一種高產降粘酶系的菌種及其應用的製作方法

2023-09-16 02:30:25 1

專利名稱：一種高產降粘酶系的菌種及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物技術領域，涉及一種高產降粘酶系的菌種及其應用。
背景技術：
隨著石油枯竭和環境汙染問題日益嚴重，生物燃料乙醇的發展受到了世界各國的普遍的關注和重視。作為第一代燃料乙醇，玉米(美國)和甘蔗(巴西)等糧食作物為主要原料(Srichuwong S et al, 2009),在過去的幾十年裡得到了迅速的發展。但是在一些土地資源緊缺和糧食危機的一些發展中國家，以糧食為原料生產燃料乙醇是不經濟也不切實際的策略。因此以農業、林業和 工業廢棄物如秸杆等纖維素和半纖維素原料生產燃料乙醇第二代生物燃料乙醇得到了廣泛的研究(Kumar et al., 2008; Sukumaran et al., 2009; Yanget al., 2011)。但是生物質抗性(biomass recalcitrance) (Himmel et al., 2007)導致植物纖維中的結構性多糖難以被微生物利用，如果不提高纖維素降解為可發酵性糖類的動力學參數和轉化率，不解決這些原料難以降解的化學結構特徵，整個生產過程也是非常困難和昂貴的。美國計劃到2011年將生物燃料乙醇的產量提高到1.05億噸，歐盟計劃到2030年歐盟的運輸業的1/4的燃料將由生物燃料代替。在中國的十二五計劃中，燃料乙醇的產量要提高到500萬噸。在這些規劃中，要經濟且高效的生產燃料乙醇還有很大的空間。甘薯等塊莖類非糧原料具有高澱粉和可發酵性糖，且中國是世界上甘薯最大生產國，是較為理想的1.5代燃料乙醇的原料。但是這些塊莖類的發酵醪液粘度很大，導致醪液輸送困難，降低了工藝流程中的熱傳導效率和酵母的活性(Zhang et al, 2010) 0採用流加的發酵工藝和添加發酵用水不能解決實際問題。因此在甘薯等全原料發酵過程中開發了一種添加降粘酶系的工藝，即添加木聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、葡聚糖酶等商品酶達到快速降粘的效果。但是商品降粘酶價格昂貴，應用於工業生產仍然增加了生產成本。因此成本問題已成為1.5代和2代燃料乙醇生產的共性問題，要降低生產成本必須從根源上解決問題。目前還沒有針對自主開發降粘酶系的報導，因此，本發明公開一種高產降粘酶系的菌種及其應用，通過降粘酶系菌株的篩選和發酵產酶條件的優化，利用其發酵粗酶液，通過簡單的操作工序，即可降低薯類原料粘度，達到很好的預處理效果。

發明內容
本發明的目的就是為了解決以上問題，提供了一種產降粘酶並能有效地降低甘薯發酵醪液的粘度的菌株赭綠青黴(Penicillium ochrochloron Biourge),以降低燃料乙醇生產成本。為實現上述目的，本發明採用了以下技術方案:本發明公開了一種赭綠青黴(Penicillium ochrochloron Biourge),保藏號為:CBS131817。該菌株為一株降粘酶系高產菌株，命名為CMC-37，該菌株菌落為藍綠色，菌絲有橫隔，其分生孢子梗經過多次分枝，形成帚狀體。關於微生物保藏信息:
菌株名稱:赫綠青黴Penicillium ochrochloron保藏日期:27/01/2012保減單位:荷蘭微生物囷種保減中心地址:荷蘭烏特勒支3584郵政編碼區，烏普薩拉蘭8號，荷蘭皇家藝術與科學學院一荷蘭微生物菌種保藏中心(CBS-KNAW)真菌生物多樣性中心(Centraalbureau voorSchimmelcultures, FungalBiodiversity Centre, Institute of the RoyalNetherlandsAcademy of Arts and Sciences,CBS-KNAff Fungal Biodiversity Centre,Uppsalalaan8,3584CT Utrecht, The Netherlands)
保藏號:CBS131817本發明還公開了上述菌株赫綠青黴(Penicillium ochrochloron Biourge)篩選來源；具體地，所述的篩選來源於腐爛甘薯。本發明還公開了上述菌株赫綠青黴(Penicillium ochrochloron Biourge)篩選篩選過程；具體地，所述的篩選過程，腐爛甘薯經10—1，10_2，10_3，10Λ 10_5，10_6，10_7稀釋後，分別取100 μ L10_5，10_6，10_7濃度菌懸液塗布於篩選培養基上，30°C培養3天後，挑取單菌落到PDA斜面培養基中，平板用剛果紅染液染色，挑選黃色透明圈大且明顯的菌株。所述的篩選培養基為(g/L):CMC10,酵母膏 4.5，(NH4)2S044.5，NaCI5.0，Κ2ΗΡ042.0, MgSO4.7Η200.4, agar 15。

所述的剛果紅染液染色步驟為:菌落挑取後，利用1%剛果紅染液染色IOminJgJ掉染色液並用IM NaCI潤洗三次。本發明還公開了上述菌株赫綠青黴(Penicillium ochrochloron Biourge)用於發酵產生降粘酶並應用於塊莖類燃料乙醇發酵降粘預處理中的用途；具體地，所述的塊莖類優選是鮮甘薯。本發明還公開了用上述赫綠青黴(Penicillium ochrochloron Biourge)產降粘酶的發酵培養基；具體地，所述的發酵培養基為(g/L):玉米芯20，KH2P042.0,N H4N034.5，MgSO40.15，CaCl20.3，FeSO4.7Η200.0005，ZnSO4.7Η200.0014，MnSO4.H2O0.0016，COCI2.6Η200.0016，Tween803.3, ρΗ6.5。本發明還公開了赫綠青黴(Penicillium ochrochloron Biourge)產降粘酶的發酵條件；具體地，所述的發酵條件為30°C，130rpm, 5天。本發明還公開了用上述赫綠青黴(Penicillium ochrochloron Biourge)產降粘酶的降粘方法；具體地，所述的降粘方法包括:(I).打漿:甘薯塊莖原料洗淨、打漿。(2).液化:按照90 150KNU/kg澱粉在甘薯漿中添加α -澱粉酶，80 90°C液化至碘反應為紅棕色，冷卻至室溫後按料水比3: I添加自來水。(3).高溫處理:液化後將甘薯漿在115°C高溫下作用20min。
(4).預處理:溫度降低至30 50°C時，每公斤甘薯漿中添加40mL降粘酶，50°C作用2h。所述的α -澱粉酶標準酶活力為90KNU/g，酶活定義為在37°C，pH5.6時，每小時水解5.26克澱粉的酶量為I個KNU。所述的降粘酶即由赭綠青黴(Penicillium ochrochloron Biourge)發酵後經過離心，上清液再經過0.22 μ m過濾器過濾獲得。所述的粘度測定儀器為上海尼潤智能科技有限公司生產的RDV-2+PR0型數字式旋轉粘度計。本發明通過篩選獲得了一株產降粘酶的菌株赭綠青黴(Penicilliumochrochloron Biourge),該菌株利用農業廢棄物玉米芯為主要原料發酵產生降粘酶,有效利用了農業廢棄物，成本低廉，該降粘酶應用於以非糧甘薯塊莖為原料生產燃料乙醇發酵降粘預處理工藝中，降粘效果明顯，大大降低了燃料乙醇的成產成本。
具體實施例方式以下以具體實施例來說明本發明的技術方案，但並非是對本發明的技術方案的限制，本領域技術人員應該理解， 依然可以對發明進行修改或等同替換，而不脫離本發明的精神和範圍的任何修改或局部替換，其均應涵蓋在本發明的保護範圍之中。實施例1赫綠青黴(Penicilliumochrochloron Biourge)能夠在羧甲基纖維素鈉(CMC)為唯一碳源的篩選培養基生長，30°C培養3天後，剛果紅染液實驗顯示較大的黃色透明圈。實施例2赭綠青黴(Penicillium ochrochloron Biourge)接種於未經優化的發酵培養基後，30°C，130rpm培養4天後，50g液化並經過高溫後的甘薯漿加入2mL經過離心和0.22 μ m過濾器過濾獲得酶液，50°C作用2h後粘度下降率為75.78%。實施例3赫綠青黴(Penicillium ochrochloron Biourge)接種於50mL經優化的發酵培養基後，30°C，130rpm培養4天後，50g液化並經過高溫後的甘薯漿加入2mL經過離心和
0.22 μ m過濾器過濾獲得酶液，50°C作用2h後粘度下降率為84.10%。實施例4赫綠青黴(Penicillium ochrochloron Biourge)接種於50mL經優化的發酵培養基後，30°C，130rpm培養5天後，50g液化並經過高溫後的甘薯漿加入2mL經過離心和
0.22 um過濾器過濾獲得酶液，50°C作用2h後粘度下降率為89.09%。實施例5赫綠青黴(Penicilliumochrochloron Biourge)接種於 200mL 經優化的發酵培養基後，30°C，130rpm培養5天後，IOOg液化並經過高溫後的甘薯漿加入4mL經過離心和
0.22 um過濾器過濾獲得酶液，50°C作用2h後粘度下降率為84.96%。實施例6赫綠青黴(Penicillium ochrochloron Biourge)接種於20L經優化的發酵培養基後，30°C，130rpm培養5天後，150g液化並經過高溫後的甘薯漿加入3L經過離心獲得酶液，50°C作用2h後粘度下降率為89.95%。實施例7赫綠青黴(Penicillium ochrochloron Biourge)接種於20L經優化的發酵培養基後，30°C，130rpm培養5天後，300g液化並經過高溫後的甘薯漿加入6L經過離心獲得酶液，50°C作用2h後粘度下降率為91.26%。其中實施例3-7中所述 所述的經優化的發酵培養基是(g/L):玉米芯20，ΚΗ2Ρ042.0, ΝΗ4Ν034.5，MgSO40.15，CaCl20.3，FeSO4.7Η200.0005，ZnSO4.7Η200.0014，MnSO4.H2O0.0016, COCl2.6Η200.0016, Tween803.3, ρΗ6.5。
權利要求
1.一種降粘酶系菌株，其特徵在於，其分類命名為赭綠青黴(Penicilliumochrochloron Biourge),保藏於荷蘭微生物菌種保藏中心,保藏號為:CBS131817。
2.權利要求1所述的降粘酶系菌株赫綠青黴(Penicilliumochrochloron Biourge)用於發酵產生降粘酶並應用於塊莖類燃料乙醇發酵降粘預處理中的用途。
3.根據權利要求2所述的用途，其特徵在於，所述的塊莖類優選是鮮甘薯。
4.一種用權利要求1所述的赫綠青黴(Penicillium ochrochloron Biourge)產降粘酶的降粘方法，其特徵在於所述方法包括: (1).打漿:甘薯塊莖原料洗淨、打漿； (2).液化:按照90 150KNU/kg澱粉在甘薯漿中添加α-澱粉酶，80 90°C液化至碘反應為紅棕色，冷卻至室溫後按所需的料水比添加自來水； (3).高溫處理:液化後將甘薯漿在115°C高溫下作用20min； (4).預處理:溫度降低至30 50°C時，每公斤甘薯漿中添加40mL降粘酶，50°C作用2h ； 其中，降粘酶即由赭綠青黴(Penicillium ochrochloron Biourge)發酵後經過離心，上清液再經過0.22 μ m過濾器過濾獲得。
5.根據權利要求4所述的降粘方法,其特徵在於，所述的赭綠青黴(Penicilliumochrochloron Biourge)發酵的發酵培養基為(g/L):玉米芯 20，ΚΗ2Ρ042.0，ΝΗ4Ν034.5，MgSO40.15，CaCl20.3， FeSO4.7Η200.0005，ZnSO4.7Η20 0.0014，MnSO4.H2O 0.0016，COCl2.6Η200.0016，Tween 803.3，pH 6.5。
6.根據權利要求4所述的降粘方法，其特徵在於，所述的赭綠青黴(Penicilliumochrochloron Biourge)發酵的發酵條件為 30°C, 130rpm, 5 天。
全文摘要
本發明涉及一種高產降粘酶系的菌種及其應用。本發明篩選出的一株降粘酶系高產菌株，命名為CMC-37，該菌株菌落為藍綠色，菌絲有橫隔，其分生孢子梗經過多次分枝，形成帚狀體。其分類名為赭綠青黴(Penicillium ochrochloron Biourge)，保藏號為CBS131817。本發明菌株利用農業廢棄物玉米芯可以高產降粘酶系，作用於鮮甘薯粘度下降率高達91.26%，作用明顯，成本低廉。有效解決制約我國薯類原料發酵的成本問題，大幅度提升我國薯類原料發酵的可行性和經濟性。
文檔編號C12N9/00GK103146583SQ201210234738
公開日2013年6月12日 申請日期2012年7月9日 優先權日2012年7月9日
發明者趙海, 靳豔玲, 方揚, 黃玉紅 申請人:中國科學院成都生物研究所