一種產油微生物能源微藻的高值化利用分離方法
2023-09-16 11:39:15 2
專利名稱：一種產油微生物能源微藻的高值化利用分離方法
技術領域：
本發明涉及微生物工程領域，尤其涉及一種產油微生物微藻的高值化利用分離方法。
背景技術：
隨著石化資源日 益枯竭、人類環保意識不斷增強，清潔可再生的生物柴油的發展顯得尤為緊迫。能源微藻以種類繁多、分布廣、繁殖快、成本低的特點成為重要來源之一。另夕卜，其脂肪酸組成與植物來源的食用油脂相似，可以代替動、植物油脂作為食用油脂，甚至是作為保健類功能性油脂。微藻除含有大量的脂質之外，還含有豐富的多糖、色素、蛋白質和必需胺基酸等活性成分。具有增強免疫力，抗癌，防輻射損傷，抗衰老，降血糖等功效。葉綠素是較早開發的一種綠色色素，無毒，可食用，是一種很好的天然食用色素，但由於葉綠素穩定性極差，且不溶於水，給應用帶來一定的困難。為方便使用，常將其製成葉綠素銅鈉應用。葉綠素銅鈉鹽不但溶於水而且穩定性比葉綠素強很多，是我國食品工業唯一允許使用的綠色色素，是聯合國糧農組織、世界衛生組織批准使用的天然綠色素。從產油微生物能源微藻進行分離可以得到多糖、色素、油脂以及蛋白產品四種成分。現階段對四種成分的提取，常規方法是酸法、鹼法、酶法、熱水法、超聲波、微波提取法對某一種成分進行提取，但仍沒有一種方法同時對四種成分進行有效提取。且超聲、微波法處理量小，工業上較難擴大再生產；若直接採用酸法、鹼法用量大、且濃度高，對環境汙染嚴重，對色素、多糖結構破壞嚴重、損失較大，蛋白含量較高，增加了多糖純化的難度，且鹼處理使水相清液中呈墨綠色，得到的粗多糖顏色也為綠色，油脂提取過程中，色素雜質也較多，後期分離成本加大；酶法破碎條件溫和、能耗低、處理量大，多糖得率高，油脂浸出率高，但是酶的造價較高，而在使用時又需要大量的酶才可達到較好的破碎效果，且酶的大量使用對色素降解作用較明顯，所以可以先對酶進行預處理，減少酶的用量和作用時間；熱水處理，可增大細胞通透性，有利於胞內物質的浸出，可控時間內熱水處理對色素影響較小，但脫單獨熱水處理，多糖和油脂的提取效率低，可作為一種預處理手段與酶法結合。常規對色素提取採用有機溶劑浸提，此時目標產物必須為幹菌體，溼菌體有機溶劑提取效果甚微。
發明內容
本發明設計了一種產油微生物能源微藻的高值化利用分離方法，其解決的技術問題是現有產油微生物能源微藻分離方法無法對其含有的多糖、油脂、色素以及蛋白得到充分利用，並且分離效果不佳，成本高。為了解決上述存在的技術問題，本發明採用了以下方案
一種產油微生物能源微藻的高值化利用分離方法，包括以下步驟
步驟I :將收集的微藻溼菌體依次經過熱水和離心處理，得到上清液A和沉澱A ;其中，熱水與溼菌體的質量比為20— 30 1 ；步驟2 :沉澱A依次經過加酶和離心處理，得到上清液B和沉澱B ;其中，沉澱A和酶的質量比為40-100 1 ；
步驟3 :將上清液A和上清液B混合後進行濃縮，並加4°C冷乙醇混合12小時以上，將混合液進行過濾得到粗多糖沉澱；其中，上清液A和上清液B的總體積濃縮到原體積的1/5—1/4，加冷乙醇的體積是濃縮後上清液A和上清液B總體積的3-5倍；
步驟4 :步驟3中所得粗多糖沉澱加水溶解，脫蛋白處理，分離成蛋白沉澱和脫蛋白的多糖溶液，蛋白沉澱通過冷凍乾燥或烘乾得到粗蛋白產品。進一步，步驟4中所得脫蛋白後的多糖溶液進行脫色得到精製多糖。進一步，將步驟2中所得沉澱B的菌懸液調節pH值為10-12後，70_80°C保溫l_2h，然後加入O. 8%的氯化鈉溶液以及正己烷與乙醇的混合液，使最終正己烷乙醇水的體積比為2 :4 :1. 5，震蕩lOmin，靜置分成三層正己烷相A、中間菌體相以及醇水相A，最上層正己烷相A得到黃色素。添加乙醇是為了使黃色素更好的進入正己烷相中。
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進一步，中間菌體相經過乾燥處理後當作動物膳食的高蛋白成分飼料。進一步，醇水相A加酸調節溶液pH至酸性後，加入體積比為2 1的正己烷與乙醇混合溶液以及O. 8%的氯化鈉溶液，醇水相A、正己烷乙醇混合液以及氯化鈉溶液體積比為4 6 :1，震蕩lOmin，靜置再次分層為正己烷相B和醇水相B，正己烷相B製得油脂，醇水相B製得葉綠素銅鈉鹽。進一步，所述酶選自中性蛋白酶、鹼性蛋白酶以及纖維素酶中的一種或多種組合；所述纖維素酶酶活為1200-1500U/g，所述中性蛋白酶酶活為59000-60000U/g，所述鹼性蛋白酶酶活為 2X 105-2. 02X 105U/g。進一步，步驟I中的熱水處理溫度和時間分別為90_100°C和O. 5_2h。進一步，所述產油微生物能源微藻為小球藻、螺旋藻或柵藻。藻類微生物的細胞壁成分主要是纖維素極其結合蛋白。以適當的比例組成具有水解多糖、蛋白等物質能力的複合酶，使細胞壁通透性大幅增加，產品能夠順利溶出。所述纖維素酶與蛋白酶的質量比優選為1:0. 2-5 ;所述酶與產油微生物菌體的質量比為1:40-100。本發明使用的微藻溼菌體由藻類微生物菌體發酵液通過離心處理獲得，藻類微生物菌體發酵液的製備方法為取種子液對數期進行接種，接種量為20%，初始pH值為7. 5，溫度27°C，光照40001x，通無菌空氣培養8天則達到穩定期。本發明在提取油脂時優選採用六號溶劑萃取，六號溶劑是各種低級烷烴的混合物，具有工業己烷類似的性質且不與水互溶，形成的雙水相可以分離脂溶性的油脂和水溶性的葉綠素酸。浸提後離心得到油相層，利用旋轉蒸發儀脫溶得到油脂。該產油微生物能源微藻的高值化利用分離方法與現有方法相比，具有以下有益效果
(I)本發明產油微生物能源微藻的利用分離方法，在確保能夠不影響油脂提取，以及得到較高的產物得率的情況下，對提取順序進行了優化，可以依次得到蛋白、多糖、色素以及油脂產品四種成分。(2)本發明設計用熱水處理作為預處理手段，增大細胞通透性，適當破壞細胞壁結構，減少酶法酶法作用時間和酶的使用量，通過熱水抽提和酶解作用，得到產品多糖和少量的粗蛋白。
(3)本發明通過油脂和葉綠素在鹼性條件下可以變成水溶性的物質，得到胡蘿蔔
素等黃色素廣品。(4)本發明油脂在酸性條件下仍能變成脂溶性的游離脂肪酸，葉綠素仍是水溶性的葉綠素酸，從而分離成油脂和葉綠素，得到的油脂產品色素雜質極少，油脂品質較好。 ( 5 )本發明中葉綠素可以直接轉化成葉綠素銅鈉鹽，且葉綠素轉化充分。
具體實施例方式結合下列實施例，對本發明做進一步說明
實施例I :選用小球藻
將小球藻發酵液以4000rpm/min離心IOmin,去除上清液獲得小球藻溼菌體,稱取小球 藻溼菌體I. Og於IOOml三角燒瓶中，加入25ml去離子水，90°C加熱I. 5h，冷卻，離心得上清液A和沉澱A。稱取O. 065g纖維素酶，O. 035g中性蛋白酶，纖維素酶酶活為1200U/g，中性蛋白酶酶活為60000U/g，加入pH=5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝溶液，pH=5是實驗中選定的最優酶作用的PH反應體系。定容至IOOml，取25ml酶溶液加入到小球藻溼菌體沉澱A中，水解溫度為42°C，攪拌4h，90°C滅酶lOmin。將水解後的懸濁液進行4000r/min下離心lOmin，得到上清液B和沉澱B，合併兩次上清液A和上清液B，濃縮該上清混合液至原體積的1/5，加入3倍體積的冷乙醇4°C震蕩混合均勻，靜置12h，過濾得粗多糖沉澱。取IOml水溶解粗多糖沉澱，用三氯乙酸調節pH到3，混勻，靜置2h，加入15倍三氯乙酸體積的正丁醇，攪拌，靜置lh，離心，水溶液回收多糖，重複2次。多糖提取率82. 3%。用水溶解多糖，以2BV/h的流速對2. 5mg/ml的粗多糖溶液進行吸附脫色，測得色素脫除率92. 4%，多糖保留率為88. 97%。pH=3時蛋白質溶解度較低且多糖損失較小，是實驗中最優反應體系。正丁醇的使用也是為了降低蛋白質的水溶性，從而和多糖分離。此處單獨使用TCA方法也可以，增加重複提取的次數。沉澱B的菌懸液用2mol/L的氫氧化鈉調節pH為11，70°C反應60min，冷卻，加入適量O. 8%的氯化鈉溶液和正己烷與乙醇的混合液正己烷與乙醇的體積比為2 :4，使最終正己烷乙醇水的體積比為2 :4 :1. 5，震蕩lOmin，收集正己烷相，再加入初始1/3體積的正己烷重複兩次，正己烷相A加無水硫酸鈉去除微量水，回收溶劑並得到胡蘿蔔素等黃色素。中間層懸浮的菌體經乾燥後粗蛋白含量為38. 7%，十八水解胺基酸含量充分，完全可以作為富含蛋白、胺基酸的成分當作蛋白飼料成為動物膳食飼料的部分替代品。醇水相A中加lmol/L的硫酸調節pH到3，85°C反應90min，冷卻，加入體積比為2 1的正己烷乙醇溶液和O. 8%的氯化鈉溶液，醇水相A、正己烷乙醇混合液以及氯化鈉溶液體積比4 6 :1，震蕩IOmin,靜置再次分層為正己烷相B和醇水相B，重複兩次，正己烷相B加無水硫酸鈉去除微量水，回收溶劑並得到油脂產品，油脂提取率為79. 4%。醇水相B濃縮到原體積的1/3，加入10%的硫酸銅溶液，醇水相B :硫酸銅體積比為2 :3，攪拌均勻，60°C攪拌90min。趁熱過濾，濾液加入2倍純水,析出葉綠素銅,靜置90min過濾。析出的葉綠素銅的濾餅用乙醇溶解，緩慢加入5%氫氧化鈉-乙醇溶液，調節pH為11，攪拌成鹽，過濾，濾液於60°C加熱蒸發得到墨綠色結晶物，60°C烘箱烘乾得到葉綠素銅鈉鹽成品，葉綠素銅鈉鹽得率75. 6%。實施例2 :選用柵藻
將柵藻發酵液以4000rpm/min離心lOmin，去除上清獲得柵藻菌體，稱取柵藻溼菌體I. Og於IOOml三角燒瓶中，加入25ml去離子水，90°C加熱I. 5h，冷卻，離心得上清液A和沉澱A。稱取O. 075g纖維素酶，O. 025g鹼性蛋白酶，纖維素酶酶活為1200U/g，鹼性蛋白酶酶活為2X 105U/g，加入pH=4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝溶液定容至100ml，取25ml酶溶液加入到柵藻溼菌體沉澱A中，水解溫度為40°C，攪拌4h，90°C滅酶lOmin，將水解後的懸濁液進行4000r/min下離心IOmin,得到上清液B和沉澱B。之後步驟同實施例I。最終產物，多糖提取率78. 14%。測得色素脫除率90. 92%，多糖保留率為89. 23%。粗蛋白含量為36. 7%，油脂提取率為78. 88%，葉綠素銅鈉鹽得率77. 26%。實施例3 :選用螺旋藻
將螺旋藻發酵液以4000rpm/min離心lOmin，去除上清獲得螺旋菌體，稱取螺旋溼菌體O. 8g於IOOml三角燒瓶中，加入25ml去離子水，90°C加熱I. 5h，冷卻，離心得上清液A和沉澱A。稱取O. 067g中性蛋白酶，鹼性蛋白酶酶活為60000U/g，加入pH=7的檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝溶液定容至100ml，取20ml酶溶液加入到柵藻溼菌體中，水解溫度為42°C，攪拌6h，90°C滅酶lOmin。將水解後的懸濁液進行4000r/min下離心lOmin，得到上清液B和沉澱B。 之後步驟同實施例I。最終產物，多糖提取率75. 74%。測得色素脫除率91. 22%，多糖保留率為89. 75%。粗蛋白含量為38. 97%，油脂提取率為78. 28%，葉綠素銅鈉鹽得率72. 86%。上面結合實施例對本發明進行了示例性的描述，顯然本發明的實現並不受上述方式的限制，只要採用了本發明的方法構思和技術方案進行的各種改進，或未經改進將本發明的構思和技術方案直接應用於其它場合的，均在本發明的保護範圍內。
權利要求
1.一種產油微生物能源微藻的高值化利用分離方法，包括以下步驟 步驟I :將收集的微藻溼菌體依次經過熱水和離心處理，得到上清液A和沉澱A ;其中，熱水與溼菌體的質量比為20— 30 1 ； 步驟2 :沉澱A依次經過加酶和離心處理，得到上清液B和沉澱B ;其中，沉澱A和酶的質量比為40-100 1 ； 步驟3 將上清液A和上清液B混合後進行濃縮，並加4 V冷乙醇混合12小時以上，將混合液進行過濾得到粗多糖沉澱；其中，上清液A和上清液B的總體積濃縮到原體積的1/5—1/4，加冷乙醇的體積是濃縮後上清液A和上清液B總體積的3-5倍； 步驟4 :步驟3中所得粗多糖沉澱加水溶解，脫蛋白處理，分離成蛋白沉澱和脫蛋白的多糖溶液，蛋白沉澱通過冷凍乾燥或烘乾得到粗蛋白產品。
2.根據權利要求I所述產油微生物能源微藻的高值化利用分離方法，其特徵在於步驟4中所得脫蛋白後的多糖溶液進行脫色得到精製多糖。
3.根據權利要求I所述產油微生物能源微藻的高值化利用分離方法，其特徵在於將步驟2中所得沉澱B的菌懸液調節pH值為10-12後，70-80°C保溫l_2h，然後加入O. 8%的氯化鈉溶液以及正己烷與乙醇的混合液，使最終正己烷乙醇水的體積比為2 4 :1. 5，震蕩lOmin，靜置分成三層正己烷相A、中間菌體相以及醇水相A，最上層正己烷相A得到黃色素。
4.根據權利要求3所述產油微生物能源微藻的高值化利用分離方法，其特徵在於中間菌體相經過乾燥處理後當作動物膳食的高蛋白成分飼料。
5.根據權利要求3所述產油微生物能源微藻的高值化利用分離方法，其特徵在於醇水相A加酸調節溶液pH至酸性後，加入體積比為2 :1的正己烷與乙醇混合溶液以及O. 8%的氯化鈉溶液，醇水相A、正己烷乙醇混合液以及氯化鈉溶液體積比為4 :6 :1，震蕩lOmin，靜置再次分層為正己烷相B和醇水相B，正己烷相B製得油脂，醇水相B製得葉綠素銅鈉鹽。
6.根據權利要求I至5至任何一項所述產油微生物能源微藻的高值化利用分離方法，其特徵在於所述酶選自中性蛋白酶、鹼性蛋白酶以及纖維素酶中的一種或多種組合；所述纖維素酶酶活為1200-1500U/g，所述中性蛋白酶酶活為59000-60000U/g，所述鹼性蛋白酶酶活為 2X 105-2. 02X 105U/g。
7.根據權利要求I至5至任何一項所述產油微生物能源微藻的高值化利用分離方法，其特徵在於步驟I中的熱水處理溫度和時間分別為90-100°C和O. 5-2h。
8.根據權利要求I至5至任何一項所述產油微生物能源微藻的高值化利用分離方法，其特徵在於所述產油微生物能源微藻為小球藻、螺旋藻或柵藻。
全文摘要
本發明涉及一種產油微生物能源微藻的高值化利用分離方法，包括以下步驟步驟1將收集的微藻溼菌體依次經過熱水和離心處理，得到上清液A和沉澱A；步驟2沉澱A依次經過加酶和離心處理，得到上清液B和沉澱B；步驟3將上清液A和上清液B混合後進行濃縮，並加4℃冷乙醇靜置12小時以上，將混合液進行過濾得到粗多糖沉澱；步驟4步驟3中所得粗多糖沉澱加水溶解，脫蛋白處理，分離成蛋白沉澱和脫蛋白的多糖溶液，蛋白沉澱通過冷凍乾燥或烘乾得到粗蛋白產品，脫蛋白後的多糖溶液進行脫色得到精製多糖，沉澱B再經過多次處理後可以得到黃色素、葉綠素鹽、高蛋白成分飼料以及油脂。
文檔編號C09B61/00GK102875658SQ20121038897
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月15日 優先權日2012年10月15日
發明者張栩, 段美蓉, 譚天偉 申請人:北京化工大學