一種蚓激酶製備工藝的製作方法

2023-09-16 02:50:30 2

專利名稱：一種蚓激酶製備工藝的製作方法
技術領域：
本發明公開一種蚓激酶製備工藝，涉及生物化學製藥技術領域。
蚯蚓中含有溶解血栓作用的成分早有報導，有的用蚯蚓的粗提物在體外試驗證明有血栓溶解作用。也有的用蚯蚓粗提物治療血栓性疾病，並具有一定的療效。但該粗提物成分複雜，其中有效成分為幾種，是什麼成分，分子量多大，均不清楚。也有的從蚯蚓中提純了某種有一定纖溶活性的成分，為含有兩個亞基的分子量約為45000的蛋白質，所含兩個亞基分子量為26000與18000，該蛋白質的纖溶活性較低，其分離後的兩個亞基則基本無活性。雖然有人用高效液相色譜法純化獲得了一種蚓激酶成分，但該法不適應規模化生產。總之，目前尚未見用規模化生產的工藝技術從蚯蚓中純化出分子量在2-3.2萬之間的高活性蚓激酶的報導。
本發明的任務是公開一種蚓激酶製備工藝，從蚯蚓中提取純化蚓激酶，其分子量在3萬以下，且工藝技術適合規模化生產。
本發明的任務是通過以下方案實施的將蚯蚓用清水洗淨泥土，加入生理鹽水衝洗處理，按(V/V)1∶3～5的比例加入0.2MpH4.6～4.8的檸檬酸鈉製成勻漿，經1000～4000rpm離心20～40分鐘，取上清液，通過超濾法去除大分子蛋白，濾液用親和層析法初步純化，收集活性組分，再通過離子交換柱進一步純化，取其活性組分，再經分子篩層析，分段收集各個活性組分，取分子量為3.0±0.2萬、2.5±0.2萬及2.2±0.2萬的三種活性蛋白質；既得本發明。
本發明的積極效果在於以上三種蚓激酶純度分別達到SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)顯示一條帶，高效液相色譜(HPLC)呈現一個峰的水平。其纖溶活性均為每mg含相當於尿激酶活性1000單位以上。體外溶血栓試驗證明有良好的直接溶栓作用；動物體內試驗證明，其體內溶血栓活性優於尿激酶。經臨床200例血栓性患者使用，總有效率為100％，治癒率達40％。
下面結合實施例進一步說明本發明實施例1取蚯蚓100g用清水洗淨泥土，加入生理鹽水衝洗三次，放入300ml的0.2MpH4.6的檸檬酸鈉製成勻漿，經3000rpm離心30分鐘，取上清液用50,000dt膜超濾，濾液上GSAC柱，用0.1MpH6.6檸檬酸鈉洗脫，收集活性組分，再上DEAE-52纖維素柱，仍用0.1MpH6.6檸檬酸鈉洗脫，收集活性組分，將活性組分通過Sephacryl S-200柱，用0.1MpH6.6 PBS梯度洗脫，分段收集各個活性組分，取分子量為3.0±0.2萬、2.5±0.2萬及2.2±0.2萬的三種活性蛋白質，測定活性為1700u/mg。
實施例2取洗淨的蚯蚓150g用生理鹽水衝洗三次，加入600ml的0.2MpH4.7的檸檬酸鈉製成勻漿，經3500rpm離心20分鐘，取上清液用50,000dt膜超濾，濾液上GSAC柱，用0.1MpH6.7檸檬酸鈉洗脫，收集活性組分，再上DEAE-52纖維素柱，仍用0.1MpH6.7檸檬酸鈉洗脫，收集活性組分，將活性組分通過Sephacryl S-200柱，用0.1MpH6.7 PBS梯度洗脫，分段收集各個活性組分，取分子量為3.0±0.2萬、2.5±0.2萬及2.2±0.2萬的三種活性蛋白質，測定活性為1500u/mg。
實施例3取洗淨的蚯蚓150g用生理鹽水衝洗三次，加入600ml的0.2MpH4.8的檸檬酸鈉製成勻漿，經4000rpm離心20分鐘，取上清液用50,000dt膜超濾，濾液上GSAC柱，用0.1MpH6.8檸檬酸鈉洗脫，收集活性組分，再上DEAE-52纖維素柱，仍用0.1MpH6.8檸檬酸鈉洗脫，收集活性組分，將活性組分通過Sephacryl S-200柱，用0.1MpH6.8 PBS梯度洗脫，分段收集各個活性組分，取分子量為3.0±0.2萬、2.5±0.2萬及2.2±0.2萬的三種活性蛋白質，得本發明蚓激酶，測定活性為1400u/mg。
權利要求
1.一種蚓激酶製備工藝，包括以下工藝製備將蚯蚓用清水洗淨泥土，加入生理鹽水衝洗處理，按(V/V)1∶3～5的比例加入0.2MpH4.6～4.8的檸檬酸鈉製成勻漿，經1000～4000rpm離心20～40分鐘，取上清液，通過超濾法去除大分子蛋白，濾液用親和層析法初步純化，收集活性組分，再通過離子交換柱進一步純化，取其活性組分，再經分子篩層析，分段收集各個活性組分，取分子量為3.0±0.2萬、2.5±0.2萬及2.2±0.2萬的三種活性蛋白質。
2.根據權利要求1所述的蚓激酶製備工藝，其特徵在於親和層析法採用GSAC柱，洗脫液為0.1MpH6.5～6.8檸檬酸鈉；離子交換採用DEAE-52纖維素柱，洗脫液為0.1MpH6.5～6.8檸檬酸鈉；分子篩為Sephaeryl S-200柱，洗脫液採用0.1MpH6.5～6.8PBS。
全文摘要
本發明公開了一種蚓激酶製備工藝,將蚯蚓經生理鹽水處理,採用勻漿、凍融法製備蚯蚓粗提物,然後通過超濾、親和層析、離子交換及分子篩等技術組合,從蚯蚓中提取純化三種有纖溶活性的蚓激酶,其分子量分別為3.0±0.2萬、2.5±0.2萬及2.2±0.2萬的三種蛋白質,其純度分別達到SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS－PAGE)顯示一條帶,高效液相色譜(HPLC)呈現一個峰的水平,其纖溶活性均為每mg含相當於尿激酶活性1000單位以上。體外溶血栓試驗證明有良好的直接溶栓作用;動物體內試驗證明,其體內溶血栓活性優於尿激酶。
文檔編號C12N9/00GK1229852SQ9911280
公開日1999年9月29日 申請日期1999年4月1日 優先權日1999年4月1日
發明者孫啟良, 馮來坤 申請人:長春高斯達生化藥業集團股份有限公司