-異麥芽糖基轉移酶活性的影響。結果在表4中顯示。
表4金屬離子相對活性(％) 金屬離子 相對活性(％)無 100 Hg2+1Zn2+88Ba2+102Mg2+98Sr2+101Ca2+101 Pb2+89Co2+103 Fe2+96Cu2+57Fe3+105Ni2+102 Mn2+106Al3+103 EDTA 104如表4的結果所顯示的，酶活性大大地被Hg2+抑制，也被Cu2+抑制。也發現酶不被Ca2+活化和不被EDTA抑制。
由″蛋白質測序儀473A型″(一種美國Foster市應用生物系統公司的儀器)進行的酶的N-末端胺基酸序列的序列分析揭示酶在N-末端區具有SEQ ID NO2的部分胺基酸序列，即，異亮氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-纈氨酸-酪氨酸-組氨酸-丙氨酸-脯氨酸-天冬醯胺-甘氨酸。實驗6從圓孢芽孢桿菌C11(菌株C11)產生α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶將由4.0％(w/v)″PINE-DEX #100″，澱粉部分水解物，1.8％(w/v)″ASAHIMEAST″(一種酵母提取物)，0.1％(w/v)磷酸氫二鉀，0.06％(w/v)磷酸鈉十二水合物，0.05％(w/v)硫酸鎂六水合物，和水組成的液體培養基以分別100ml的量置於500-ml錐形瓶中，121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻，然後接種圓孢芽孢桿菌C11菌株，FERM BP-7144的貯存培養物，接著在旋轉振蕩條件下於27℃和230rpm培養48小時進行培養。集中所形成的培養物，並用作種子培養物。
將約20L用於上述種子培養的新製備的相同營養培養基置於30L發酵罐，加熱滅菌，然後冷卻到27℃，用1％(v/v)種子培養物接種，接著在通氣攪拌條件下於27℃和pH 6.0-8.0培養48小時。將具有約0.55單位/ml α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶活性，約1.8單位/ml α-異麥芽糖基轉移酶活性以及約1.1單位/ml環四糖形成酶活性的所形成的培養物在10,000rpm下離心30分鐘，以獲得18L上清液。上清液測定表明，其具有約0.51單位/mlα-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶活性，即，約9,180單位的總酶促活性；約1.7單位/mlα-異麥芽糖基轉移酶活性，即，約30,400單位的總酶促活性；以及約1.1單位/ml環四糖形成活性，即，約19,400單位的總酶促活性。實驗7從圓孢芽孢桿菌C11製備酶將實驗6獲得的上清液18L用80％飽和硫酸銨鹽析，使其在4℃下靜置24小時，對所形成的沉澱在10,000rpm下由離心30分鐘收集，溶解在10mM緩衝液(pH7.5)中，對新製備的相同緩衝液透析，以獲得約416毫升粗酶溶液，發現該溶液具有8,440單位的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶，28,000單位的α-異麥芽糖基轉移酶和約17,700單位的環四糖形成酶。當進行實驗4-1中公開的採用″SEPABEADS FP-DA13″凝膠的離子交換色譜時，上述三種類型的作為沒有吸附在凝膠上的非吸附組份被洗脫。集中具有這些酶的非吸附組份，對具有1M硫酸銨的10mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)透析，離心透析溶液除去雜質，並用500ml″SEPHACRYL HRS-200″對所形成的上清液進行親和色譜。活性酶吸附在凝膠上，依次用硫酸銨從1M減少至0M的線性梯度，麥芽四糖從0mM增加至100mM的線性梯度洗脫，接著分別洗脫α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶以及α-異麥芽糖基轉移酶，前者由在約0.3M濃度的硫酸銨線性梯度洗脫，後者由在約30mM濃度的麥芽四糖線性梯度洗脫。因此，分別收集具有根據本發明的α-異麥芽糖基-轉移活性的組份和α-異麥芽糖基葡糖基糖-形成活性的那些。類似於實驗4中圓孢芽孢桿菌C9的情況，發現在這一柱色譜的任何組份中沒有發現任何環四糖形成活性，α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶兩種組份的酶混合物溶液顯示出環四糖形成活性，說明由澱粉部分水解物形成環四糖的活性由這些酶的酶活性協同發揮。
用於分別純化本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶的方法此後公開實驗7-2α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的純化將本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶組份對包含1M硫酸銨的10mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)透析。將透析溶液離心，以除去不溶性雜質，將所產生的上清液用350ml″BUTYL-TOYOPEARL 650 M″(日本東京Tosoh公司出售的凝膠)進行疏水色譜。酶吸附在凝膠上，但用硫酸銨從1M減少至0M的線性梯度洗脫時，在約0.3M硫酸銨時被洗脫，其後收集有酶活性的組份。將組份集中，並對包含1M硫酸銨的10mM磷酸鹽緩衝液(pH7.0)透析。所產生的透析溶液經離心除去雜質，並用″SEPHACRYL HRS-200″凝膠的親和色譜純化酶。在每一種純化步驟中的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的酶活性，比活性以及產率的數量在表5中顯示。
表5酶*活性酶*的比活性 產率純化步驟(單位)(單位/mg蛋白質) (％)培養上清液 9,180 0.14100用硫酸銨鹽析後的透析溶液8,440 0.6091.9從離子交換柱色譜的洗脫物6,620 1.0872.1親和柱色譜的洗脫物 4,130 8.8345.0疏水柱色譜的洗脫物 3,310 11.036.1親和柱色譜的洗脫物 2,000 13.421.8注符號″*″意指本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶。
最後純化的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶樣品在用7.5％(w/v)聚丙烯醯胺凝膠凝膠電泳上進行純度測定，在凝膠上檢測到為單一蛋白質的帶，即，一個高純度的酶樣品。實驗7-3α-異麥芽糖基轉移酶的純化將已經在實驗7-1中被親和色譜與具有α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的組份分離的α-異麥芽糖基轉移酶組份對包含1M硫酸銨的10mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)透析。所產生的透析溶液經離心除去不溶性雜質，將所產生的上清液用350ml″BUTYL-TOYOPEARL 650 M″(日本東京Tosoh公司出售的凝膠)進行疏水色譜。酶吸附在凝膠上，當用硫酸銨從1M減少至0M的線性梯度洗脫時，在約0.3M硫酸銨時被洗脫，其後收集有酶活性的組份。將組份集中，並對包含1M硫酸銨的10mM磷酸鹽緩衝液(pH7.0)透析。將所形成的透析溶液離心，以除去雜質，並用″SEPHACRYL HRS-200″凝膠進行親和色譜以純化酶。在每一純化步驟中的α-異麥芽糖基轉移酶的酶活性，比活性以及產率的數量在表6中顯示。
表6酶*活性 酶*的比活性 產率純化步驟(單位)(單位/mg蛋白質)(％)培養上清液 30,4000.45 100用硫酸銨鹽析後的透析溶液 28,0001.98 92.1從離子交換柱色譜的洗脫物 2l,8003.56 71.7親和柱色譜的洗脫物 13,70021.9 45.1疏水柱色譜的洗脫物 10,30023.4 33.9親和柱色譜的洗脫物 5,510 29.6 18.1注符號″*″意指本發明的α-異麥芽糖基轉移酶。實驗8α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶的性質實驗8-1α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的性質對在實驗7-2的方法獲得的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶純化樣品用7.5％(w/v)聚丙烯醯胺凝膠進行SDS-PAGE，通過與平行電泳標準分子標記(由比利時布魯塞爾的Bio-Rad實驗室公司出售)的動力學比較確定分子量，說明酶具有約137,000±20,000道爾頓的分子量。
新製備的上述純化的樣品的用包含2％(w/v)兩性電解質的凝膠(由Amersham公司，Div.Amersham International，Arlington Heights，IL，USA出售)進行等電聚焦電泳，然後測定蛋白質帶與凝膠的pH以測定酶的等電點，揭示酶具有5.2±0.5的等電點。
溫度和pH對α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶活性的影響依據酶活性測定方法測定，其中在存在或缺乏1mM Ca2+下測定溫度的影響。這些結果顯示在圖13(溫度影響)和圖14(pH影響)中。當在pH6.0下溫育60分鐘時，酶的最適溫度是約45℃(在缺乏1mM Ca2+下)和約50℃(在存在1mM Ca2+下)。當在35℃下溫育60分鐘時，酶的最適pH是約6.0。酶的熱穩定性通過以下方法測定在存在或缺乏1mM Ca2+時在所設定的溫度下溫育在20mM乙酸鹽緩衝液(pH6.0)中的待試酶溶液60分鐘，以水冷卻所產生的酶溶液，測定每一溶液的剩餘酶活性。酶的pH穩定性通過以下方法測定在4℃在具有所設定的pH的50mM緩衝液中保持待試酶溶液24小時，調節每一種溶液的pH到6.0，測定每一種溶液的剩餘酶活性。這些結果分別在圖15(熱穩定性)和圖16(pH穩定性)中顯示。結果，在缺乏1mM Ca2+時酶具有不超過約40℃，在存在1mM Ca2+時酶具有不超過約45℃的熱穩定性。酶的pH穩定性是約5.0到約10.0。
根據酶活性測定法，在存在1mM各種金屬離子的情況下測定金屬離子對α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶活性的影響。結果在表7中顯示。
表7金屬離子 相對活性(％)金屬離子相對活性(％)無100 Hg2+4Zn2+91Ba2+65Mg2+98Sr2+83Ca2+109 Pb2+101Co2+96Fe2+100Cu2+23Fe3+102Ni2+93Mn2+142Al3+100 EDTA 24如表7的結果所顯示的，酶活性大大地被Hg2+，Cu2+和EDTA抑制，也被Ba2+和Sr2+抑制。也發現酶被Ca2+和Mn2+活化。
由″蛋白質測序儀473A型″(一種美國Foster市應用生物系統公司的儀器)進行的酶的N-末端胺基酸序列的序列分析揭示酶具有SEQ ID NO1的一部分胺基酸序列，即，在N-末端區中的酪氨酸-纈氨酸-絲氨酸-絲氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬醯胺-亮氨酸-異亮氨酸。
N-末端區部分胺基酸序列與來源於實驗5-1中圓孢芽孢桿菌C9的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的序列比較揭示，它們是相同的，在α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶中共同的N-末端胺基酸序列是N-末端區的SEQ ID NO1胺基酸序列酪氨酸-纈氨酸-絲氨酸-絲氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬醯胺-亮氨酸-異亮氨酸。實驗8-2α-異麥芽糖基轉移酶的性質對在實驗7-3的方法獲得的α-異麥芽糖基轉移酶純化樣品用7.5％(w/v)聚丙烯醯胺凝膠進行SDS-PAGE，通過與平行電泳標準分子標記(由比利時布魯塞爾的Bio-Rad實驗室公司出售)的動力學比較確定分子量，說明酶具有約102,000±20,000道爾頓的分子量。
新製備的上述純化的樣品的用包含2％(w/v)兩性電解質的凝膠(由Amersham公司，Div.Amersham International，Arlington Heights，IL，USA出售)進行等電聚焦電泳，然後測定蛋白質帶與凝膠的pH以測定酶的等電點，揭示酶具有5.6+0.5的等電點。
溫度和pH對α-異麥芽糖基轉移酶活性的影響依據酶活性測定方法測定。這些結果顯示在圖17(溫度影響)和圖18(pH影響)中。當在pH6.0下溫育30分鐘時，酶的最適溫度是約50℃。當在35℃下溫育30分鐘時，酶的最適pH是約5.5到約6.0。酶的熱穩定性通過以下方法測定在所設定的溫度下溫育在20mM乙酸鹽緩衝液(pH6.0)中的待試酶溶液60分鐘，以水冷卻所產生的酶溶液，測定每一溶液的剩餘酶活性。酶的pH穩定性通過以下方法測定在4℃在具有所設定的pH的50mM緩衝液中保持待試酶溶液24小時，調節每一種溶液的pH到6.0，測定每一種溶液的剩餘酶活性。這些結果分別在圖19(熱穩定性)和圖20(pH穩定性)中顯示。結果，酶具有不超過約40℃的熱穩定性，約4.5到約9.0的pH穩定性。
根據酶活性測定法，在存在1mM各種金屬離子的情況下測定金屬離子對α-異麥芽糖基轉移酶活性的影響。結果在表8中顯示。
表8金屬離子 相對活性(％)金屬離子 相對活性(％)無 100 Hg2+2Zn2+83Ba2+90Mg2+91Sr2+93Ca2+91Pb2+74Co2+89Fe2+104Cu2+56Fe3+88Ni2+89Mn2+93Al3+89EDTA 98如表8的結果所顯示的，酶活性大大地被Hg2+抑制，也被Cu2+抑制。也發現酶不被Ca2+活化和不被EDTA抑制。
由″蛋白質測序儀473A型″(一種美國Foster市應用生物系統公司的儀器)進行的酶的N-末端胺基酸序列的序列分析揭示酶具有SEQ ID NO2的一部分胺基酸序列，即，在N-末端區中的異亮氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-纈氨酸-酪氨酸-組氨酸-丙氨酸-脯氨酸-酪氨酸-甘氨酸。
N-末端區部分胺基酸序列與來源於實驗5-2中圓孢芽孢桿菌C9的α-異麥芽糖基轉移酶的序列比較揭示它們在N-末端區域具有如SEQ IDNO4所示的相同胺基酸序列異亮氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-纈氨酸-酪氨酸-組氨酸-丙氨酸-脯氨酸。實驗9α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶的胺基酸序列實驗9-1α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的內部胺基酸序列將以實驗7-2的方法獲得的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的純化的樣品對10mM Tris-HCl緩衝液(pH9.0)透析，用新製備的相同緩衝液稀釋透析溶液，以給出每毫升約一毫克的濃度。將作為待試樣品的一毫升稀釋物與日本東京Wako純化化學工業公司出售的胰蛋白酶10μg混合，在30℃溫育22小時，以水解成肽。為了分離水解的肽，對所產生的水解物進行反相HPLC，其中使用直徑2.1mm長度150mm的″μ-Bondapak C18柱″(Div.，MILLIPORE Corp.，Milford，美國的產品)，在室溫下，以0.9毫升/分鐘的流速，並且採用0.1％(v/v)三氟乙酸中的乙腈在120分鐘內從8％(v/v)增加至40％(v/v)的線性梯度。從柱上洗脫的肽經監測在210nm波長的吸光度來檢測。將已經與其它肽充分分離的命名為P64(約64分鐘的保留時間)，P88(約88分鐘的保留時間)以及P99(約99分鐘的保留時間)三個肽樣品分別收集並在真空中乾燥，然後溶解在200μl0.1％(v/v)三氟乙酸和50％(v/v)乙腈溶液中。對每一個肽樣品進行蛋白質測序，以分析多達八個胺基酸的胺基酸序列，獲得SEQ ID NO5到7的胺基酸殘基。所分析的內部部分胺基酸序列在表中9顯示。
表9肽名稱 內部部分胺基酸序列P64天冬氨酸-丙氨酸-絲氨酸-丙氨酸-天冬醯胺-纈氨酸-蘇氨酸-蘇氨酸P88色氨酸-絲氨酸-亮氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸-天冬醯胺-苯丙氨酸P99天冬醯胺-酪氨酸-蘇氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-色氨酸-甲硫氨酸-苯丙氨酸實驗9-2α-異麥芽糖基轉移酶的內部胺基酸序列將以實驗7-3的方法獲得的α-異麥芽糖基轉移酶的純化的樣品對10mM Tris-HCl緩衝液(pH9.0)透析，用新製備的相同緩衝液稀釋透析溶液，以給出每毫升約一毫克的濃度。將作為待試樣品的一毫升稀釋物與日本東京Wako純化化學工業公司出售的″賴氨醯內肽酶″10μg混合，使其在30℃反應22小時以形成肽。對所產生的混合物進行反相HPLC以分離肽，其中使用直徑2.1mm長度150mm的″μ-Bondapak C18柱″(Div.，MILLIPORE Corp.，Milford，美國的產品)，在室溫下，以0.9毫升/分鐘的流速，並且採用0.1％(v/v)三氟乙酸中的乙腈在120分鐘內從8％(v/v)增加至40％(v/v)的的線性梯度。從柱上洗脫的肽經監測在210nm波長的吸光度檢測。將已經與其它肽充分分離的命名為P22(約22分鐘的保留時間)，P63(約63分鐘的保留時間)以及P71(約71分鐘的保留時間)三個肽樣品分別收集並在真空中乾燥，然後溶解在200μl 0.1％(v/v)三氟乙酸和50％(v/v)乙腈溶液中。對每一個肽樣品進行蛋白質測序，以分析多達八個胺基酸的胺基酸序列，獲得SEQ ID NO8到10的胺基酸殘基。所分析的內部部分胺基酸序列在表10中顯示。
表10肽名稱內部部分胺基酸序列P22 甘氨酸-天冬醯胺-穀氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-天冬醯胺-穀氨醯胺-酪氨酸P63 異亮氨酸-蘇氨酸-蘇氨酸-色氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-穀氨酸-絲氨酸P71 色氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸-亮氨酸-色氨酸-甲硫氨酸-絲氨酸實驗10從圓孢芽孢桿菌N75(菌株N75)產生α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶將由4.0％(w/v)″PINE-DEX#4″，澱粉部分水解物，1.8％(w/v)″ASAHIMEAST″(一種酵母提取物)，0.1％(w/v)磷酸氫二鉀，0.06％(w/v)磷酸鈉十二水合物，0.05％(w/v)硫酸鎂六水合物，和水組成的液體培養基以分別100ml的量置於500-ml錐形瓶中，121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻，然後接種圓孢芽孢桿菌N75菌株貯藏培養物，FERM BP-7591的貯存培養物，接著在旋轉振蕩條件下於27℃和230rpm培養48小時進行培養以用作種子培養物。
將約20L用於上述種子培養的新製備的相同液體培養基置於30L發酵罐，加熱滅菌，然後冷卻到27℃，用1％(v/v)種子培養物接種，接著在通氣攪拌條件下於27℃和pH 6.0-8.0培養48小時。將具有約0.34單位/mlα-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶活性，約1.1單位/mlα-異麥芽糖基轉移酶活性以及約0.69單位/ml環四糖形成酶活性的所形成的培養物在10,000rpm下離心30分鐘，以獲得18L上清液。上清液測定表明，其具有約0.33單位/ml本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶活性，即，約5,940單位的總酶促活性；約1.1單位/mlα-異麥芽糖基轉移酶活性，即，約19,800單位的總酶促活性；以及約0.67單位/ml環四糖形成酶活性，即，約12,100單位的總酶促活性。實驗11從圓孢芽孢桿菌N75製備酶將實驗10獲得的上清液18 L用60％飽和硫酸銨鹽析，使其在4℃下靜置24小時，對所形成的沉澱在10,000rpm下由離心30分鐘收集，溶解在10mM Tris-HCl(pH8.3)中，對新製備的相同緩衝液透析，以獲得約450毫升粗酶溶液，發現該溶液具有4,710單位的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶，15,700單位的α-異麥芽糖基轉移酶和約9,590單位的環四糖形成酶。接著對其進行實驗4-1中公開的採用″SEPABEADS FP-DA13″凝膠的離子交換色譜。所述酶吸附在凝膠上，而α-異麥芽糖基轉移酶作為沒有吸附在凝膠上的非吸附組份被洗脫。當用氯化鈉從0M增加至1M的線性梯度洗脫時，本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶在約0.25M氯化鈉濃度時洗脫。在這些條件下，將具有本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶活性的組份和具有α-異麥芽糖基轉移酶活性的那些分別分級分離和收集。類似於實驗4中圓孢芽孢桿菌C9和實驗7中圓孢芽孢桿菌C11的情況，其揭示在這一柱色譜的任何組份中沒有發現任何環四糖形成活性，並且通過混合α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶兩種組份獲得的酶溶液顯示出環四糖形成活性，這些事實表明由澱粉部分水解物形成環四糖的活性由本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶協同發揮。
下列實驗描述用於分別純化本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶的方法實驗11-2α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的純化收集具有本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的以上組份，然後對包含1M硫酸銨的10mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)透析。將透析溶液離心除去雜質，並進行採用″SEPHACRYL HR S-200″凝膠的親和色譜。酶吸附在凝膠上，然後由硫酸銨從1M減少至0M的線性梯度和麥芽四糖從0mM增加到100mM的線性梯度從中依次洗脫。結果，吸附在凝膠上的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶在約30mM麥芽四糖濃度時從中洗脫，接著收集具有所述酶活性的組份。集中這些組份，並對包含1M硫酸銨的10mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)透析。透析溶液經離心除去雜質，將所產生的透析溶液用350ml″BUTYL-TOYOPEARL 650 M″(日本東京Tosoh公司出售的凝膠)進行疏水色譜。酶吸附在凝膠上，當用硫酸銨從1M減少至0M的線性梯度洗脫時，在約0.3M硫酸銨時被洗脫，其後收集有酶活性的組份。將組份集中，並對包含1M硫酸銨的10mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)透析。將所形成的透析溶液離心，以除去雜質，並用300ml″SEPHACRYL HRS-200″凝膠進行親和色譜以純化酶。在每一純化步驟中的α-異麥芽糖基轉移酶的酶活性，比活性以及產率的數量在表11中顯示。
表11純化步驟 酶*活性 酶*的比活性 產率(單位) (單位/mg蛋白質) (％)培養上清液 5,940 0.10 100硫酸銨鹽析後的透析溶液 4,710 0.19 79.3離子交換柱色譜洗脫物3,200 2.12 53.9親和柱色譜的洗脫物 2,210 7.55 37.2疏水柱色譜的洗脫物 1,720 10.1 29.0親和柱色譜的洗脫物 1,320 12.5 22.2注符號″*″意指α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶.
最後純化的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶樣品在用7.5％(w/v)聚丙烯醯胺凝膠凝膠電泳上進行純度測定，在凝膠上檢測到為單一蛋白質的帶，即，一個高純度的酶樣品。實驗11-3α-異麥芽糖基轉移酶的純化收集已經在實驗11-1中被離子交換色譜與具有α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的組份分離的α-異麥芽糖基轉移酶組份，對包含1M硫酸銨的10mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)透析。所產生的透析溶液經離心除去雜質，將所產生的上清液用500ml ″SEPHACRYL HR S-200″(一種由Amersham公司，Div.Amersham International，Arlington Heights，IL，USA出售的凝膠)進行親和色譜。所述的酶吸附在凝膠上，然後用硫酸銨從1M減少至0M的線性梯度洗脫，導致所說的酶在約0.3M硫酸銨濃度時洗脫。收集具有酶活性的組份。將組份集中，並對包含1M硫酸銨的10mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)透析。將所形成的透析溶液離心，以除去雜質，並用380ml″BUTYL-TOYOPEARL 650 M″凝膠進行疏水色譜純化。酶吸附在凝膠上，然後用硫酸銨從1M減少至0M的線性梯度洗脫，導致在約0.3M硫酸銨濃度時洗脫。收集有酶活性的組份，對10mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)透析，離心透析溶液除去雜質，將所產生的上清液用380ml″SUPER Q-TOYOPEARL 650C″凝膠(日本東京Tosoh公司出售)進行離子交換色譜。酶不吸附在凝膠上，作為非吸附組份被洗脫，然後收集併集中，獲得最終純化的酶製劑。在每一純化步驟中的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的酶活性，比活性以及產率的數量在表12中顯示。
表12純化步驟 酶*活性(單位) 酶*的比活性產率(單位/mg蛋白質) (％)培養上清液 19,000 0.33 100硫酸銨鹽析後的透析溶液 15,700 0.64 82.6離子交換柱色譜洗脫物 12,400 3.56 65.3親和柱色譜的洗脫物 8,320 11.7 43.8疏水柱色譜的洗脫物 4,830 15.2 25.4離子交換柱色譜洗脫物 3,850 22.6 20.3注符號″*″意指α-異麥芽糖基轉移酶.
最後純化的α-異麥芽糖基轉移酶樣品在用7.5％(w/v)聚丙烯醯胺凝膠凝膠電泳上進行純度測定，在凝膠上檢測到為單一蛋白質的帶，即，一個高純度的酶樣品。實驗12α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶的性質實驗12-1α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的性質對在實驗11-2的方法獲得的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶純化樣品用7.5％(w/v)聚丙烯醯胺凝膠進行SDS-PAGE，通過與平行電泳標準分子標記(由比利時布魯塞爾的Bio-Rad實驗室公司出售)的動力學比較確定分子量，說明酶具有約136,000±20,000道爾頓的分子量。
新製備的上述純化的樣品的用包含2％(w/v)兩性電解質的凝膠(由Amersham公司,Div.Amersham International，Arlington Heights，IL，USA出售)進行等電聚焦電泳，然後測定蛋白質帶與凝膠的pH以測定酶的等電點，揭示酶具有7.3±0.5的等電點。
溫度和pH對α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶活性的影響依據酶活性測定方法測定，其中在存在或缺乏1mM Ca2+下測定溫度的影響。這些結果顯示在圖21(溫度影響)和圖22(pH影響)中。當分別在缺乏和在存在1mMCa2+下，在pH6.0下溫育60分鐘時，酶的最適溫度是約50℃和約55℃。當在35℃下溫育60分鐘時，酶的最適pH是約6.0。酶的熱穩定性通過以下方法測定在存在或缺乏1mM Ca2+時在所設定的溫度下溫育在20mM乙酸鹽緩衝液(pH6.0)中的待試酶溶液60分鐘，以水冷卻所產生的酶溶液，測定每一溶液的剩餘酶活性。酶的pH穩定性通過以下方法測定在4℃在具有所設定的pH的50mM緩衝液中保持待試酶溶液24小時，調節每一種溶液的pH到6.0，測定每一種溶液的剩餘酶活性。這些結果分別在圖23(熱穩定性)和圖24(pH穩定性)中顯示。結果，在缺乏和存在1mMCa2+時，酶分別具有不超過約45℃和約50℃的熱穩定性，約5.0到約9.0的pH穩定性。
根據酶活性測定法，在存在1mM各種金屬離子的情況下測定金屬離子對α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶活性的影響。結果在表13中顯示。
表 13金屬離子 相對活性(％) 金屬離子 相對活性(％)無 100 Hg2+1Zn2+82 Ba2+84Mg2+96 Sr2+85Ca2+108 Pb2+86Co2+93 Fe2+82Cu2+7 Fe3+93Ni2+93 Mn2+120Al3+98 EDTA 35如表13的結果所顯示的，酶活性大大地被Hg2+，Cu2+和EDTA抑制。也發現酶被Ca2+和Mn2+活化。
由″蛋白質測序儀473A型″(一種美國Foster市應用生物系統公司的儀器)進行的酶的N-末端胺基酸序列的序列分析揭示酶具有SEQ ID NO11的一部分胺基酸序列，即，在N-末端區中的組氨酸-纈氨酸-絲氨酸-丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬醯胺-亮氨酸-亮氨酸。
N-末端區上述部分胺基酸序列與來源於實驗8-1中圓孢芽孢桿菌C11的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的序列比較揭示它們具有相對高的同源性，但在胺基酸殘基1，4和9上不同。實驗12-2α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶的性質對在實驗11-3的方法獲得的α-異麥芽糖基轉移酶純化樣品用7.5％(w/v)聚丙烯醯胺凝膠進行SDS-PAGE，通過與平行電泳標準分子標記(由比利時布魯塞爾的Bio-Rad實驗室公司出售)的動力學比較確定分子量，說明酶具有約112,000±20,000道爾頓的分子量。
新製備的上述純化的樣品的用包含2％(w/v)兩性電解質的凝膠(由Amersham公司，Div.Amersham International，Arlington Heights，IL，USA出售)進行等電聚焦電泳，然後測定蛋白質帶與凝膠的pH以測定酶的等電點，揭示酶具有7.8±0.5的等電點。
溫度和pH對α-異麥芽糖基轉移酶活性的影響依據酶活性測定方法測定。這些結果顯示在圖25(溫度影響)和圖26(pH影響)中。酶的最適溫度是約50℃。當在35℃下溫育30分鐘時，酶的最適pH是約6.0。酶的熱穩定性通過以下方法測定在所設定的溫度下溫育在20mM乙酸鹽緩衝液(pH6.0)中的待試酶溶液60分鐘，以水冷卻所產生的酶溶液，測定每一溶液的剩餘酶活性。酶的pH穩定性通過以下方法測定在4℃在具有所設定的pH的50mM緩衝液中保持待試酶溶液24小時，調節每一種溶液的pH到6.0，測定每一種溶液的剩餘酶活性。這些結果分別在圖27(熱穩定性)和圖28(pH穩定性)中顯示。結果，酶具有不超過約45℃的熱穩定性，約4.5到約10.0的pH穩定性。
根據酶活性測定法，在存在1mM各種金屬離子的情況下測定金屬離子對α-異麥芽糖基轉移酶活性的影響。結果在表14中顯示。
表14金屬離子 相對活性(％) 金屬離子 相對活性(％)無 100 Hg2+0.5Zn2+75 Ba2+102Mg2+95 Sr2+91Ca2+100 Pb2+69Co2+92 Fe2+97Cu2+15 Fe3+90Ni2+91 Mn2+101A13+94 EDTA92如表14的結果所顯示的，酶活性大大地被Hg2+抑制，也被Cu2+抑制。也發現酶不被Ca2+活化和不被EDTA抑制。
由″蛋白質測序儀473A型″(一種美國Foster市應用生物系統公司的儀器)進行的酶的N-末端胺基酸序列的序列分析揭示酶具有SEQ ID NO3的一部分胺基酸序列，即，在N-末端區中的異亮氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-纈氨酸-酪氨酸-組氨酸-丙氨酸-脯氨酸-酪氨酸-甘氨酸。
N-末端區部分胺基酸序列與來源於實驗8-2中圓孢芽孢桿菌C9的α-異麥芽糖基轉移酶的序列比較揭示它們在其N-末端區具有SEQ ID NO4所示的相同胺基酸序列異亮氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-纈氨酸-酪氨酸-組氨酸-丙氨酸-脯氨酸。實驗13α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶的內部胺基酸序列實驗13-1α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的內部胺基酸序列將以實驗11-2的方法獲得的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的純化的樣品對10mM Tris-HCl緩衝液(pH9.0)透析，用新製備的相同緩衝液稀釋透析溶液，以給出每毫升約一毫克的濃度。將作為待試樣品的一毫升稀釋物與日本東京Wako純化化學工業公司出售的″賴氨醯內肽酶″20μg混合，使其在30℃反應24小時以形成肽。對所產生的混合物進行反相HPLC以分離肽，其中使用直徑3.9mm、長度150mm的″μ-Bondapak C18柱″(Div.，MILLIPORE Corp.，Milford，美國的產品)，在室溫下，以0.9毫升/分鐘的流速，並且採用0.1％(v/v)三氟乙酸中乙腈在120分鐘內從8％(v/v)增加至36％(v/v)的線性梯度。從柱上洗脫的肽經監測在210nm波長的吸光度檢測。將已經與其它肽充分分離的命名為PN59(約59分鐘的保留時間)，PN67(約67分鐘的保留時間)以及PN87(約87分鐘的保留時間)三個肽樣品分別收集並在真空中乾燥，然後溶解在200μl 0.1％(v/v)三氟乙酸和50％(v/v)乙腈溶液中。對每一個肽樣品進行蛋白質測序，以分析多達八個胺基酸的胺基酸序列，獲得SEQ ID NO12到14的胺基酸殘基。所分析的內部部分胺基酸序列在表15中顯示。
表15肽名稱 內部部分胺基酸序列PN59天冬氨酸-苯丙氨酸-絲氨酸-天冬醯胺-天冬醯胺-脯氨酸-蘇氨酸-纈氨酸PN67酪氨酸-蘇氨酸-纈氨酸-天冬醯胺-丙氨酸-脯氨酸-丙氨酸-丙氨酸PN87酪氨酸-穀氨酸-丙氨酸-穀氨酸-絲氨酸-丙氨酸-穀氨酸-亮氨酸實驗13-2α-異麥芽糖基轉移酶的內部胺基酸序列將以實驗11-3的方法獲得的α-異麥芽糖基轉移酶的純化的樣品對10mM Tris-HCl緩衝液(pH9.0)透析，用新製備的相同緩衝液稀釋透析溶液，以給出每毫升約一毫克的濃度。將作為待試樣品的一毫升稀釋物與日本東京Wako純化化學工業公司出售的″賴氨醯內肽酶″20μg混合，使其在30℃反應24小時以形成肽。對所產生的混合物進行反相HPLC以分離肽，其中使用直徑3.9mm、長度150mm的″μ-Bondasphere C18柱″(Div.，MILLIPORE Corp.，Milford，美國的產品)，在室溫下，以0.9毫升/分鐘的流速，並且採用0.1％(v/v)三氟乙酸中乙腈在90分鐘內從4％(v/v)增加至42.4％(v/v)的的線性梯度。從柱上洗脫的肽經監測在210nm波長的吸光度檢測。將已經與其它肽充分分離的命名為PN21(約21分鐘的保留時間)，PN38(約38分鐘的保留時間)以及PN69(約69分鐘的保留時間)三個肽樣品分別收集並在真空中乾燥，然後溶解在200μl0.1％(v/v)三氟乙酸和50％(v/v)乙腈溶液中。對每一個肽樣品進行蛋白質測序，以分析多達八個胺基酸殘基的胺基酸序列，但對PN21分析多達六個胺基酸殘基，獲得SEQ ID NO15到17的胺基酸殘基。所分析的內部部分胺基酸序列在表16中顯示。
表16肽名稱 內部部分胺基酸序列PN21 天冬醯胺-色氨酸-色氨酸-甲硫氨酸-絲氨酸-賴氨酸PN38 蘇氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-甘氨酸-穀氨酸-甲硫氨酸-纈氨酸-色氨酸PN69 天冬醯胺-異亮氨酸-酪氨酸-亮氨酸-脯氨酸-穀氨醯胺-甘氨酸-天冬氨酸實驗14從球形節桿菌A19(菌株A19)產生α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶將由4.0％(w/v)″PINE-DEX#4″，澱粉部分水解物，1.8％(w/v)″ASAHIMEAST″(一種酵母提取物)，0.1％(w/v)磷酸氫二鉀，0.06％(w/v)磷酸鈉十二水合物，0.05％(w/v)硫酸鎂六水合物，和水組成的液體培養基以分別100ml的量置於500-ml錐形瓶中，121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻，然後接種球形節桿菌A19菌株，FERM BP-7590的貯存培養物，接著在旋轉振蕩條件下於27℃和230rpm培養48小時進行培養以用作種子培養物。
將約20L用於上述種子培養的新製備的相同液體培養基置於30L發酵罐，加熱滅菌，然後冷卻到27℃，用1％(v/v)種子培養物接種，接著在通氣攪拌條件下於27℃和pH 6.0-9.0培養48小時。將具有約1.1單位/ml α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶活性，約1.7單位/ml α-異麥芽糖基轉移酶活性以及約0.35單位/ml環四糖形成酶活性的所形成的培養物在10,000rpm下離心30分鐘，以獲得18L上清液。上清液測定表明，其具有約1.06單位/ml本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶活性，即，約19,100單位的總酶促活性；約1.6單位/mlα-異麥芽糖基轉移酶活性，即，約28,000單位的總酶促活性；以及約0.27單位/ml環四糖形成酶活性，即，約4,860單位的總酶促活性。
來源於球形節桿菌A19的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的活性按照實驗3的方法進行類似的測定，除了採用甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液(pH8.4)用作底物緩衝液外。實驗15從球形節桿菌A19製備酶將實驗14獲得的上清液18L用60％飽和硫酸銨鹽析，使其在4℃下靜置24小時，對所形成的沉澱在10,000rpm下由離心30分鐘收集，溶解在10mM磷酸鹽緩衝液(pH7.0)中，對新製備的相同緩衝液透析，以獲得約850毫升粗酶溶液，發現該溶液具有8,210單位的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶，15,700單位的α-異麥芽糖基轉移酶和約20,090單位的環四糖形成酶。接著對其進行採用380毫升″DEAE-TOYOPEARL 650S″凝膠的離子交換色譜。當用氯化鈉從0M增加至0.5M的線性梯度洗脫時，上述酶和α-異麥芽糖基轉移酶分別從凝膠洗脫，前者在約0.2M氯化鈉濃度時洗脫，而後者在約0.3M氯化鈉濃度時洗脫。在這些條件下，將具有本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶活性的組份和具有α-異麥芽糖基轉移酶活性的那些分別分級分離和收集。由於這一柱色譜的任何組份中沒有發現任何環四糖形成活性的事實，並且通過混合α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶兩種組份獲得的酶溶液顯示出環四糖形成活性，這表明由澱粉部分水解物形成環四糖的活性由本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶協同發揮。
下列實驗描述用於分別純化本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶的方法實驗15-2α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的純化收集具有本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的以上組份，然後對包含1M硫酸銨的10mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)透析。將透析溶液離心除去雜質，並進行採用″SEPHACRYL HR S-200″凝膠的親和色譜。酶吸附在凝膠上，然後由硫酸銨從1M減少至0M的線性梯度洗脫。結果，吸附在凝膠上的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶在約0.2M硫酸銨時被洗脫，其後收集有酶活性的組份。將組份集中，用作最終的純化樣品。在每一純化步驟中的α-α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶酶活性，比活性以及產率的數量在表17中顯示。
表17酶*活性(單位) 酶*的比活性 產率純化步驟(單位/mg蛋白質) (％)培養上清液 19,100 0.11100硫酸銨鹽析後的透析溶液 8,2100.4843.0離子交換柱色譜洗脫物 6,8904.1836.1親和柱色譜的洗脫物 5,22035.127.3注符號″*″意指α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶.
最後純化的α-異麥芽糖基轉移酶樣品在用7.5％(w/v)聚丙烯醯胺凝膠凝膠電泳上進行純度測定，在凝膠上檢測到為單一蛋白質的帶，即，高純度的酶樣品。實驗15-3α-異麥芽糖基轉移酶的純化收集已經在實驗15-1中被離子交換色譜與具有α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的組份分離的α-異麥芽糖基轉移酶組份對包含1M硫酸銨的10mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)透析。所產生的透析溶液經離心除去不溶性雜質，將所產生的上清液用500ml″SEPHACRYL HR S-200″(一種由Amersham公司，Div.Amersham International，Arlington Heights，IL，USA出售的凝膠)進行親和色譜。酶吸附在凝膠上，然後由硫酸銨從1M減少至0M的線性梯度洗脫，導致酶在0M硫酸銨時洗脫，其後收集有酶活性的組份用作部分純化樣品。在每一純化步驟中的α-異麥芽糖基轉移酶的酶活性，比活性以及產率的數量在表18中顯示。
表18純化步驟酶*活性(單位)酶*的比活性產率(單位/mg蛋白質) (％)培養上清液28,800 0.18 100硫酸銨鹽析後的透析溶液 15,700 0.97 54.5離子交換柱色譜洗脫物 7,130 4.01 24.8親和柱色譜的洗脫物 1,800 11.9 6.3注符號″*″意指α-異麥芽糖基轉移酶.
用7.5％(w/v)聚丙烯醯胺凝膠在凝膠電泳上對部分純化的α-異麥芽糖基轉移酶樣品進行純度測定，作為主要蛋白質帶與三個次要蛋白質帶一同在凝膠上檢測到。實驗16α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶的性質實驗16-1α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的性質對在實驗15-2的方法獲得的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶純化樣品用7.5％(w/v)聚丙烯醯胺凝膠進行SDS-PAGE，通過與平行電泳標準分子標記(由比利時布魯塞爾的Bio-Rad實驗室公司出售)的動力學比較確定分子量，說明酶具有約94,000±20,000道爾頓的分子量。
新製備的上述純化的樣品的用包含2％(w/v)兩性電解質的凝膠(由Amersham公司，Div.Amersham International，Arlington Heights，IL，USA出售)進行等電聚焦電泳，然後測定蛋白質帶與凝膠的pH以測定酶的等電點，揭示酶具有4.3±0.5的等電點。
溫度和pH對α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶活性的影響依據酶活性測定方法測定，其中在存在或缺乏1mM Ca2+下測定溫度的影響。這些結果顯示在圖29(溫度影響)和圖30(pH影響)中。分別在缺乏和在存在1mM Ca2+下，酶的最適溫度是約60℃和約65℃。當在35℃下溫育60分鐘時，酶的最適pH是約8.4。酶的熱穩定性通過以下方法測定在存在或缺乏1mMCa2+時在所設定的溫度下溫育在20mM甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液(pH8.0)中的待試酶溶液60分鐘，以水冷卻所產生的酶溶液，測定每一溶液的剩餘酶活性。酶的pH穩定性通過以下方法測定在4℃在具有所設定的pH的50mM緩衝液中保持待試酶溶液24小時，調節每一種溶液的pH到8.0，測定每一種溶液的剩餘酶活性。這些結果分別在圖31(熱穩定性)和圖32(pH穩定性)中顯示。結果，分別在缺乏和存在1mM Ca2+時，酶具有不超過約55℃和約60℃的熱穩定性，約5.0到約9.0的pH穩定性。
根據酶活性測定法，在存在1mM各種金屬離子的情況下測定金屬離子對α-異麥芽糖基轉移酶活性的影響。結果在表19中顯示。
表13金屬離子 相對活性(％) 金屬離子 相對活性(％)無 100 Hg2+0Zn2+56 Ba2+99Mg2+97 Sr2+102Ca2+106 Pb2+43Co2+93 Fe2+36Cu2+0Fe3+35Ni2+46 Mn2+98Al3+37 EDTA2如表19的結果所顯示的，酶活性大大地被Hg2+，Cu2+和EDTA抑制。
由″PROTEIN測序儀473A型″(一種美國Foster市應用生物系統公司的儀器)進行的酶的N-末端胺基酸序列的序列分析揭示酶具有SEQ ID NO18的一部分胺基酸序列，即，在N-末端區中的丙氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-纈氨酸-穀氨醯胺-精氨酸-丙氨酸-穀氨醯胺-苯丙氨酸-穀氨醯胺-絲氨酸-甘氨酸。實驗16-2α-異麥芽糖基轉移酶的性質使用在實驗15-3的方法獲得的α-異麥芽糖基轉移酶的部分純化樣品，溫度和pH對α-異麥芽糖基轉移酶活性的影響依據酶活性測定方法測定。這些結果顯示在圖33(溫度影響)和圖34(pH影響)中。當在pH6.0下溫育30分鐘時，酶的最適溫度是約50℃。當在35℃下溫育30分鐘時，酶的最適pH是約6.5。酶的熱穩定性通過以下方法測定在所設定的溫度下溫育在20mM乙酸鹽緩衝液(pH6.0)中的待試酶溶液60分鐘，以水冷卻所產生的酶溶液，測定每一溶液的剩餘酶活性。酶的pH穩定性通過以下方法測定在4℃在具有所設定的pH的50mM緩衝液中保持待試酶溶液24小時，調節每一種溶液的pH到6.0，測定每一種溶液的剩餘酶活性。這些結果分別在圖35(熱穩定性)和圖36(pH穩定性)中顯示。結果，酶具有不超過約45℃的熱穩定性，約4.5到約9.0的pH穩定性。實驗17從分枝節桿菌S1(菌株S1)產生α-異麥芽糖基轉移酶將由4.0％(w/v)″PINE-DEX#4″，澱粉部分水解物，1.8％(w/v)″ASAHIMEAST″(一種酵母提取物)，0.1％(w/v)磷酸氫二鉀，0.06％(w/v)磷酸鈉十二水合物，0.05％(w/v)硫酸鎂六水合物，和水組成的液體培養基以分別100ml的量置於500-ml錐形瓶中，121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻，然後接種分枝節桿菌S1菌株，FERM BP-7592的貯存培養物，接著在旋轉振蕩條件下於27℃和230rpm培養48小時進行培養以用作種子培養物。
將約20L用於上述種子培養的新製備的相同液體培養基置於30L發酵罐，加熱滅菌，然後冷卻到27℃，用1％(v/v)種子培養物接種，接著在通氣攪拌條件下於27℃和pH 6.0-8.0培養48小時。將具有約0.45單位/ml α-異麥芽糖基轉移酶活性的所形成的培養物在10,000rpm下離心30分鐘，以獲得具有約0.44單位/mlα-異麥芽糖基轉移酶活性和約7,920單位總酶促活性的18L上清液。實驗18來源於分枝節桿菌S1的α-異麥芽糖基轉移酶的純化將實驗17獲得的上清液18L在4℃下用80％飽和硫酸銨鹽析24小時，對所形成的沉澱在10,000rpm下由離心30分鐘收集，並對包含1M硫酸銨的10mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)透析，以獲得380毫升具有6,000單位α-異麥芽糖基轉移酶的粗酶溶液。將粗酶溶液對包含1M硫酸銨的10mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)透析。所產生的透析溶液經離心除去雜質，將所產生的上清液用500ml″SEPHACRYL HR S-200″進行親和色譜。所述的酶吸附在凝膠上，然後用硫酸銨從1M減少至0M的線性梯度和麥芽四糖從0％(w/v)增加到5％(w/v)的線性梯度依次洗脫。導致所說的酶在約2％(w/v)麥芽四糖濃度時從凝膠洗脫，收集具有酶活性的組份。將組份集中，並對包含1M硫酸銨的10mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)透析。將所形成的透析溶液離心以除去雜質，並用380ml″BUTYL-TOYOPEARL 650M″凝膠進行疏水色譜純化。當用硫酸銨從1M減少至0M的線性梯度洗脫時，α-異麥芽糖基轉移酶吸附在凝膠上，在約0.3M硫酸銨時被洗脫，其後收集有酶活性的組份用作純化酶樣品。在每一純化步驟中的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的酶活性，比活性以及產率的數量在表20中顯示。
表20酶*活性(單位) 酶*的比活性 產率純化步驟(單位/mg蛋白質) (％)培養上清液 7,920 0.47 100硫酸銨鹽析後的透析溶液 6,000 3.36 75.8親和柱色譜的洗脫物 5,270 29.9 66.5疏水柱色譜的洗脫物 4,430 31.1 55.9注符號″*″意指α-異麥芽糖基轉移酶.
用7.5％(w/v)聚丙烯醯胺凝膠在凝膠電泳上對本實驗中純化的α-異麥芽糖基轉移酶樣品進行純度測定，並且作為單一蛋白質帶，即高純度的酶樣品被檢測。實驗19α-異麥芽糖基轉移酶的性質對在實驗18的方法獲得的α-異麥芽糖基轉移酶純化樣品用7.5％(w/v)聚丙烯醯胺凝膠進行SDS-PAGE，通過與平行電泳標準分子標記(由比利時布魯塞爾的Bio-Rad實驗室公司出售)的動力學比較確定分子量，說明酶具有約116,000±20,000道爾頓的分子量。
新製備的上述純化的樣品的用包含2％(w/v)兩性電解質的凝膠(由Amersham公司，Div.Amersham International，Arlington Heights，IL，USA出售)進行等電聚焦電泳，然後測定蛋白質帶與凝膠的pH以測定酶的等電點，揭示酶具有4.2±0.5的等電點。
溫度和pH對α-異麥芽糖基轉移酶活性的影響依據酶活性測定方法測定。這些結果顯示在圖37(溫度影響)和圖38(pH影響)中。當在pH6.0下溫育30分鐘時，酶的最適溫度是約50℃。當在35℃下溫育30分鐘時，酶的最適pH是約約6.0。酶的熱穩定性通過以下方法測定在所設定的溫度下溫育在20mM乙酸鹽緩衝液(pH6.0)中的待試酶溶液60分鐘，以水冷卻所產生的酶溶液，測定每一溶液的剩餘酶活性。酶的pH穩定性通過以下方法測定在4℃在具有所設定的pH的50mM緩衝液中保持待試酶溶液24小時，調節每一種溶液的pH到6.0，測定每一種溶液的剩餘酶活性。這些結果分別在圖39(熱穩定性)和圖40(pH穩定性)中顯示。結果，酶具有不超過約45℃的熱穩定性，約3.6到約9.0的pH穩定性。
根據酶活性測定法，在存在1mM各種金屬離子的情況下測定金屬離子對α-異麥芽糖基轉移酶活性的影響。結果在表21中顯示。
表21金屬離子相對活性(％) 金屬離子相對活性(％)無 100 Hg2+0.1zn2+78 Ba2+97Mg2+99 Sr2+101Ca2+103 Pb2+85Co2+91 Fe2+105Cu2+2 Fe3+75Ni2+87 Mn2+98Al3+93 EDTA 91如表21的結果所顯示的，其揭示酶活性大大地被Hg2+抑制，也被Cu2+抑制。
由″PROTEIN測序儀473A型″(一種美國Foster市應用生物系統公司的儀器)進行的酶的N-末端胺基酸序列的序列分析揭示酶具有SEQ ID NO19的一部分胺基酸序列，即，在N-末端區中的天冬氨酸-蘇氨酸-亮氨酸-絲氨酸-甘氨酸-纈氨酸-苯丙氨酸-組氨酸-甘氨酸-脯氨酸。實驗20對糖的作用試驗了糖是否可以用作α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的底物。為此目的，製備了麥芽糖，麥芽三糖，麥芽四糖，麥芽五糖，麥芽六糖，麥芽七糖，異麥芽糖，異麥芽三糖，潘糖，異潘糖，海藻糖，曲二糖，黑曲糖，新海藻糖(neotrehalose)，纖維二糖，龍膽二糖，麥芽糖醇，maltotriitol，乳糖，蔗糖，erlose，selaginose，麥芽糖基葡糖苷，或異麥芽糖基葡糖苷的溶液。
向每種上述溶液中添加每克底物2單位的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶純化樣品，所說的酶是實驗4-2的方法獲得的來源於圓孢芽孢桿菌C9的，實驗7-2的方法獲得的來源於圓孢芽孢桿菌C11的，實驗11-2的方法獲得的來源於圓孢芽孢桿菌N75的，或實驗15-2的方法獲得的來源於球形節桿菌A19的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶。將所形成的各溶液調節到給定的2％(w/v)的底物濃度，並且在30℃和pH6.0下溫育24小時(除了採用pH8，4，用於球形節桿菌A19外)。在酶促反應之前和之後分別在實驗1中公開的TLC上分析酶溶液，以證實所說的酶是否作用在這些底物上。結果示於表22中。
表22酶促活性底物菌株C9的酶 菌株C11的酶 菌株N75的酶 菌株A19的酶麥芽糖 + + + +麥芽三糖 ++ ++++ ++麥芽四糖 ++++++ +++ +++麥芽五糖 ++++++ +++ +++麥芽六糖 ++++++ +++ +++麥芽七糖 ++++++ +++ +++異麥芽糖 - - - -異麥芽三糖 - - - -潘糖 - - - -異潘糖 ++ ++++ ++海藻糖 - - - -曲二糖 + + + +黑曲糖 + + + +新海藻糖 + + + +纖維二糖 - - - -(續表22)酶促活性底物菌株C9的酶菌株C11的酶 菌株N75的酶 菌株A19的酶龍膽二糖-- - -麥芽糖醇-- - -Maltotriitol++ + +乳糖-- - -蔗糖-- - -Erlose ++ + +Selaginose -- - -麥芽糖基葡糖苷 ++ ++++ ++異麥芽糖基葡糖苷 -- - -注酶促反應之前和之後，符號「-」， 「+」，「++」和「+++」分別指其沒有顯示出變化，其顯示了底物顏色點稍微減少和形成其它反應產物，其顯示了底物顏色點高度減少和形成其它反應產物，其顯示了底物點實質上消失和形成其它反應產物。
如表22顯示的，它說明本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶很好地作用於被試糖中具有至少為3的葡糖聚合度和在它們的非還原端具有麥芽糖結構的糖。也發現所說的酶輕微作用於具有二個葡糖聚合度的糖，如麥芽糖，曲二糖，黑曲糖，新海藻糖，maltotriito1以及erlose。實驗21麥芽寡糖反應產物實驗21-1反應產物的製備向含有百分之一(w/v)作為底物的麥芽糖，麥芽三糖，麥芽四糖，或麥芽五糖的水溶液中添加實驗7-2的方法獲得的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的純化樣品，添加的量是，對麥芽糖和麥芽三糖水溶液是2單位/g固體，對麥芽四糖是0.2單位/g固體，對麥芽五糖是0.1種單位/g固體，接著在35℃和pH6.0下溫育八小時。在100℃下溫育10分鐘之後，暫停酶促反應物。用HPLC分別測定所產生的反應溶液的糖組成，所說的HPLC採用″YMC PACK ODS-AQ303″(一種由日本東京YMC公司出售的柱)，40℃柱溫，0.5毫升/分鐘水流速，″RI-8012″檢測器(一種日本東京Tosoh公司出售的示差折射計)。結果在表23中。
表23底 物作為反應產物的糖麥芽糖 麥芽三糖 麥芽四糖 麥芽五糖葡萄糖8.5 0.1 0.00.0麥芽糖78.0 17.9 0.30.0麥芽三糖 0.8 45.3 22.7 1.9麥芽四糖 0.0 1.8 35.1 19.2麥芽五糖 0.0 0.0 3.534.4麥芽六糖 0.0 0.0 0.04.6異麥芽糖 0.5 0.0 0.00.0葡糖基麥芽糖 8.2 1.2 0.00.0葡糖基麥芽三糖2.4 31.5 6.80.0X0.0 2.1 30.0 11.4Y0.0 0.0 1.426.8Z0.0 0.0 0.01.7其它 0.6 0.1 0.20.0注表中，葡糖基麥芽糖意指α-異麥芽糖基葡糖基糖，別名62-O-α-葡糖基麥芽糖或潘糖；葡糖基麥芽三糖意指α-異麥芽糖基葡糖基糖，別名63-O-α-葡糖基麥芽三糖；X意指實驗11-2中的α-異麥芽糖基麥芽三糖，別名64-O-α-葡糖基麥芽四糖；Y意指實驗11-2中的α-異麥芽糖基麥芽四糖，別名65-O-α-葡糖基麥芽五糖；Z意指一種未鑑別的糖。
如表23的結果所顯示的，其揭示在本發明的酶作用後，從作為底物的麥芽糖主要形成葡萄糖和α-異麥芽糖基葡糖基糖，別名62-O-α-葡基麥芽糖或潘糖；主要形成麥芽糖和α-異麥芽糖基葡糖基糖，別名63-O-α-葡糖基麥芽三糖，伴隨少量的葡萄糖，麥芽四糖，α-異麥芽糖基葡糖基糖，別名62-O-α-葡基麥芽糖或潘糖，以及產物X。它也說明從作為底物的麥芽四糖主要形成麥芽三糖和產物X，伴隨少量麥芽糖，麥芽五糖，α-異麥芽糖基葡糖基糖，別名63-O-α-葡基麥芽三糖；和產物Y；以及從作為底物的麥芽五糖主要形成麥芽四糖和產物Y，伴隨少量的麥芽三糖，麥芽六糖以及產物X和Z。
按如下方法分離和純化產物X(作為從底物麥芽四糖一種主要產物)和產物Y(作為從底物麥芽五糖的主要產物)X和Y產品在用″YMC PACKODS-A R355-15S-15 12A″(一種由日本東京YMC有限公司出售的分離型HPLC柱)的HPLC上分別純化，以從麥芽四糖的反應產物以約8.3％d.s.b的產率分離具有至少99.9％的純度的產物X的樣品，以及從麥芽四糖的反應產物以約11.5％d.s.b的產率分離具有至少99.9％的純度的產物Y的樣品。實驗21-2反應產物的結構分析用在實驗21-1的方法獲得的產物X和Y，以通常的方式對它們進行甲基分析和NMR分析。它們的甲基分析結果顯示在表24中。對它們的NMR分析結果而言，圖41是產物X的1H-NMR光譜，圖42是產物Y的。產物X和Y的13C-NMR光譜分別在圖43和44中顯示。X和Y產物的測定結果在表25中列出。
表24分析的甲基化合物 比率產物X 產物Y2，3，4-三甲基化合物 1.00 1.002，3，6-三甲基化合物 3.05 3.982，3，4，6-四甲基化合物 0.82 0.85
基於這些結果，從麥芽四糖經由本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的作用形成的產物X被證明為五糖，其中，葡萄糖殘基經由α-連接鍵結合到麥芽四糖非還原端的葡萄糖的OH-6上，即，由式1代表的α-異麥芽糖基麥芽三糖，別名64-O-α-葡糖基麥芽四糖。式1α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-D-Glcp從麥芽五糖形成的產物Y被證明為六糖，其中，葡糖基殘基經由α-連接鍵結合到麥芽五糖的OH-6上，即，由式2代表的α-異麥芽糖基麥芽四糖，別名65-O-α-葡糖基麥芽五糖非還原端的葡萄糖。式2α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-D-Glcp
表25

基於這些結果，可以得出結論本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶如以下顯示作用於麥芽寡糖上(1)該酶作用於作為底物、具有經由α-1，4連接鍵連接的至少為2的葡糖聚合度的麥芽寡糖上，以以下方式催化分子間6-葡糖基轉移反應將在麥芽寡糖分子非還原端的葡糖基殘基轉移到其它麥芽寡糖分子的非還原端的C-6上，以形成α-異麥芽糖基葡糖基糖，別名6-O-α-葡糖基麥芽寡糖(其具有6-O-α-葡糖基殘基，並且與完整底物比較具有高一級的葡糖聚合度)和麥芽寡糖(與完整底物比較，具有低一級的葡糖聚合度)兩者；以及(2)該酶稍微催化4-葡糖基轉移反應，形成與完整底物比較具有高一級的葡糖聚合度的麥芽寡糖和與完整底物比較具有低一級的葡糖聚合度的麥芽寡糖兩者。實驗22還原力形成試驗進行下列試驗以研究本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶是否具有形成還原力的能力。向作為底物的麥芽四糖的1％(w/v)水溶液中添加以下任一α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的純化樣品0.25單位/g底物(d.s.b.)在實驗4-2的方法所獲得的來源於圓孢芽孢桿菌C9的，在實驗7-2的方法獲得的來源於圓孢芽孢桿菌C11的，在實驗11-2的方法獲得的來源於圓孢芽孢桿菌N75的，在實驗15-2的方法所獲得的來源於球形節桿菌A19的。在35℃和pH6.0下溫育(除pH 8.4用於來源於球形節桿菌A19的酶外)。在酶促反應期間，在所規定的時間間隔對每一反應溶液取一小部分樣，在100℃下保持所取樣品溶液10分鐘暫停酶促反應後，測定還原力。在酶促反應之前或之後，用Somogyi-Nelson’s法和蒽酮-硫酸反應法分別定量測定還原糖含量和總糖含量。形成的還原力的百分比由下列等式計算等式形成還原力的百分比(％)＝(AR/AT-BR/BT)×100AR在酶促反應之後還原糖含量。
AT在酶促反應之後總糖含量。
BR在酶促反應之前還原糖含量。
BT在酶促反應之前總糖含量。結果在表26中顯示。
表26反應時間(小時)形成還原力的百分比(％)菌株C9的酶 菌株C11的酶菌株N75的酶菌株A19的酶0 0.0 0.0 0.00.01 0.0 0.1 0.10.02 0.1 0.0 0.00.14 0.1 0.1 0.00.08 0.0 0.0 0.10.1如表26所顯示的，它說明本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶當作為底物作用於麥芽四糖時，實質上不增加反應產物的還原力；酶沒有水解活性或僅具有不可檢測到的水平的該活性。實驗23葡聚糖形成試驗為了研究本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶是否具有形成葡聚糖的能力，按照Bioscience Biotechnology and Biochemistry，Vol.56，pp.169-173(1992)的方法進行試驗。向作為底物的麥芽四糖的1％(w/v)水溶液中添加以下任一α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的純化樣品0.25單位/g底物(d.s.b.)在實驗4-2的方法所獲得的來源於圓孢芽孢桿菌C9的，在實驗7-2的方法獲得的來源於圓孢芽孢桿菌C11的，在實驗11-2的方法獲得的來源於圓孢芽孢桿菌N75的，在實驗15-2的方法所獲得的來源於球形節桿菌A19的。在35℃和pH6.0下溫育(除pH 8.4用於來源於球形節桿菌A19的酶外)4或8小時。在酶促反應完成之後，通過在100℃加熱15分鐘暫停反應。各取五十微升反應混合物置於離心管中，然後與3倍體積乙醇一起充分攪拌，接著在4℃下靜置30分鐘。然後將各反應混合物溶液在15,000rpm下離心五分鐘，在除去上清液後，將所產生的沉澱與75％(w/w)乙醇溶液一毫升混合之後，攪拌洗滌。將所形成的各溶液離心，除去上清液，在真空中乾燥，然後與去離子水一毫升混合和充分攪拌。用苯酚-硫酸法定量測定每一種所產生的溶液以葡萄糖表示的總糖含量。作為對照，除了採用在100℃下滅活10分鐘的來源於圓孢芽孢桿菌C9，圓孢芽孢桿菌C11，圓孢芽孢桿菌N75以及球形節桿菌A19的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶純化樣品外，用類似以上的方法測定總糖含量。由下列等式計算所形成的葡聚糖含量等式所形成的葡聚糖含量(mg/ml)＝[(待試樣品的總糖含量)]-[(對照樣品的總糖含量)]×20結果在表27中顯示。
表27反應時間所形成的葡聚糖含量(mg/ml)(小時) 菌株C9的酶菌株C11的酶菌株N75的酶菌株A19的酶4 0.00.0 0.0 0.08 0.00.0 0.0 0.0如表27所顯示的，它說明本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶實質上沒有形成葡聚糖的作用或僅具有不可檢測水平的這樣的活性，因為當作用在麥芽四糖上時，它沒有形成葡聚糖。實驗24轉移受體特異性用不同的糖，試驗被檢驗糖是否用作本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的轉移受體。製備D-葡萄糖，D-木糖，L-木糖，D-半乳糖，D-果糖，D-甘露糖，D-阿拉伯糖，D-巖藻糖，D-阿洛酮糖，L-山梨糖，L-鼠李糖，甲基-α-吡喃葡萄糖苷，甲基-β-吡喃葡萄糖苷，N-乙醯基-葡糖胺，山梨糖醇，海藻糖，異麥芽糖，異麥芽三糖，纖維二糖，龍膽二糖，甘油，麥芽糖醇，乳糖，蔗糖，α-環糊精，β-環糊精，γ-環糊精，或L-抗壞血酸的溶液。
向每一種1.6％糖濃度的溶液中添加″PINE-DEX#100″，一種澱粉部分水解物，作為糖供體，給出4％的濃度，與以下任一α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的純化樣品以一單位/g糖供體d.s.b.混合在實驗4-2的方法所獲得的來源於圓孢芽孢桿菌C9的，在實驗7-2的方法獲得的來源於圓孢芽孢桿菌C11的，在實驗11-2的方法獲得的來源於圓孢芽孢桿菌N75的，在實驗15-2的方法所獲得的來源於球形節桿菌A19的。在30℃和pH 6.0下溫育(除pH 8.4用於來源於球形節桿菌A19的酶外)24小時。對酶促反應後的反應混合物在氣相色譜(下文簡化為″GLC″)上分析作為受體的單糖和二糖，用HPLC分析作為受體的三糖，以確認這些糖是否可以用作它們的轉移受體。在進行GLC時，使用下列儀器和條件GLC儀，日本東京Shimadzu公司出售的″GC-16A″；柱，日本東京GL科學公司出售的不鏽鋼柱，直徑3mm長2m，填裝2％″矽氧烷OV17/CHROMOSOLV W″；載氣，在從160℃增加到320℃，增溫速率7.5℃/分鐘的溫度條件下，流速40毫升/分鐘的氮氣；檢測，氫火焰電離檢測器。在HPLC分析的情況下，使用的儀器和條件是HPLC儀，日本東京Tosoh公司出售的″CCPD″；柱，日本東京YMC有限公司出售的″ODS-AQ-303″；洗脫液，流速0.5毫升/分鐘的水；檢測，示差折射計。結果在表28中顯示。
表28轉移反應產物糖菌株C9的酶 菌株C11的酶 菌株N75的酶菌株A19的酶D-葡萄糖 + + + +D-木糖 ++ ++ ++ +L-木糖 ++ ++ ++ +D-半乳糖 + + + ±D-果糖 + + + +D-甘露糖 - - - ±D-阿拉伯糖 ± ± ± ±D-巖藻糖 + + + ±D-阿洛酮糖 + + + +L-山梨糖 + + + +L-鼠李糖 - - - -甲基-α-吡喃葡萄糖苷++ ++ ++ ++甲基-β-吡喃葡萄糖苷++ ++ ++ ++N-乙醯基葡糖胺 + + + -(續)山梨糖醇 - - - -海藻糖 ++ ++ ++++異麥芽糖 ++ ++ +++異麥芽三糖 ++ ++ ++±纖維二糖 ++ ++ ++++龍膽二糖 ++ ++ +++甘油 + + + +麥芽糖醇 ++ ++ ++++乳糖 ++ ++ ++++蔗糖 ++ ++ ++++α-環糊精 - - - -β-環糊精 - - - -γ-環糊精 - - - -L-抗壞血酸 + + + +注在表中，符號「-」，「±」，「+」和「++」意指經過向受體的轉移反應，沒有檢測到糖轉移產物；經過向受體的轉移反應，檢測到低於1％量的糖轉移產物；經過向受體的轉移反應，檢測到1％以上但低於10％量的糖轉移產物；經過向受體的轉移反應，檢測到10％以上量的糖轉移產物。
如表28所顯示的，它說明本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶利用作為轉移受體的不同類型的糖；來源於菌株C9，C11和N75的α-異麥芽糖基葡糖基糖特別是有利地轉移到D-/L-木糖，甲基-α-吡喃葡萄糖苷，甲基-β-吡喃葡萄糖苷，海藻糖，異麥芽糖，異麥芽三糖，纖維二糖，龍膽二糖，麥芽糖醇，乳糖以及蔗糖；然後轉移到D-葡萄糖，D-果糖，D-巖藻糖，D-阿洛酮糖，L-山梨糖，N-乙醯氨基葡萄糖，甘油以及L-抗壞血酸；再後轉移到D-阿拉伯糖。來源於菌株A19的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶特別是轉移到甲基-α-吡喃葡萄糖苷，甲基-β-吡喃葡萄糖苷，海藻糖，纖維二糖，麥芽醇，乳糖以及蔗糖；然後轉移到D-葡萄糖，D-/L-木糖，D-果糖，D-阿洛酮糖，L-山梨糖，異麥芽糖，龍膽二糖，甘油以及L-抗壞血酸；並進一步轉移到D-半乳糖，D-甘露糖，D-阿拉伯糖，D-巖藻糖以及異麥芽三糖。
將以上所描述的本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的性質與以前報導的具有6-葡糖基轉移作用的酶的性質比較一種在″生物科學生物技術和生物化學″Vol.56，pp.169-173(1992)中公開的糊精葡聚糖酶以及一種在″日本Nogeikagaku Kaishi″Vol.37，pp.668-672(1963)中公開的轉葡萄糖苷酶。結果在表29中顯示。
表29性質本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶 糊精葡聚糖酶 轉葡萄糖苷酶菌株C9菌株C11 菌株N75 菌株A19 對照對照水解活性陰性 陰性陰性陰性 陰性主要陽性最適pH 6.0-6.5 6.0 6.08.4 4.0-4.23.5被EDTA抑制 陽性 陽性陽性陽性 陰性陰性如表29所顯示的，本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶具有完全不同於已知糊精葡聚糖酶和轉葡萄糖苷酶的明顯新的物理化學性質。實驗25環四糖的形成用糖進行由α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶與α-異麥芽糖基轉移酶形成環四糖的試驗。為了試驗，製備下列物質的溶液麥芽糖，麥芽三糖，麥芽四糖，麥芽五糖，直鏈澱粉，可溶性澱粉，″PINE-DEX#100″(由日本東京Matsutani化學公司出售的一種澱粉部分水解物)或日本東京wako純化化學工業有限公司出售的來源於牡蠣的糖原。
向各自具有0.5％濃度的這些溶液的每一種中加入1單位/g固體的實驗7-2的方法獲得的來自菌株C11的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的純化樣品，10單位/g固體的實驗7-3的方法獲得的來自菌株C11的α-異麥芽糖基轉移酶的純化樣品，將所產生的混合物在30℃，pH 6.0下進行酶促反應。酶促條件是下列四個系統(1)在使α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶作用於糖溶液24小時後，通過加熱滅活酶，然後使α-異麥芽糖基轉移酶作用於所產生的混合物24小時，通過加熱滅活；(2)在使α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶共同作用於糖溶液24小時後，通過加熱滅活酶；(3)在僅使α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶作用於糖溶液24小時後，通過加熱滅活酶；以及(4)在僅使α-異麥芽糖基轉移酶作用於糖溶液24小時後，通過加熱滅活酶。
為了在加熱之後測定每一種反應混合物中環四糖的形成水平，用實驗1中的類似α-葡萄糖苷酶與葡糖澱粉酶處理反應混合物，以水解剩餘的還原寡糖，其後用HPLC定量環四糖。結果在表30中顯示。
表30環四糖形成產率(％)底物A B C D麥芽糖 4.0 4.20.00.0麥芽三糖 10.2 12.4 0.00.0麥芽四糖 11.3 21.5 0.00.0麥芽五糖 10.5 37.8 0.00.0直鏈澱粉 3.5 31.6 0.00.0可溶性澱粉 5.1 38.2 0.00.0澱粉部分水解物 6.8 63.7 0.00.0糖原 10.2 86.9 0.00.0注符號「A」，「B」，「C」和「D」意指使-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶首先作用在底物上，然後使α-異麥芽糖基轉移酶作用在底物上；使α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α異麥芽糖基轉移酶共同作用在底物上；僅使α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶作用在底物上；僅使α-異麥芽糖基轉移酶作用在底物上。
如表30顯示的，在僅α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶或僅α-異麥芽糖基轉移酶的作用下無環四糖從受試的任何糖形成，但是環四糖是這些酶的協同作用形成的。
結果說明當使α-異麥芽糖基轉移酶在α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶作用之後作用於糖時，形成水平相當低，約11％之下，而當同時使所述酶同時作用於受試任何糖上時，水平增加，特別是，當使它們分別作用於糖原和澱粉部分水解物時，增加至約87％和約64％。
基於α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶的反應性質，估計經由這些酶共同作用的環四糖形成機制如下(1)本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶作用於糖原和澱粉部分水解物等等的α-1，4葡聚糖鏈的非還原端的葡萄糖殘基，葡萄糖殘基分子間轉移到在其它糖原α-1，4葡聚糖鏈非還原端上的葡萄糖殘基的OH-6，形成在非還原端具有α-異麥芽糖基殘基的α-1，4葡聚糖鏈；(2)α-異麥芽糖基轉移酶作用於在非還原端具有α-異麥芽糖基殘基的α-1，4葡聚糖鏈，分子間轉移異麥芽糖基殘基至在非還原端具有異麥芽糖基殘基的其它α-1，4葡聚糖鏈的非還原端葡萄糖殘基的C-3上，形成在非還原端具有異麥芽糖基-1，3-異麥芽糖基殘基的α-1，4葡聚糖鏈；(3)然後，α-異麥芽糖基轉移酶作用於在非還原端具有異麥芽糖基-1，3-異麥芽糖基殘基的α-1，4葡聚糖鏈上，經由分子間轉移反應從α-1，4葡聚糖鏈釋放異麥芽糖基-1，3-異麥芽糖基殘基，並將釋放的異麥芽糖基-1，3-異麥芽糖基殘基環化成環四糖；(4)通過順序的步驟(1)至(3)，環四糖從釋放的α-1，4葡聚糖鏈形成。這樣，估計在如上所述的這種循環方式中，α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶共同作用增加環四糖的形成。實驗26澱粉液化度的影響製備15％玉米澱粉懸液，與0.1％碳酸鈣混合，調節至pH 6.0，然後每克澱粉與0.2-2.0％″TERMAMYL 60L(一種由丹麥哥本哈根Novo IndutriA/S出售的α-澱粉酶樣品)混合，其後在95℃下進行酶促反應10分鐘。此後，在120℃的高壓滅菌反應混合物20分鐘，迅速冷卻到約35℃，以獲得具有3.2-20.5DE(葡萄糖當量)的液化澱粉。向液化澱粉加入2單位/g固體的在實驗7-2的方法中所獲得的來源於菌株C11的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的純化樣品以及20單位/g固體的在實驗7-3的方法所獲得的來源於菌株C11的α-異麥芽糖基轉移酶的純化樣品，接著在35℃下溫育24小時。在反應完成之後，在100℃下加熱反應混合物15分鐘，以滅活剩餘酶。然後，將這樣獲得的反應混合物以類似於實驗1中的α-葡萄糖苷酶和葡糖澱粉酶處理，以水解剩餘的還原寡糖，其後用HPLC定量測定所形成的環四糖。結果在表31中顯示。
表31每克澱粉α-澱粉酶的量(％) DE環四糖產率(％)0.2 3.2 54.50.4 4.8 50.50.6 7.8 44.11.0 12.5 39.81.5 17.3 34.42.0 20.5 30.8如表31所顯示的，它說明經由α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶共同作用的環四糖形成受澱粉液化度的影響，即，液化度或DE值越低，從澱粉形成環四糖的產率越高。相反，液化度或DE值越高，從澱粉形成環四糖的產率越低。它說明適當的液化程度是約20或更低，優選地是約12或更低，更優選地是約5或更低的DE。實驗27澱粉部分水解物濃度的影響製備最終濃度為0.5-40％的″PINE-DEX#100″(一種具有約2到約5 DE值的澱粉部分水解物)的水溶液，分別與1單位/g固體的在實驗7-2的方法中所獲得的來源於菌株C11的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的純化樣品以及10單位/g固體的在實驗7-3的方法所獲得的來源於菌株C11的α-異麥芽糖基轉移酶的純化樣品混合，接著在30℃，pH6.0下使這些酶共同作用48小時。在反應完成之後，在100℃下加熱反應混合物15分鐘，以滅活剩餘酶。然後，將這樣獲得的反應混合物以類似於實驗1中的α-葡萄糖苷酶和葡糖澱粉酶處理，以水解剩餘的還原寡糖，其後用HPLC定量測定所形成的環四糖。結果在表32中顯示。
表32PINE-DEX濃度(％) 環四糖形成產率(％)0.563.62.562.05 60.410 57.315 54.620 51.330 45.940 35.9表32所顯示的，環四糖的形成產率在0.5％低濃度時是約64％，而在約40％高濃度時是約40％。事實表明環四糖的形成產率依作為底物的澱粉部分水解物的濃度增加。結果說明環四糖的形成產率隨澱粉部分水解物的減少而增加。實驗28添加環糊精葡聚糖轉移酶的影響製備15％″PINE-DEX#100″(一種澱粉部分水解物)的水溶液，與1單位/g固體的在實驗7-2的方法中所獲得的來源於菌株C11的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的純化樣品，10單位/g固體的在實驗7-3的方法所獲得的來源於菌株C11的α-異麥芽糖基轉移酶的純化樣品，0-0.5單位/g固體的來源於微生物嗜熱脂肪芽孢桿菌的環糊精葡聚糖轉移酶(CGTase)混合，接著在30℃，pH6.0下使這些酶共同作用48小時。在反應完成之後，在100℃下加熱反應混合物15分鐘，以滅活剩餘酶。然後，將這樣獲得的反應混合物以類似於實驗1中的α-葡萄糖苷酶和葡糖澱粉酶處理，以水解剩餘的還原寡糖，其後用HPLC定量測定所形成的環四糖。結果在表33中顯示。
表33添加的CGTase的量(單位) 環四糖形成產率(％)054.62.5 60.1563.110 65.2如表33所顯示的，添加CGTase增加環四糖形成產率。實驗29環四糖的製備製備約100L玉米植物糖原(由日本東京Q.P.公司出售)的4％(w/v)水溶液，調整到pH 6.0和30℃，然後與1單位/g固體的在實驗7-2的方法中所獲得的來源於菌株C11的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的純化樣品，10單位/g固體的在實驗7-3的方法所獲得的來源於菌株C11的α-異麥芽糖基轉移酶的純化樣品混合，接著溫育48小時。在反應完成之後，在100℃下加熱反應混合物10分鐘，以滅活剩餘酶。然後，取出部分反應混合物，用HPLC定量測定環四糖產率，說明它含約84％的環四糖(以糖組合物為基礎)。將反應混合物調整到pH 5.0和45 C，以類似於實驗1中的α-葡萄糖苷酶和葡糖澱粉酶處理，以水解剩餘的還原寡糖，等等。通過添加氫氧化鈉將pH調整到5.8，然後在90℃溫育1小時，以滅活剩餘酶，過濾以除去不溶性物質。用逆滲透膜濃縮濾液，給出約16％(d.s.b.)的濃度，按通常的方式對濃縮物脫色、脫鹽、過濾和濃縮，獲得具有約3,700g固體含量的糖溶液約6.2kg。
將糖溶液進樣到填充有約225L″AMBERLITE CR-1310(Na型)″(一種由日本東京日本Organo公司出售的離子交換樹脂)的柱，在60℃柱溫和約45 L/h流速下進行色譜。而來源於柱的糖組合物洗脫物如實驗1中所描述的由HPLC監測，收集至少98％純度的環四糖組份，按通常的方式脫鹽，脫色，過濾以及濃縮，以獲得約2,500g固體含量的糖溶液約7.5kg。糖溶液糖組合物的HPLC測定說明它包含具有約99.5％純度的環四糖。實驗30環四糖在水溶液中的結晶由在實驗29的方法獲得的具有至少98％純度的環四糖組份經蒸發濃縮，以給出約50％，d.s.b的濃度。將約5千克濃縮物置於在一圓柱形塑料容器中，通過輕輕旋轉條件下約20小時將溫度從65℃降低至20℃使其結晶，獲得一種白色晶體粉末。圖45是最終環四糖的顯微照片。經離心濾膜分離上述結晶型濃縮物，獲得溼重1,360g的晶體產物，將其進一步在60℃下乾燥3小時，獲得1,170g環四糖結晶粉末。晶體粉末的HPLC測定說明它含有至少99.9％的非常高純度的環四糖。
當以粉末x-光衍射分析分析時，晶體粉末形式的環四糖具有圖46中特徵性主要衍射角度(2θ)10.1°，15.2°，20.3°以及25.5°的衍射光譜。晶體粉末的Karl Fischer法揭示它具有13.0％的水份含量，導致發現其是具有每1摩爾晶體5或6摩爾水的環四糖晶體。
晶體形式環四糖的熱重量分析給出圖47的熱重量曲線。基於重量變化和溫度之間的相關性，成功地發現，觀察到直到150℃相當於4或5摩爾水的重量降低，在約250℃相當於1摩爾水的重量降低，在280℃或更高的溫度下相當於環四糖分解的重量降低。這些結果證實，當在正常壓力下加熱至150℃時，本發明的環四糖晶體，五或六水合物釋放4或5摩爾水變成一水合物晶體，並且直到加熱到高達250℃時，進一步釋放1摩爾的水變成一種無水晶體。實驗31轉化成環四糖一水合物將由實驗30的方法獲得的結晶粉末形式的環四糖五或六水合物置於玻璃容器中並保持在油浴(其已經在140℃預熱)中30分鐘。與從完整環四糖五或六水合物的粉末x-光衍射分析的結果很不相同，由此獲得的環四糖粉末x-光分析給出圖48中具有主要衍射角度(2θ)8.3°，16.6°，17.0°以及18.2°的特徵性衍射光譜。晶體粉末的Karl Fischer法揭示它具有2.7％的水份含量，導致發現其是具有每1摩爾晶體1摩爾水的環四糖晶體。晶體粉末環四糖的熱重量分析給出圖49的熱重量曲線。基於重量變化和溫度之間的相關性，發現，觀察到在約270℃相當於1摩爾水的重量降低，進一步觀察到在約290℃或更高的溫度下相當於環四糖本身分解的重量降低。這些結果證實，這一實驗中的環四糖晶體是環四糖一水合物。實驗32轉化成無水晶體將由實驗30的方法獲得的結晶粉末形式的環四糖五或六水合物在40℃和120℃下真空乾燥16小時。所形成的晶體粉末的Karl Fischer法揭示在40℃乾燥的具有4.2％的水份含量，在120℃乾燥的具有0.2％的水份含量，表明它基本上是無水的。與環四糖五或六水合物以及真空乾燥前的環四糖一水合物的粉末x-光衍射分析的結果很不相同，以上在40℃和120℃下真空乾燥過的環四糖的x-光分析在圖50中給出具有主要衍射角度(2θ)10.8°，14.7°，15.0°，15.7°和21.5°的特徵性衍射光譜。雖然在兩種衍射譜之間的峰水平上發現差異，但它們具有實質上相同的峰衍射角度，從晶體照相術上判斷它們實質上是相同的晶體一水合物。衍射譜基線顯示出類似山的格式，並且晶體一水合物的結晶度低於環四糖五或六水合物以及真空乾燥前的環四糖一水合物的結晶度，這些事實揭示存在一種無定形環四糖。基於這些，估計通過在40℃真空乾燥獲得的具有約4.2％水份含量的環四糖粉末是具有這樣水份含量的無定形環四糖與無水晶體環四糖的混合粉末。這些數據說明環四糖五或六水合物被在真空中乾燥時轉化成無定形和無水形式的環四糖。0.2％水份含量的無水環四糖的熱重量分析(如同在實驗31中實施的)僅觀察到圖52所示的重量降低，被認為在約270℃或更高的溫度下由熱分解引起，如圖52所示。實驗33環四糖在水中的飽和濃度為了研究10-90℃下環四糖在水中的飽和濃度，將10毫升水置於帶密封帽的玻璃容器中，然後以超過各溫度下完全溶解水平的過量水平與實驗30的方法獲得的環四糖五或六水合物混合，密封並攪拌兩天，同時保持在10-90℃的各溫度下，直到飽和。將所形成的各環四糖飽和溶液進行膜過濾，以除去未溶解的環四糖，經乾燥失重法檢測保溼含量，以確定環四糖在各溫度下的飽和濃度。結果在表34中顯示。
表34溫度(℃) 飽和濃度(％)10 30.330 34.250 42.670 53.090 70.5實驗34熱穩定性將實驗30的方法獲得的晶體環四糖五或六水合物溶解在水中，配成10％(w/v)的環四糖水溶液，將其8毫升置於玻璃試管中，其後密封試管，在120℃加熱水溶液30-90min。在加熱之後，將水溶液在大氣條件下冷卻，測定色度(coloration degree)，並用HPLC測定純度。基於480nm波長下1cm光通過的池中的吸光度評價色度。結果在表35中顯示。
表35加熱時間(分鐘) 色度(A480nm) 純度(％)00.00 10030 0.00 10060 0.00 10090 0.00 100如表35所顯示的，它說明環四糖是熱穩定性糖，因為即使在120℃的高溫下加熱時環四糖的水溶液不是有色的，並且糖組合物的純度不降低。實驗35pH穩定性將實驗30的方法獲得的晶體環四糖五或六水合物溶解在具有不同pH的20mM緩衝液中，配成具有2-10的pH值的4％(w/v)的環四糖水溶液，將其8毫升置於玻璃試管中，其後密封試管，在100℃加熱水溶液24小時。在冷卻之後，測定各溶液的色度，並用HPLC測定純度。基於480nm波長下1cm光通過的池中的吸光度評價色度。結果在表36中顯示。
表36pH色度 純度(緩衝液類型) (A480nm) (％)2.0 (乙酸鹽緩衝液) 0.00933.0 (乙酸鹽緩衝液) 0.00 1004.0 (乙酸鹽緩衝液) 0.00 1005.0 (乙酸鹽緩衝液) 0.00 1006.0 (Tris-HCl緩衝液)0.00 1007.0 (Tris-HCl緩衝液)0.00 1008.0 (Tris-HCl緩衝液)0.00 1009.0 (銨鹽緩衝液)0.00 10010.0(銨鹽緩衝液)0.00 100如表36所顯示的，即使在2至10寬範圍的pH下於100℃加熱24小時，環四糖的水溶液也是無色的，在從3至10的pH範圍內，糖組合物的純度一點也不降低，儘管在pH 2下純度稍有降低。這些事實說明環四糖在比較寬的pH範圍內，即，從酸性pH 3至5，中性的pH 6至8，鹼性pH 9至10的範圍內是高度穩定的。實驗36氨基羰基反應將實驗30的方法獲得的晶體環四糖五或六水合物溶解在水中，然後，與市售的特等甘氨酸和磷酸緩衝液混合，所形成的混合物用50mM緩衝液調整到pH 7.0，獲得包含1％(w/v)甘氨酸的10％(w/v)環四糖溶液。將4毫升置於玻璃試管中，其後密封試管，在100℃加熱30-90min。在使其在室溫下靜置冷卻後，測定所形成的各溶液的色度，以測定它們的氨基羰基反應性。基於480nm波長下1cm光通過的池中的吸光度評價色度。結果在表37中顯示。
表37加熱時間(分鐘) 色度(A480nm)00.0030 0.0060 0.0090 0.00如表37所顯示的，即使在甘氨酸存在下加熱，環四糖也不是有色的，意味著，所說的糖不被甘氨酸誘導褐變，即，環四糖是穩定的糖，其不引起氨基羰基反應，別名Maillard反應。實驗37氨基羰基反應將實驗30的方法獲得的晶體環四糖五或六水合物和市售的聚腖(Nihonseiyaku K.K.，日本東京)溶解在去離子水中，獲得含5％(w/v)聚腖的10％(w/v)環四糖溶液。將4毫升置於玻璃試管中，其後密封試管，在100℃加熱30-90min。在使其在室溫下靜置冷卻後，測定所形成的各溶液的色度，以測定它們的氨基羰基反應性。平行對照，提供僅具有聚腖溶液，如上進行類似處理。基於在480nm波長下1cm光通過的池中的測定的吸光度減去對照的吸光度評價色度。結果在表38中顯示。
表38加熱時間(分鐘) 色度(A480nm)0 0.00300.00600.00900.00如表38所顯示的，它說明當在聚腖存在下加熱時，環四糖不被聚腖誘導褐變，即，糖是穩定的糖，其實質上不引起氨基羰基反應。實驗38包含作用將實驗30的方法獲得的晶體環四糖五或六水合物溶解在去離子水中，獲得20％(w/v)環四糖水溶液。向100g水溶液中添加將要由環四糖包含的2g甲醇，3g乙醇，或4.6g乙酸。此後，將所產生的各溶液過濾，以除去非包含產物，在真空中乾燥濾液。作為對照，經使用″ISLOELITETMP″(由日本東京Maruha K.K.出售的分支環糊精，已知其具有包含能力)製備類似的包含產物。
為了測定在所產生的凍乾粉中包含產物的量，將每一種粉末1克溶解在5毫升水中，之後在與5毫升二乙醚混合後抽提。重複抽提，所產生的抽提物以氣相色譜定量測定。結果在表39中顯示。
表39包含產物 包含量(mg/g凍乾粉)環四糖 ISOELITE P(對照)甲醇6.71 2.92乙醇17.268.92乙酸67.7430.57如表39所顯示的，它說明環四糖具有比分支環糊精高2倍的包含能力。實驗39甜化能力將實驗30的方法獲得的晶體環四糖五或六水合物溶解在去離子水中，獲得環四糖的10-30％(w/v)水溶液，用作甜化試驗的受試溶液。用市售的顆粒糖的6％(w/v)水溶液作為標準，用八個專門小組進行感官試驗，結果，環四糖的甜化能力是蔗糖的約27％。實驗40消化試驗使用實驗30的方法獲得的晶體環四糖五或六水合物，按照K.Okada等在日本營養和食品科學學會雜誌(Journal of Japanese Society ofNutrition and Food Science)，Vol.43，No.1，pp.23-29(1990)中報導的方法進行環四糖體外唾液澱粉酶，合成胃液，胰澱粉酶以及腸黏膜酶可消化性試驗。作為對照，使用已知基本上不被消化的麥芽糖醇。結果在表40中顯示。
表40消化酶 消化酶的分解比例(％)環四糖 麥芽糖醇(對照)唾液澱粉酶 0.0 0.0合成胃液 0.0 0.0胰澱粉酶 0.0 0.0小腸黏膜酶 0.74 4.0如表40所顯示的，環四糖完全不被唾液澱粉酶，合成胃液，胰澱粉酶被消化，但是稍微被腸黏膜酶消化，低至0.74％，相當於對照的1/5。這些結果證實環四糖是一種高度不可消化的糖。實驗41發酵試驗使用實驗30的方法獲得的晶體環四糖五或六水合物，按照T.Oku在日本營養科學和食品科學學會雜誌(Journal of Nutritional Scienceand Vitaminology)，Vol.37，No.1，pp.529-544(1991)中的方法進行環四糖由大鼠盲腸內含物可發酵性的試驗。經以乙醚麻醉Wister雄性大鼠使大鼠死去收集大鼠盲腸內含物，在厭氧條件下收集內含物，用4倍體積的0.1M碳酸氫鈉水溶液懸浮內含物。添加重量為7％的環四糖到盲腸內含物中，用氣相色譜定量分析剛添加內含物後和添加12小時後仍然剩餘的環四糖的含量。結果，前者和後者環四糖的含量分別是每1克大鼠盲腸內含物68.0mg和63.0mg。這些數據證實環四糖實質上是不可發酵的糖。實驗42同化試驗使用實驗30的方法獲得的晶體環四糖五或六水合物，按照「A ColorAtlas of Anaerobic Bacteria」(由Tomotari MITSUOKA編輯，由日本東京Kabushiki Kaisha Sobunsha出版，(1984))公開的方法研究環四糖被大鼠盲腸內含物的同化。將約107CFU(集落形成單位)的預培養的新鮮微生物接種到5毫升與0.5％環四糖混合的PYF培養基中，在厭氧條件下37℃培養4天。作為對照，將葡萄糖用作易同化的糖。當後培養物具有pH 6.0或更高時，判斷可同化性為陰性，當後培養物具有低於6.0的pH時，判斷可同化性為陽性。可同化性的判斷通過用採用蒽酮法測定降低的糖水平來測定保持在培養物中的糖含量證實。結果在表41中顯示。
表41腸內微生物菌株 可同化性環四糖葡萄糖(對照)普通擬桿菌JCM 5826- +青春雙歧桿菌JCM 1275 - +產氣莢膜梭菌JCM 3816 - +大腸桿菌IFO 3301 - +產氣假桿菌ATCC 25986 - +嗜酸乳桿菌JCM 1132- +
如表41所顯示的，證實環四糖不被所有受試菌株同化，但是作為對照的葡萄糖被所有受試菌株同化。這樣，證實環四糖是高度不被腸內微生物同化的糖。實驗43急性毒性試驗實驗30的方法獲得的晶體環四糖五或六水合物的急性毒性經口服施用到小鼠進行試驗。結果說明環四糖具有比較低的毒性，沒有引起小鼠死亡，即使以最高的可能的劑量施用時。基於這一點，環四糖的LD50是至少50g/kg小鼠體重，儘管數據不那麼精確。
基於實驗40至43的結果，口服施用環四糖時，其實質上不被活體同化或吸收，可以預期以食物甜味劑，具有相當高的甜化能力的甜味劑添加劑，粘性劑，藥膳添加劑和主料被用作非-或低熱可食用原料以及可以進一步地用作替代脂肪的可食用纖維與食品原料。
以下實施例A描述環四糖和產生包含它的糖組合物的方法，實施例B描述了包含環四糖或糖組合物的組合物實施例A-1依據實驗3中方法在發酵罐中培養微生物圓孢芽孢桿菌C9(FERMBP-7143)48小時。在培養完成之後，對所形成的培養物用SF膜過濾，以除去細胞，收集18L培養上清液。然後，用UF膜濃縮培養上清液，以收集約一升包含8.8單位/ml本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和26.7單位/mlα-異麥芽糖基轉移酶的濃縮酶溶液。
將土豆澱粉製備成約2％的澱粉懸液，與氯化鈣混合，給出1mM終濃度，調節至pH 6.0，95℃加熱約20分鐘以膠化澱粉。然後將所產生的混合冷卻至35℃，與0.25ml上述濃縮酶溶液(對每1克澱粉(d.s.b.))混合，接著在pH 6.0和35℃下進行酶促反應48小時。將反應混合物加熱，並在95℃下保持10分鐘，然後冷卻和過濾。濾液按常規方式用活性炭脫色，用H-和OH-型離子交換劑脫鹽和純化，進一步濃縮和噴霧乾燥，以約90％(d.s.b.)的產率(對原料澱粉而言)獲得包含環四糖的粉末。
因為產物包含(基於幹固體重)0.7％葡萄糖，1.4％異麥芽糖，11.1％麥芽糖，62.1％環四糖以及24.7％其它糖，並具有適合的甜度，足夠的粘性，水份保持能力以及包含能力，它可以有利地用於各種組合物，如食品，化妝品以及藥物，作為甜味劑，味道改善劑，質量改善劑，脫水收縮阻止劑，穩定劑，脫色阻止劑，填充劑，包含劑以及粉碎基質。實施例A-2將土豆澱粉製備成約6％懸液，與碳酸鈣混合，給出0.1％的終濃度，調整到pH 6.0，進一步與0.2％/g澱粉(d.s.b.)的″TERMAMYL 60L″(一種丹麥哥本哈根Novo Industri A/S出售的α-澱粉酶)混合，然後在約95℃加熱10分鐘。此後將混合物在120℃下高壓滅菌20分鐘，迅速冷卻到約35℃，以獲得具有約4的DE(葡萄糖當量)的液化溶液。向液化溶液中添加0.25ml/g澱粉(d.s.b.)的實施例A-1的包含α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶的濃縮酶溶液。在pH 6.0和35℃下進行酶促反應48小時。加熱反應混合物，在95℃保持10分鐘，然後冷卻和過濾。濾液按常規方式用活性炭脫色，用H-和OH-型離子交換劑脫鹽和純化，以約90％(d.s.b.)的產率(對原料澱粉而言)濃縮成60％的環四糖糖漿。
因為產物包含(基於幹固體重)0.9％葡萄糖，1.5％異麥芽糖，11.3％麥芽糖，60.1％環四糖以及26.2％其它糖，並具有適合的甜度，足夠的粘性，水份保持能力以及包含能力，它可以有利地用於各種組合物，如食品，化妝品以及藥物，作為甜味劑，味道改善劑，質量改善劑，脫水收縮阻止劑，穩定劑，脫色阻止劑，填充劑和包含劑。實施例A-3依據實驗6中方法在發酵罐中培養微生物圓孢芽孢桿菌C11(FERMBP-7144)48小時。在培養完成之後，對所形成的培養物用SF膜過濾，以除去細胞，收集18L培養上清液。然後，用UF膜濃縮培養上清液，以收集約一升包含9.0單位/ml本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和30.2單位/mlα-異麥芽糖基轉移酶的濃縮酶溶液。將木薯澱粉製備成約25％澱粉懸液，然後與0.2％/g澱粉(d.s.b.)的″NEO-SPITASE″(一種日本京都Nagase生物化學有限公司出售的α-澱粉酶)混合。此後，將反應混合物在120℃下高壓滅菌20分鐘，迅速冷卻到約35℃，以獲得具有約4的DE的液化溶液。向液化溶液中添加0.25ml/g澱粉(d.s.b.)的上述包含α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶的濃縮酶溶液，並進一步添加10單位/g澱粉(d.s.b.)的CGTase(日本Okayama的Hayashibara生化實驗室公司出售)。接著在pH 6.0和35℃下進行酶促反應48小時。加熱反應混合物，在95℃保持30分鐘，然後冷卻和過濾。調整到pH 5.0和50℃，與300單位/g澱粉(d.s.b.)的″TRANSGLUCOSIDASEL AMANOTM″(一種由日本Aichi的Amano藥物公司出售的α-葡萄糖苷酶)混合，其後進行24小時的酶促反應。進一步將反應混合物與30單位/g澱粉(d.s.b.)的″GLUCOZYME″(一種由日本京都Nagase生物化學公司出售的葡糖澱粉酶製劑)混合，然後進行酶促反應17小時。對這樣獲得的反應混合物加熱，在95℃保持30分鐘，接著冷卻和過濾，以獲得濾液。所形成的濾液按常規方式用活性炭脫色，用H-和OH-型離子交換劑脫鹽和純化，以約90％(d.s.b.)的產率(對原料澱粉而言)濃縮成60％的環四糖糖漿。
因為產物包含(基於幹固體重)38.4％種葡萄糖，58.1％環四糖以及3.5％其它糖，並具有適合的甜度，足夠的粘性，水份保持能力以及包含能力，它可以有利地用於各種組合物，如食品，化妝品以及藥物，作為甜味劑，味道改善劑，質量改善劑，脫水收縮阻止劑，穩定劑，脫色阻止劑，填充劑和包含劑。實施例A-4將土豆澱粉製備成約20％懸液，與碳酸鈣混合，給出0.1％的終濃度，調整到pH 6.5，進一步與0.3％/g澱粉(d.s.b.)的″TERMAMYL 60L″(一種丹麥哥本哈根Novo Industri A/S出售的α-澱粉酶)，然後在約95℃進行酶促反應15分鐘。此後將混合物在120℃下高壓滅菌20分鐘，迅速冷卻到約35℃，以獲得具有約4的DE的液化溶液。向液化溶液中添加0.25ml/g澱粉(d.s.b.)的實施例A-3的包含α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶的濃縮酶溶液。在pH 6.0和35℃下進行酶促反應48小時。加熱反應混合物，在95℃保持30分鐘，調整到pH 5.0和50℃，在加入300單位/g澱粉(d.s.b.)的″TRANSGLUCOSIDASE LAMANOTM″(一種由日本Aichi的Amano藥物公司出售的α-葡萄糖苷酶)後進行24小時的酶促反應。接著在加入30單位/g澱粉(d.s.b.)的″GLUCOZYME″(一種由日本京都Nagase生物化學公司出售的葡糖澱粉酶製劑)後進行酶促反應17小時。對這樣獲得的反應混合物加熱，在95℃保持30分鐘，接著冷卻和過濾，以獲得濾液。所形成的濾液按常規方式用活性炭脫色，用H-和OH-型離子交換劑脫鹽和純化，以約90％(d.s.b.)的產率(對原料澱粉而言)濃縮成60％的環四糖糖漿。
因為產物包含(基於幹固體重)34.2％葡萄糖，62.7％環四糖以及3.1％其它糖，並具有適合的甜度，足夠的粘性，水份保持能力以及包含能力，它可以有利地用於各種組合物，如食品，化妝品以及藥物，作為甜味劑，味道改善劑，質量改善劑，脫水收縮阻止劑，穩定劑，脫色阻止劑，填充劑和包含劑。實施例A-5對在實施例A-3的方法所獲得的環四糖糖漿用″AMBERLITE CR-1310(Na型)″(由日本東京日本Organo公司出售的一種強酸性陽離子交換樹脂)進行柱色譜，將樹脂填充到具有5.4cm直徑的四個外套不鏽鋼柱中，然後系列級聯它們給出20m的總凝膠床寬度。在保持內部柱溫60℃的條件下，將糖漿以5％(v/v)體積上樣到柱上，經以0.13的SV(空速)加入加熱到60℃的熱水到柱上進行分級分離，同時用HPLC檢測洗脫物的糖組成，以獲得高環四糖含量的組份，然後純化組份，以約21％(d.s.b.)的產率(對原料澱粉而言)獲得高環四糖含量溶液。溶液包含約98％(d.s.b.)的環四糖。
濃縮溶液，給出約70％的濃度，然後置於結晶器中，與2％的晶體環四糖五或六水合物混合，逐漸冷卻，獲得約45％結晶度的糖膏。將糖膏以150kg/cm2高壓從裝備在乾燥塔頂端上的噴管噴射。同時將空氣加熱到85℃，使所加熱的熱空氣從乾燥塔的上部吹出，所產生的晶體粉末收集到在塔底部提供的輸送線運輸機上，從塔逐漸移出，同時向其上吹加熱到45℃的熱空氣。將所產生的晶體粉末注射到熟化塔熟化10小時，同時將熱空氣吹到內含物上以完成結晶和乾燥，獲得環四糖五或六水合物的晶體粉末。
因為產物具有比較低的還原性，既不引起氨基羰基反應也不顯示吸水性，並具有令人滿意的可操作性，適當的低甜度，足夠的粘性，水份保持能力，包含能力，實質上的不可消化性，它可以有利地用於各種組合物，如食品，化妝品以及藥物，作為甜味劑，相對低熱量食品原料，風味和味道改善劑，質量改善劑，脫水收縮阻止劑，穩定劑，脫色阻止劑，填充劑，包含劑和以及粉碎基質。實施例A-6為了增加實施例A-4的方法所獲得的環四糖糖漿中的環四糖含量，依據實施例A-5的方法用強酸性陽離子交換樹脂對作為原料糖溶液的糖漿進行柱色譜，其後收集和純化高環四糖含量的組份，以約90％(d.s.b.)的產率(對原料澱粉而言)獲得高環四糖含量的溶液。
濃縮溶液，給出約85％濃度，然後逐漸冷卻，同時攪拌以進行結晶。將所產生的物質轉移到一塑料容器，使其在室溫下靜置結晶，並熟化內含物。所產生的塊用刀具研磨成粉末，獲得環四糖五或六水合物的晶體粉末。
因為產物實質上沒有吸水性，並具有令人滿意的可操作性，適當的低甜度，足夠的粘性，水份保持能力，包含能力，實質上的不可消化性，它可以有利地用於各種組合物，如食品，化妝品以及藥物，作為甜味劑，相對低熱量食品原料，風味和味道改善劑，質量改善劑，脫水收縮阻止劑，穩定劑，脫色阻止劑，填充劑，包含劑和以及粉碎基質。實施例A-7使實施例A-6的方法獲得的高環四糖含量的溶液繼續結晶，同時濃縮。所產生的糖膏由懸筐型離心機分離，以獲得晶體，然後與少量的水噴霧，以約55％(d.s.b.)的產率(對原料澱粉而言)獲得高純度的環四糖五或六水合物。
因為產物包含至少98％(d.s.b.)的高純度的晶體環四糖五或六水合物，具有比較低的還原性，實質上既不引起氨基羰基反應也不顯示吸水性，並具有令人滿意的可操作性，適當的低甜度，足夠的粘性，水份保持能力，包含能力，實質上的不可消化性，它可以有利地用於各種組合物，如食品，化妝品以及藥物，作為甜味劑，相對低熱量食品原料，風味和味道改善劑，質量改善劑，脫水收縮阻止劑，穩定劑，脫色阻止劑，填充劑，包含劑和以及粉碎基質。實施例A-8將由5.0％(w/v)玉米植物糖原，1.0％(w/v)″ASAHIMEAST″(一種酵母提取物)，0.1％(w/v)磷酸氫二鉀，0.06％(w/v)磷酸鈉十二水合物，0.05％(w/v)硫酸鎂六水合物，和水組成的液體營養培養基以20L的量置於30L發酵罐中，121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻到27℃，然後接種1.0％(w/v)圓孢芽孢桿菌C11菌株(FERM BP-7144)的按照實驗6的方法製備的種子培養物，在通氣和攪拌條件下於27℃和pH 6.0-7.0培養72小時。所產生的培養物通過在121℃加熱20分鐘滅菌，冷卻離心。收集上清液，並用UF膜過濾。所產生的濾液按常規方式用活性炭脫色，用H-和OH-型離子交換劑脫鹽和純化，以約40％(d.s.b.)的產率(對原料植物糖原而言)獲得環四糖。這樣獲得的溶液包含約87％(d.s.b.)的環四糖。
使上述溶液繼續結晶，同時濃縮。所產生的糖膏由懸筐型離心機分離，以獲得晶體，然後與少量的水噴霧，以約25％(d.s.b.)的產率(對原料植物糖原而言)獲得具有至少98％純度的環四糖五或六水合物。
因為產物高純度環四糖五或六水合物具有比較低的還原性，實質上既不引起氨基羰基反應也不顯示吸水性，並具有令人滿意的可操作性，適當的低甜度，足夠的粘性，水份保持能力，包含能力，實質上的不可消化性，它可以有利地用於各種組合物，如食品，化妝品以及藥物，作為甜味劑，相對低熱量食品原料，風味和味道改善劑，質量改善劑，脫水收縮阻止劑，穩定劑，脫色阻止劑，填充劑，包含劑和以及粉碎基質。實施例A-9依據實驗10中方法在發酵罐中培養微生物圓孢芽孢桿菌N75(FERMBP-7591)48小時。在培養完成之後，對所形成的培養物用SF膜過濾，以除去細胞，收集18L培養上清液。然後，用UF膜濃縮培養上清液，以收集約800毫升包含6.0單位/m1本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和20.0單位/mlα-異麥芽糖基轉移酶的濃縮酶溶液。將玉米澱粉製備成約30％的澱粉懸液，與碳酸鈣混合，給出0.1％的濃度，調節至pH 6.5，與0.3％/g澱粉(d.s.b.)的″TERMAMYL 60L″(一種丹麥哥本哈根NovoIndustri A/S出售的α-澱粉酶)混合，在95℃進行酶促反應15分鐘。此後將混合物在120℃下高壓滅菌20分鐘，迅速冷卻到約51℃，以獲得具有約4的DE的液化溶液。向液化溶液中添加0.4ml/g澱粉(d.s.b.)的上述包含α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶的濃縮酶溶液以及3單位/g澱粉(d.s.b.)的CGTase(日本Okayama的Hayashibara生化實驗室公司出售)。接著在pH 5.5和51℃下進行酶促反應48小時。此後加熱反應混合物，在95℃保持30分鐘，調整到pH 5.0和50℃，在加入300單位/g固體的″TRANSGLUCOSIDASE L AMANOTM″(一種由日本Aichi的Amano藥物公司出售的α-葡萄糖苷酶)後進行24小時的酶促反應。然後在加入20單位/g固體的″GLUCOZYME″(一種由日本京都Nagase生物化學公司出售的葡糖澱粉酶製劑)後進行酶促反應17小時。對這樣獲得的反應混合物加熱，在95℃保持30分鐘，冷卻和過濾。所形成的濾液按常規方式用活性炭脫色，用H-和OH-型離子交換劑脫鹽和純化，獲得含有44.0％(d.s.b.)的環四糖糖漿。為了增加環四糖含量，依據實施例A-5的方法用強酸性陽離子交換樹脂對作為原料糖溶液的糖漿進行柱色譜，其後收集和純化高環四糖含量的組份，接著濃縮和噴霧乾燥所述組份，以約45％(d.s.b.)的產率(對原料澱粉而言)獲得含有環四糖的粉末。
因為產物包含(基於幹固體重)3.7％葡萄糖，80.5％環四糖以及15.8％其它糖，並具有適合的甜度，足夠的粘性，水份保持能力以及包含能力，它可以有利地用於各種組合物，如食品，化妝品以及藥物，作為甜味劑，味道改善劑，質量改善劑，脫水收縮阻止劑，穩定劑，脫色阻止劑，填充劑，包含劑以及粉碎基質。實施例A-10依據實驗14中方法在發酵罐中培養微生物圓孢芽孢桿菌A19(FERMBP-7590)48小時。在培養完成之後，對所形成的培養物用SF膜過濾，以除去細胞，收集18L培養上清液。然後，用UF膜濃縮培養上清液，以收集約1升包含15.2單位/ml本發明的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和23.0單位/mlα-異麥芽糖基轉移酶的濃縮酶溶液。
將土豆澱粉製備成約5％的澱粉懸液，然後與碳酸鈣混合，給出0.1％的濃度，調節至pH 6.0，與0.2％/g澱粉(d.s.b.)的″TERMAMYL 60L″(一種丹麥哥本哈根Novo Industri A/S出售的α-澱粉酶)混合，在95℃進行酶促反應10分鐘。此後將混合物在120℃下高壓滅菌20分鐘，迅速冷卻到約40℃，以獲得具有約4的DE的液化溶液。向液化溶液中添加0.5ml/g澱粉(d.s.b.)的由上述方法獲得的包含α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶的濃縮酶溶液，接著在pH 6.0和40℃下進行酶促反應48小時。加熱反應混合物，在95℃保持10分鐘，冷卻和過濾。所形成的濾液按常規方式用活性炭脫色，用H-和OH-型離子交換劑脫鹽和純化，以約90％(d.s.b.)的產率(對原料澱粉而言)獲得含有70％(w/v)環四糖的糖漿。
因為產物包含(基於幹固體重)2.5％葡萄糖，6.3％異麥芽糖以及30.1％環四糖，具有適合的甜度，足夠的粘性，水份保持能力以及包含能力，它可以有利地用於各種組合物，如食品，化妝品以及藥物，作為甜味劑，味道改善劑，質量改善劑，脫水收縮阻止劑，穩定劑，脫色阻止劑，填充劑以及包含劑。實施例B-1甜味劑向0.8重量份的實施例A-7的方法獲得晶體四糖五或六水合物均勻加入0.2重量份的″TREHA″(由日本Okayama的Hayashibara Shoji公司出售的一種晶體海藻糖水合物)，0.01重量份的″αGSWEETTM″(由日本東京Toyo糖精煉公司出售的α-葡基斯替維苷)以及0.01重量份的″ASPALTAME″(L-天冬醯基-L-苯基丙氨酸甲酯)，將所形成的混合物加入到造粒機中，獲得顆粒狀的甜味劑。產物具有令人滿意的甜度和高於蔗糖2倍的甜化能力。因為晶體的環四糖五或六水合物簡直不被消化和發酵，並且實質上無卡路裡，就甜化能力而言，產物的卡路裡是蔗糖的約1/10。此外，在室溫貯存時，產物實質不變質並且穩定。這樣，產物可以適合地用作高質低熱和少熱的甜味劑。實施例B-2硬糖果100重量份的55％(w/v)蔗糖溶液在加熱的同時與50重量份的實施例A-2的方法獲得的環四糖的糖漿混合。然後通過在減壓下加熱濃縮混合物，給出不到2％的水份含量，將濃縮物與0.6重量份的檸檬酸和充足量的檸檬香料混合，其後以通常的方式將其製備成所需產物。產物是穩定的高質硬糖，具有令人滿意的口感，味道和香味，很少吸附吸收水份，並且既不引起蔗糖結晶也不引起熔化。實施例B-3口香糖將3重量份的口香糖基料加熱熔化至柔軟的程度，與2重量份的無水晶體麥芽醇，2重量份的木糖醇，2重量份的實施例A-7的方法獲得的晶體環四糖五或六水合物混合，並且進一步與1重量份的海藻糖以及適量的香料和顏料混合。以通常的方式滾動捏制混合物，造型並包裝，獲得所需產物。這樣獲得的產物是具有令人滿意的質地，味道和香味的相對低產熱和熱值的口香糖。實施例B-4甜化牛奶在100重量份的新鮮的牛奶中溶解2重量份的實施例A-5的方法獲得的環四糖五或六水合物的晶體粉末以及2重量份的蔗糖，採用板式加熱器加熱滅菌溶液，然後濃縮，給出70％的濃度。將濃縮物無菌罐裝，獲得所需產物。因為產物具有適當的甜度以及令人滿意的風味與味道，它可以任意用於給水果，咖啡，可可及茶調味。實施例B-5乳酸飲料將175份脫脂奶粉，130重量份的實施例A-4的方法獲得的包含環四糖的糖漿，50重量份的″NYUKAOLIGO@″(一種由日本Okayama的Hayashibara Shoji公司出售的高乳蔗糖含量粉末)溶解在1,150重量份的水中。將所產生的溶液在65℃下滅菌30分鐘，然後冷卻到40℃，以通常的方式接種30重量份的作為引酵物的乳酸菌，在37℃下培養8小時，獲得具有乳酸菌的飲料。產物適於用作乳酸飲料，其具有令人滿意的風味與味道，包含寡糖和環四糖，穩定地保持乳酸菌，並且具有促進細菌生長以及控制腸內狀況的作用。實施例B-6果汁粉33重量份的經噴霧乾燥製備的橙汁粉在攪拌下與50重量份的實施例A-7的方法獲得的環四糖五或六水合物，10重量份的無水晶體麥芽糖醇，0.65重量份的無水檸檬酸，0.1重量份的蘋果酸，0.2重量份的2-O-α-D-葡糖基-L-抗壞血酸，0.1重量份的檸檬酸鈉，0.5重量份的支鏈澱粉以及適量的粉狀香料充分混合。將混合物研磨成細粉，然後置於硫化床造粒機中(調整到吹空氣至40℃)，用適量的濃縮溶液(富含作為結合劑的實施例A-5的方法獲得的環四糖)噴射造粒30分鐘，稱重，包裝，獲得所需產物。產物是具有約30％水果汁含量的果汁粉。產物也具有作為一種高質低熱汁的高產量，因為它不具有任何不愉快的味道與氣味。實施例B-7乳蛋糕奶油將100重量份的玉米澱粉，100重量份的實施例A-2的方法獲得的環四糖，60重量份的海藻糖，40重量份的蔗糖以及1重量份的鹽充分混合，然後進一步與280重量份的鮮蛋混合，其後攪拌。向所產生的混合物中逐漸混於1,000重量份的煮沸的牛奶。在火上進一步攪拌混合物，在玉米澱粉完全成膠狀後，全部內含物為半透明時停止加熱，其後冷卻所形成的物質，將其與香草香料混合，然後稱量，注入以及包裝，獲得所需產物。產物是一種高質乳蛋糕奶油，具有優雅的光澤，令人滿意的風味和味道，並且很好地抑制澱粉老化。實施例B-8巧克力將40重量份的可可糊狀物，10重量份的可可黃油以及50重量份的實驗24的方法獲得晶體環四糖一水合物混合，將混合物置於精煉機，降低顆粒大小，然後置於巧克力攪拌揉捏機中，在50℃下揉兩天兩夜。在進行加工期間，加入0.5重量份的卵磷脂，充分分散到所揉的混合中。此後，用熱控制器將所產生的混合物調整到31℃，然後恰好在黃油凝固之前傾入模具中，脫空氣，包裝以及經穿過保持在10℃的冷道固化。從模具除去固化的內含物，包裝，獲得所需產物。產物實質上無任何吸水性，有令人滿意的顏色，光澤以及內部結構；在口中流利地溶解；並且具有高質量的甜度和溫和的風味與味道。產物也可以用作低致熱和低熱值巧克力。實施例B-9uiro-no-moto(uiro(甜米凍)的預混物)向90重量份的米粉中加入20重量份的玉米澱粉，70重量份的無水晶體麥芽醇，50重量份的包含實施例A-1的方法獲得的環四糖的粉末以及4重量份的支鏈澱粉，將所產生的混合物均勻混合成uiro-no-moto預混物，將該預混物與適量的matcha(綠茶粉末)和水充分揉和，然後置於容器中蒸60分鐘，獲得具有matcha的uiro。產物具有令人滿意的光澤，口感，味道和香味，它可以適於用作長貨架壽命的低熱量uiro，其中澱粉的老化受到充分抑制。實施例B-10An(大豆醬)10重量份的大豆在加入水後以通常方式煮沸，除去收斂性物質，灰汁以及水溶性雜質，獲得約21重量份的顆粒形式的粗大豆醬。向粗大豆醬加入14重量份的蔗糖，5重量份的包含實施例A-3的方法獲得的環四糖的糖漿，4重量份的水，將所產生的混合物煮沸，與少量的色拉油混合，然後揉制，獲得約35重量份的所需產物。因為產物具有令人滿意的穩定性，口感，味道和香味，並且實質上沒有烘烤的脫水收縮和額外顏色，其可以任意地用作糖食原料，如bean jam bun，″manju″(一種具有大豆醬的日本糖食)，充有大豆醬的薄餅，以及冰淇淋/糖果原料。實施例B-11麵包向100重量份的小麥麵粉，2重量份的酵母，5重量份的蔗糖，1重量份的包含實施例A-1的方法獲得的環四糖的粉末，0.1重量份的酵母食品，以通常的方式用水揉捏，在26℃下發酵兩小時，熟化30分鐘，然後烘烤。產物是一種具有令人滿意的顏色和結構以及充分彈力和適當甜度的高質麵包。實施例B-12火腿向1000重量份的火腿肉片加入15重量份的鹽和3重量份的硝酸鉀，研磨均勻，將所形成的肉片堆疊，並使其在冷庫中靜置一天一夜。此後，首先將所產生的片在冷庫中浸泡在鹽溶液中，該溶液含有500重量份的水，100重量份的鹽，3重量份的硝酸鉀，40重量份的包含實施例A-5的方法獲得的環四糖五或六水合物的粉末以及適量的肉片，然後以通常方式以冷水洗滌，用線系好，煙燻，煮，冷卻以及包裝，獲得所需產物。
產物是一種具有令人滿意的色彩，味道和香味的高質火腿。實施例B-13粉末狀肽將1重量份的40％″HINUTE S″(一種由日本東京富士油業公司出售的可食用醬油大豆肽溶液)與2重量份的包含實施例A-6的方法獲得環四糖五或六水合物的粉末混合，將所產生的混合物置於塑料容器中，在50℃下真空乾燥，並研磨成粉，獲得粉末狀肽。具有令人滿意的風味與味道的產物可以任意用作糖食原料，如premixes，冰糕以及冰淇淋的原料，用作實質上不可消化的可食用纖維和控制腸內狀況的物質(其用於口服及插管攝食的液體飲食)。實施例B-14粉末狀蛋黃經平板加熱器在60-64℃下滅菌從新鮮蛋製備的蛋黃，將1重量份的所形成的液體與4重量份的包含依據實驗25的方法獲得的無水晶體環四糖末粉的粉末。將所產生的混合物轉移到容器中，使其靜置一夜，形成塊，同時使環四糖轉化成環四糖五或六水合物，將這樣獲得的塊用刀具研磨成粉末狀蛋黃粉末。
產物可以任意用作糖食原料，如premixes，冰糕以及冰淇淋的原料，用作實質上不可消化的可食用纖維和控制腸內條件的物質(其用於口服及插管攝食的液體飲食)。產物也可以任意用作美膚劑，生髮劑，等等。實施例B-15浴鹽將1重量份的″yuzu″(一種中國檸檬)皮汁與10重量份的包含依據實驗25的方法獲得的無水晶體環四糖的粉末。其後結晶以形成晶體環四糖五或六水合物，熟化所形成的晶體，研磨熟化的晶體，獲得含有yuzu皮提取物的晶體環四糖五或六水合物的粉末。
通過將5重量份的上述粉末與90重量份的烤鹽，2重量份的含水晶體海藻糖，1重量份的矽酸酐，0.5重量份的″αG HESPERIDIN″(由日本Okayama Hayashibara Shoji公司出售的α-葡基橙皮甙)混合獲得浴鹽。
產物是一種高質量的浴鹽，其富含yuzu香味，經以熱水稀釋100-10,000倍使用，其滋潤和光滑皮膚，在洗浴後不使人感覺到冷。實施例B-16化妝用油膏將2重量份的聚氧乙烯二醇一硬脂酸酯，5重量份的自乳化型甘油一硬脂酸酯，2重量份的實施例A-8的方法獲得晶體環四糖五或六水合物粉末，1重量份的″αG RUTIN″(由日本Okayama的Hayashibara Shoji公司出售的α-葡基芸香甙)，1重量份的液態礦脂，10重量份的甘油三-2-乙基己酸酯以及適量的防腐劑以通常方式加熱溶解。將所產生的溶液與2重量份的L-乳酸，5重量份的1，3-丁二醇以及66重量份的精製過的水混合，經勻漿器乳化所產生的混合物，與適量的香料攪拌混合，獲得化妝用油膏。產物表現出抗氧化劑活性並具有比較高的穩定性，這些使得其作為高質遮光劑、皮膚護理劑和皮膚增白劑非常有用。實施例B-17牙膏通過混合45重量份的磷酸氫鈣，1.5重量份的月桂基硫酸鈉，25重量份的甘油0.5重量份的聚氧化乙烯脫水山梨糖醇月桂酸酯，15重量份的包含實施例A-2的方法獲得的環四糖的糖漿，0.02重量份的糖精，0.05重量份的防腐劑以及13重量份的水獲得牙膏。產物在使用之後具有改進的味道和滿意的感覺，而不降低表面活性劑的洗滌效果。實施例B-18流食的固體製劑將100重量份的實施例A-6方法獲得的晶體環四糖五或六水合物，200重量份的含水晶體海藻糖，200重量份的高麥芽四糖含量粉末，270重量份的蛋黃粉末，209重量份的脫脂奶粉，4.4重量份的氯化鈉，1.8重量份的氯化鉀，4重量份的硫酸鎂，0.01重量份的硫胺素，0.1重量份的L-抗壞血酸鈉，0.6重量份的維生素E乙酸鹽以及0.04重量份的煙醯胺混合。將所產生的組合物的25克小份注射進防水薄小袋中，加熱密封，獲得所需產物。
產物是一種富含實質上不可消化的可食用纖維(由於環四糖)並具有令人滿意的腸內控制作用的流食。將一袋產物溶解在約150-300ml水中成為流食，經口頭使用或者插管到鼻腔，胃部，腸部等任意使用，以補充機體能量。實施例B-19片劑將50重量份的阿斯匹林與14重量份的實施例A-7的方法獲得的晶體環四糖五或六水合物粉末，4重量份的玉米澱粉混合。經壓片機按通常的方式將所形成的混合物壓片，各獲得各680mg，5.25mm厚度的片。
採用環四糖的填料賦予能力加工成的該片劑實質上不具有吸水性，有足夠的機械強度以及十分令人滿意的可降解性。實施例B-20糖衣片作為核心(150mg重)的粗片用第一溶液進行糖塗布，所說的第一溶液含有40重量份的實施例A-7的方法獲得的晶體環四糖五或六水合物粉末，2重量份的支鏈澱粉(具有200,000的平均分子量)，30重量份的水，25重量份的滑石，3重量份的氧化鈦，直到重量達到約230mg。然後所產生的物質用第二溶液進行糖塗布，所說的第二溶液含有65重量份的結晶環四糖五或六水合物的相同粉末，1重量份的支鏈澱粉以及34重量份的水；用液態蠟上光，獲得了具有令人滿意的光澤和外觀的糖衣片。產物具有比較高的衝擊耐受性，並在長時間保持高的質量。實施例B-21治療創傷的軟膏向100重量份的實施例A-7的方法獲得的晶體環四糖五或六水合物的粉末和300重量份麥芽糖中加入50重量份溶於3重量份碘中的甲醇，進一步加入200重量份的10％(w/v)含水支鏈澱粉溶液，獲得具有適度延伸性和膠粘性的所需產物。產物是高質軟膏，其中碘和甲醇的分散被環四糖很好地抑制，並且在貯存期間具有相對低的變化。
因為產物發揮碘的滅菌作用，並且基於麥芽糖，起到對活細胞的能量補充作用，故它縮短醫治時間，並很好地治療受患病部位和表面。
工業實用性如以上描述的，本發明涉及一種新的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶以及其製備方法和用途，更具體地說，涉及一種新的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶，其製備方法，產生該酶的微生物，使用酶的α-葡糖基轉移方法，用於形成α-異麥芽糖基葡糖基糖的方法，產生具有環{→6}-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→)結構的環四糖的方法，包含由此獲得的糖的組合物。根據本發明，一種工業上有用的具有環{→6}-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→)結構的環四糖以及包含它的組合物可以以工業規模、以相對低的成本產生。因為這些環四糖和包含它的組合物實質上沒有或有低的還原性，實質上不引起氨基羰基反應，實質上也不表現出吸水性，具有容易處理性，具有適當的甜度，足夠的粘性，水份保持能力，包含能力以及實質上不可消化性，它可以有利地用於各種組合物，如食品，化妝品以及藥物，作為甜味劑，低熱食品原料，味道改善劑，風味改善劑，質量改善劑，脫水收縮阻止劑，穩定劑，填充劑，包含劑以及粉碎基質。具有這些顯著功能和作用的本發明對本領域的巨大貢獻是明顯重要的。
序列表序列表110Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo120α-異麥芽糖葡糖基糖形成酶，其製備方法和用途130WO854150233,364/001512000-8-1150234,937/001512000-8-21601921012119212PRT213圓孢芽孢桿菌(Bacillus globisporus)4001Tyr Val Ser Ser Leu Gly Asn Leu Ile1 5210221110212PRT213圓孢芽孢桿菌4002Ile Asp Gly Val Tyr His Ala Pro Asn Gly1 5 10210321110212PRT213圓孢芽孢桿菌4003Ile Asp Gly Val Tyr His Ala Pro Tyr Gly1 5 1021042118212PRT213圓孢芽孢桿菌4004Ile Asp Gly Val Tyr His Ala Pro1 521052118212PRT213圓孢芽孢桿菌4005Asp Ala Ser Ala Asn Val Thr Thr1 521062118212PRT213圓孢芽孢桿菌4006Trp Ser Leu Gly Phe Met Ash Phe1 521072118212PRT213圓孢芽孢桿菌4007Asn Tyr Thr Asp Ala Trp Met Phe1 521082118212PRT213圓孢芽孢桿菌4008Gly Asn Glu Met Arg Asn Gln Tyr1 521092118212PRT213圓孢芽孢桿菌4009Ile Thr Thr Trp Pro Ile Glu Ser1 5210102118212PRT213圓孢芽孢桿菌40010Trp Ala Phe Gly Leu Trp Met Ser1 5210112119212PRT213圓孢芽孢桿菌40011His Val Ser Ala Leu Gly Ash Leu Leu1 5210122118212PRT213圓孢芽孢桿菌40012Asp Phe Ser Asn Asn Pro Thr Val1 5210132118212PRT213圓孢芽孢桿菌40013Tyr Thr Val Asn Ala Pro Ala Ala1 5210142118212PRT213圓孢芽孢桿菌40014Tyr Glu Ala Glu Ser Ala Glu Leu1 5210152116212PRT213圓孢芽孢桿菌40015Asn Trp Trp Met Ser Lys1 5210162118212PRT213圓孢芽孢桿菌40016Thr Asp Gly Gly Glu Met Val Trp1 5210172118212PRT213圓孢芽孢桿菌40017Asn Ile Tyr Leu Pro Gln Gly Asp1 52101821113212PRT213球形節桿菌(Arthrobacter globiformis)40018Ala Pro Leu Gly Val Gln Arg Ala Gln Phe Gln Ser Gly1 5 102101921110212PRT213分枝節桿菌(Arthrobacter ramosus)40019Asp Thr Leu Ser Gly Val Phe His Gly Pro1 5 10
權利要求
1.α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶，其通過催化從具有至少為2的葡糖聚合度、並且在非還原端具有作為連接鍵的α-1，4糖苷鍵的糖轉移α-葡糖基，形成具有至少為3的葡糖聚合度、並且具有作為非還原端連接鍵的α-1，6糖苷鍵和作為非還原端連接鍵以外的連接鍵的α-1，4糖苷鍵兩者的糖，而實質上不增加還原力。
2.權利要求1的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶，其實質上不能形成葡聚糖，並且被EDTA抑制。
3.權利要求1或2的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶，其中所說的具有至少為2的葡糖聚合度、並且在非還原端具有作為連接鍵的α-1，4糖苷鍵的糖是選自下組的一個或多個成員麥芽寡糖，麥芽糖糊精，澱粉糊精，直鏈澱粉，支鏈澱粉，可溶性澱粉，液化澱粉以及糖原。
4.具有下列物理化學性質的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶(1)活性通過催化從具有至少為2的葡糖聚合度、並且在非還原端具有作為連接鍵的α-1，4糖苷鍵的糖轉移α-葡糖基，形成具有至少為3的葡糖聚合度、並且具有作為非還原端連接鍵的α-1，6糖苷鍵和作為非還原端連接鍵以外的連接鍵的α-1，4糖苷鍵兩者的糖，而實質上不增加還原力；(2)分子量當在SDS-PAGE上測定時，具有約74,000到約160,000道爾頓的分子量；(3)等電點(pI)當用兩性電解質在等電聚焦電泳上測定時，具有約3.8到約7.8的等電點。(4)最適溫度當在pH 6.0下溫育60分鐘時，具有約40℃到約50℃的最適溫度；當存在1mM Ca2+、在pH 6.0下溫育60分鐘時，具有約45℃到約55℃的最適溫度；當在pH 8.4下溫育60分鐘時，具有60℃的最適溫度；當存在1mM Ca2+、在pH 8.4下溫育60分鐘時，具有65℃的最適溫度；(5)最適pH當在35℃溫育60分鐘時，具有約6.0到約8.4的最適pH；(6)熱穩定性當在pH 6.0下溫育60分鐘時，具有約45℃或更低溫度的熱穩定區；當存在1mM Ca2+、在pH 6.0下溫育60分鐘時，具有約50℃或更低溫度的熱穩定區；當在pH 8.0下溫育60分鐘時，具有約55℃或更低溫度的熱穩定區；當存在1mM Ca2+、在pH 8.0下溫育60分鐘時，具有約60℃或更低溫度的熱穩定區；和(7)pH穩定性當在4℃溫育24小時時，具有約4.5到約10.0的pH穩定區。
5.權利要求1至4之任一項的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶，其包含選自下組的一個或多個胺基酸序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO5到7，SEQ ID NO11到14以及SEQ ID NO18。
6.權利要求1至5之任一項的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶，其被Ca2+和Mn2+穩定和/或活化。
7.權利要求1至6之任一項的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶，其是純化的或粗的酶。
8.產生權利要求1至7之任一項的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的方法，其包括下列步驟在營養培養基中培養能夠產生權利要求1至6之任一項的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶的微生物；並且從所形成的培養物中收集權利要求1至7之任一項的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶。
9.權利要求8的方法，其中所說的微生物是芽孢桿菌屬或節桿菌屬的微生物。
10.權利要求9的方法，其中所說的芽孢桿菌屬的微生物是選自下組的微生物圓孢芽孢桿菌C9，FERM BP-7143；圓孢芽孢桿菌C11，FERMBP-7144；圓孢芽孢桿菌N75，FERM BP-7591；和它們的突變體。
11.權利要求9的方法，其中所說的節桿菌屬的微生物是選自下組的微生物球形節桿菌A19，FERM BP-7590；和其突變體。
12.一種α-葡糖基轉移反應的方法，其包括將權利要求1至7之任一項的α-異麥芽糖基葡糖基糖轉移酶與包含糖的溶液接觸，所說的糖具有至少為2的葡糖聚合度、並且在非還原端具有作為連接鍵的α-1，4糖苷鍵。
13.權利要求12的方法，其中糖轉移產物是在選自下組的一種或多種受體存在下經α-葡糖基轉移反應形成的D-葡萄糖，D-木糖，L-木糖，D-半乳糖，D-果糖，D-甘露糖，D-阿拉伯糖，D-巖藻糖，D-阿洛酮糖，L-山梨糖，甲基-α-吡喃葡萄糖苷，甲基-β-吡喃葡萄糖苷，N-乙醯氨基葡萄糖，海藻糖，異麥芽糖，異麥芽三糖，纖維二糖，龍膽二糖，甘油，麥芽糖醇，乳糖，蔗糖以及L-抗壞血酸。
14.一種用於形成α-異麥芽糖基葡糖基糖的方法，其包括將權利要求1至7之任一項的α-異麥芽糖基葡糖基糖轉移酶與包含如下糖的溶液接觸，進行α-葡糖基轉移反應，所說的糖具有至少為2的葡糖聚合度、並且在非還原端具有作為連接鍵的α-1，4糖苷鍵。
15.權利要求14的方法，其中所說的糖是選自下組的糖麥芽寡糖，麥芽糖糊精，澱粉糊精，直鏈澱粉，支鏈澱粉，可溶性澱粉，液化澱粉以及糖原。
16.具有環{→6}-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}結構的環四糖或者包含它的糖組合物，其可通過下列方法獲得將權利要求1至7之任一項的α-異麥芽糖基葡糖基糖轉移酶和α-異麥芽糖基轉移酶兩者與包含具有至少為2的葡糖聚合度、並且在非還原端具有作為連接鍵的α-1，4糖苷鍵的糖的溶液接觸，其中所說的α-異麥芽糖基轉移酶特異性地水解在α-異麥芽糖基葡糖基糖轉移酶作用下形成的α-異麥芽糖基葡糖基糖的α-異麥芽糖基部分和其餘葡糖基糖部分之間的連接鍵，並把釋放的α-異麥芽糖基部分轉移給受體。
17.權利要求16的環四糖或者糖組合物，其中所說的具有至少為2的葡糖聚合度的糖是選自下組的糖麥芽寡糖，麥芽糖糊精，澱粉糊精，直鏈澱粉，支鏈澱粉，可溶性澱粉，液化澱粉以及糖原。
18.一種具有環{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}結構的環四糖或者包含它的糖組合物，其可通過下列方法獲得將權利要求1至7之任一項的α-異麥芽糖基葡糖基糖轉移酶和α-異麥芽糖基轉移酶兩者與包含具有至少為2的葡糖聚合度、並且在非還原端具有作為連接鍵的α-1，4糖苷鍵的糖的溶液接觸，以獲得包含所說的環四糖以及其它糖的溶液；並將所說的溶液進行使用強酸陽離子交換樹脂的柱色譜，其中所說的α-異麥芽糖基轉移酶特異性地水解在α-異麥芽糖基葡糖基糖轉移酶作用下形成的α-異麥芽糖基葡糖基糖的α-異麥芽糖基部分和其餘葡糖基糖部分之間的連接鍵，並把釋放的α-異麥芽糖基部分轉移給受體。
19.權利要求16至18之任一項的環四糖或糖組合物，其含有基於幹固體的至少30％(w/w)具有環{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}結構的環四糖。
20.權利要求16至19之任一項的環四糖或糖組合物，其是糖漿，糖膏，無定形粉末，無定形固體，晶體粉末，或晶體固體形式的。
21.權利要求20的環四糖或糖組合物，其中所說的晶體是選自下組的一個或多個成員晶體環四糖五或六水合物；晶體環四糖一水合物；無水晶體環四糖，它們都具有環{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}結構。
22.權利要求20或21的環四糖或糖組合物，其中所說的晶體是通過在水溶液中結晶製備的，不使用任何有機溶劑。
23.權利要求16至22之任一項的環四糖或糖組合物，其中所說的包含環四糖的糖是這樣的糖，其含有環{→6}-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}和一種或多種選自下組的糖葡萄糖，麥芽糖以及具有至少為3的葡糖聚合度、並且具有作為非還原端連接鍵的α-1，6糖苷鍵和作為非還原端連接鍵以外的連接鍵的α-1，4糖苷鍵兩者的糖。
24.具有環{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}結構的環四糖或者包含它的糖組合物，其可通過下列方法獲得在含有具有至少為2的葡糖聚合度、並且在非還原端具有作為連接鍵的α-1，4糖苷鍵的糖的營養培養基中培養微生物，所說的微生物能夠產生權利要求1至7之任一項的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶和α-異麥芽糖基轉移酶兩者，所說的α-異麥芽糖基轉移酶特異性地水解α-異麥芽糖基部分和其餘α-葡糖基糖部分之間的連接鍵，並把釋放的α-異麥芽糖基部分轉移給受體。
25.環四糖或糖組合物，其中所說的具有至少為2的葡糖聚合度的糖是選自下組的糖麥芽寡糖，麥芽糖糊精，澱粉糊精，直鏈澱粉，支鏈澱粉，可溶性澱粉，液化澱粉以及糖原。
26.權利要求24或25的環四糖或糖組合物，其中所說的微生物是芽孢桿菌屬或節桿菌屬的微生物。
27.權利要求26的環四糖或糖組合物，其中所說的芽孢桿菌屬的微生物是選自下組的微生物圓孢芽孢桿菌C9，FERM BP-7143；圓孢芽孢桿菌C11，FERM BP-7144；圓孢芽孢桿菌N75，FERM BP-7591；和它們的突變體。
28.權利要求26的環四糖或糖組合物，其中所說的節桿菌屬的微生物是選自下組的微生物球形節桿菌A19，FERM BP-7590；和其突變體。
29.權利要求24至28之任一項的環四糖或糖組合物，其可由以下方法獲得把所形成的培養物或可由該培養物獲得的糖與選自下組的一種或多種酶接觸α-澱粉酶，β-澱粉酶，葡糖澱粉酶以及α-葡萄糖苷酶；並且利用選自下組的一種或多種純化方法處理所產生的混合物脫色，脫鹽，柱色譜分級分離，膜分離，微生物發酵以及鹼處理。
30.權利要求16，18或24的環四糖或糖組合物，其中所說的α-異麥芽糖基轉移酶具有下列物理化學性質(1)作用從具有至少為3的葡糖聚合度、並且具有作為非還原端連接鍵的α-1，6糖苷鍵和作為非還原端連接鍵以外的連接鍵的α-1，4糖苷鍵兩者的糖形成具有環{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}結構的環四糖；(2)分子量當在十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)上測定時，具有約82,000到約136,000道爾頓的分子量；(3)等電點(pI)當用兩性電解質在等電聚焦電泳上測定時，具有約3.7到約8.3的等電點。(4)最適溫度當在pH 6.0下溫育30分鐘時，具有約45℃到約50℃的最適溫度；(5)最適pH當在35℃溫育30分鐘時，具有約5.5到約6.5的最適pH；(6)熱穩定性當在pH 6.0下溫育60分鐘時，具有約45℃或更低溫度的熱穩定範圍；(7)pH穩定性當在4℃溫育24小時時，具有約3.6到約10.0的pH穩定範圍。
31.一種產生具有環{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}結構的環四糖或者包含它的糖組合物的方法，其包括以下步驟將膠化和/或液化澱粉溶液與權利要求1至7之任一項的α-異麥芽糖基葡糖基糖轉移酶和α-異麥芽糖基轉移酶兩者接觸，其中所說的α-異麥芽糖基轉移酶特異性地水解在α-異麥芽糖基葡糖基糖轉移酶作用下形成的α-異麥芽糖基葡糖基糖的α-異麥芽糖基部分和其餘葡糖基糖部分之間的連接鍵，並把釋放的α-異麥芽糖基部分轉移給受體。
32.權利要求31的方法，其中所說的膠化和/或液化澱粉溶液具有不高於20的DE(葡萄糖當量)。
33.權利要求31或32的方法，其中所說的膠化和/或液化澱粉溶液與權利要求1至7之任一項的α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶，α-異麥芽糖基轉移酶，和環麥芽糖糊精葡聚糖轉移酶，以及可有可無的一種或多種選自下組的酶接觸α-澱粉酶，β-澱粉酶，葡糖澱粉酶以及α-葡萄糖苷酶。
34.權利要求31，32或33的方法，其進一步包括選自下組一種或多種純化方法脫色，脫鹽，柱色譜分級分離，膜分離，微生物發酵處理以及鹼處理分解。
35.權利要求31至34之任一項的方法，其含有基於幹固體的至少30％(w/w)具有環{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}結構的環四糖。
36.權利要求31至35之任一項的方法，其中所說的環四糖或所說的包含它的糖組合物是糖漿，糖膏，無定形粉末，無定形固體，晶體粉末，或晶體固體形式的。
37.權利要求36的方法，其中所說的晶體是通過在水溶液中結晶製備的，不使用任何有機溶劑。
38.權利要求31或33的方法，其中所說的α-異麥芽糖基轉移酶具有下列物理化學性質(1)作用從具有至少為3的葡糖聚合度、並且具有作為非還原端連接鍵的α-1，6糖苷鍵和作為非還原端連接鍵以外的連接鍵的α-1，4糖苷鍵兩者的糖形成具有環{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}結構的環四糖；(2)分子量當在十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)上測定時，具有約82,000到約136,000道爾頓的分子量；(3)等電點(pI)當用兩性電解質在等電聚焦電泳上測定時，具有約3.7到約8.3的等電點。(4)最適溫度當在pH 6.0下溫育30分鐘時，具有約45℃到約50℃的最適溫度；(5)最適pH當在35℃溫育30分鐘時，具有約5.5到約6.5的最適pH；(6)熱穩定性當在pH 6.0下溫育60分鐘時，具有約45℃或更低溫度的熱穩定範圍；(7)pH穩定性當在4℃溫育24小時時，具有約3.6到約10.0的pH穩定範圍。
39.包含權利要求16至30之任一項的環四糖或者包含它的糖組合物的組合物，所說的環四糖具有環{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}結構。
40.權利要求39的組合物，其中所說的環四糖或所說的包含它的糖組合物用作具有下列一種或多種性質的糖甜味性，實質性的非發酵性，低生齲性，低熱值，滲透壓可控性，賦形能力，賦予光澤的能力，保溫能力，賦予粘性的能力，防止脫水收縮的能力，防止凝固的能力，包含能力，保持風味的能力，穩定性，防止其它糖結晶的能力，防止澱粉老化的能力，防止蛋白質變性的能力，防止脂質變質的能力，酸耐受性，耐熱性以及很少引起氨基羰基反應的能力；或者直接用於以下一個或多個用途甜味劑，低生齲食品材料，低熱量食品材料，味道改良劑，風味改良劑，品質改良劑，防止脫水收縮劑，穩定劑，防止脫色劑，賦形劑，包含劑以及粉碎材料。
41.權利要求39或40的組合物，其是食品，化妝品或藥物形式的。
42.權利要求39或40的組合物，其包含基於幹固體的至少0.1％(w/w)的環四糖。
全文摘要
本發明提供α－異麥芽糖基葡糖基糖形成酶，由該酶獲得的環四糖，含有該環四糖的糖，及其用途，其中所述酶能從葡糖聚合度至少為2、並具有作為非還原端連接鍵的α－糖苷鍵的糖轉移α－葡糖基，而實質上不增加還原力，由此形成葡糖聚合度至少為3、並具有作為非還原端連接鍵的α－1，6糖苷鍵和作為非還原端以外連接鍵的α－1，4糖苷鍵的糖。
文檔編號A61Q11/00GK1392900SQ01802974
公開日2003年1月22日 申請日期2001年7月25日 優先權日2000年8月1日
發明者久保田倫夫, 津崎桂二, 東山隆信, 福田惠溫, 三宅俊雄 申請人:株式會社林原生物化學研究所