超聲波對固定化過氧化物酶活性影響的一種實時檢測方法

2023-09-16 14:38:05

專利名稱：超聲波對固定化過氧化物酶活性影響的一種實時檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種測量酶活性變化的方法。具體涉及採用電化學傳感器對酶活性的擾動和變化進行的持續性的監測，用於檢測超聲輻射對固定化過氧化物酶催化活性的影響。
背景技術：
超聲波常用於破碎細胞並提取細胞內的酶蛋白，蛋白質的增溶與乳化，食品加工等領域。研究發現超聲輻射有時會導致酶的失活。也有研究證實，在一定功率和頻率範圍內超聲輻射非但不會使酶失活，反而可提高酶促反應的產率和酶的活性。測試超聲波對酶催化活性影響已有報導。不過，目前呈現出兩種截然不同的實驗結果。一種結果表明超聲波在任何情況下均降低酶的活性[Tian ZM et al. (2004)Ultra.Sonochem. 11 :399-404 ;宋翼行等(2008)化學與生物工程25 :27-30 ;王文宗等(2010)食品科學31 :331-334]。而另一種結果卻顯示雖然在大功率和高頻超聲波刺激下使酶的活性下降，但低功率和低頻率的超聲波反而會使酶的活性提高[Ishomori Y et al. (1981)Eur.J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 13 :197-201 ；Ishomori Y et al. (1981)Mol. Catal. 12 253-259 ；Rosenfeld E &Schmidt E. (1984)Archives Acoustics 9 105 ;魏兀忠等(1994)甘肅農業大學學報15 :79-81 ;黃卓烈等(2003)中國生物工程雜誌23 :89-93 ;錢春梅等(2004)華南農業大學學報25 73-77 ;朱少娟等(2005)食品與生物技術學報24 :50-54 ;許可等(2007)華南農業大學學報28 60-64 ;馬歌麗等(2007)現代食品科技23 :17-19 ;李慧等(2010)吉林農業大學學報32 =460-64 ;朱凱等(2011)南京工業大學學報33 :53-57]。但是，上述研究是將酶預先用超聲進行處理，然後再進行活性檢測而得到的結果。酶活性的上升或下降只是反映出超聲作用後蛋白質構象變化所殘留的結果，而不能給出酶在超聲作用下的實時變化。目前只有少量的研究是在超聲下對酶活性進行測量的[XiaoYM et al. (2005)Carbohydrate Res. 340 :2097-2103 ；Shah S&Gupta MN(2008)Chem. Cent.J. 2 l-8]。但無論哪種方法均是採用紫外-可見光分光光度計法，螢光發射光譜法、氣相或液相色譜法、凱氏定氮法進行測量。通過檢測產物的增加來估算反應速率，酶活性的變化是由產物隨時間變化的斜率來表示。這種方法實際上還不夠靈敏。上述酶催化體系多屬於均相催化反應。溶液中的酶在超聲空化作用下比較容易變性。如果採用固定化酶，催化反應速率則可受到底物傳質速率的制約，表現為反應速率隨體系的攪拌速率的加速而上升。由此，超聲波對酶活性的影響是多種因素混合的結果，它混雜著酶蛋白變性失活、底物傳質和酶蛋白構象變化的共同作用機制。以辣根過氧化物酶、底物H2O2和氫醌電子媒介體的生物傳感器可作為酶活性測定較為理想的裝置。此類傳感器技術已用於醫療、食品和環保領域的檢測。本發明構建了一套用於檢測超聲輻射對酶影響的傳感器。此方法非常靈敏，不僅能夠檢測超聲波處理過酶 的性質，而且可以對正在超聲作用下的酶進行表徵。發明內容
本發明的目的之一是為研究超聲波對酶活性的影響建立一種有價值的實驗方法。本發明的目的之二是建立一種持續性監測酶催化活性受外界物理刺激而發生變化的方法。本發明的目的之三是為研究酶動力學和機理的探索提供一種技術手段。為了達到上述目的，本發明將常用的辣根過氧化物酶/H2O2/氫醌傳感器用於酶催化活性檢測體系中。在催化反應中，HRP被H2O2氧化為HRP氧化態I。這種氧化態HRP首先被一個氫醌分子還原成HRP氧化態II，隨後再被一個氫醌分子進一步還原成HRP。而2個氫醌分子被氧化成苯醌，它們在負電極上得到電子又重新還原為氫醌，同時產生還原電流。當反應處於穩態時，充足的H2O2可使還原電流處於一個穩定的數值上。持續檢測電流值就可對酶的活性進行實時監測，包括超聲波對酶體系的影響。當酶和底物分子受到擾動時，催化活性的微小變化均可在還原電流中顯示出來。具體工藝如下電化學傳感器採用簡單的三電極系統玻碳電極為工作電極，鉬絲為對電極，甘汞電極(SCE)為參比電極。將辣根過氧化物酶和牛血清白蛋白混合後覆蓋在玻碳電極上，加入戊二醛使BSA交聯成膜。將酶修飾的工作電極與對電極和參比電極浸入含氫醌的KH2PO4-Na2HPO4磷酸鹽緩衝液(PBS)中，電極導線連接到電化學工作站，由此構建出酶傳感器。對電流-時間的曲線進行觀察。向體系加入H2O2，待電流平穩後施加攪拌。在較低的攪拌轉速下電流隨轉數的增大而升高。當攪拌提高到一定轉速時電流不再上升時，維持這一轉速，向體系施加不同的超聲輻射，並實時監測還原電流的變化。在傳感器中施加頻率45kHz和功率在40 100W範圍的超聲輻射。如附圖I所示，還原電流在超聲輻射下有顯著的提高。而且，電流隨著超聲功率的增大而逐漸上升。這說明固定化的辣根過氧化物酶在超聲作用下並沒有變性失活。超聲波的空化作用常常使均相酶變性，而固定化酶具有一定的抗變性能力。此外，在強烈的攪拌下，超聲輻射仍能夠進一步提高反應速率，此時超聲波的傳質促進作用可以被忽略。這意味著超聲波能夠對酶蛋白本身產生影響。這一點也可以從超聲作用前後蛋白質差示紫外圖譜的文獻中得到支持(黃卓烈等(2003)中國生物工程雜誌23 89-93 ;錢春梅等(2004)華南農業大學學報25 :73-77 ；許可等(2007)華南農業大學學報28 60-64 ;宋翼行等(2008)化學與生物工程25 :27-30)。在傳感器中施加功率100W和頻率在20 IOOkHz範圍的超聲輻射。在附圖2中，在頻率為45kHz的超聲作用下的還原電流趨於最大值。這暗示在該頻率周圍的一定範圍內超聲對酶蛋白活性具有較大的激勵作用。但由於超聲波發生器探頭的限制，目前尚不能實現更為細緻頻率掃描。由此得知，在排除了超聲波的攪拌作用和使酶變性失活的作用之後，以電化學傳感器能夠檢測到超聲輻射可通過影響酶構象來提高催化活性，而且在一個特定的頻率下使這種影響達到最大的效果。本發明的優點在於I.以往超聲輻射對酶催化活性影響的測定多是將酶進行超聲處理後再進行檢測，而本發明所採用的方法是檢測超聲輻射下酶活性的變化。
2.以往超聲輻射對酶催化活性影響的測定是間歇性的，是對一段時間催化反應的終態效果進行檢測。本發明能夠進行持續性監測，即是實時在線測定酶活性的即時變化，並具有很聞的靈敏性。3.本發明採用固定化酶進行測試。固定化酶具有很高的穩定性，具有抵抗超聲波空化作用使其變性的能力。4.本發明所述的方法能夠探測超聲輻射對酶分子構象的影響，可用於酶動力學和酶機理的研究。


圖I是不同超聲功率下還原電流-時間圖。將含有I. OmmoI/L的氫醌和O. Immol/ L的H2O2的PBS溶液的HRP傳感器置於超聲輻射體系中，在45kHz的頻率下依次用40、50、60、70、80、90和IOOW的功率進行超聲振蕩，得到呈逐漸上升趨勢平臺的曲線。所施加電壓相對於SCE為-O. 25V。圖2是不同超聲頻率下還原電流-時間圖。將含有I. OmmoI/L的氫醌和O. Immol/L的H2O2的PBS溶液的HRP傳感器置於超聲輻射體系中，在IOOW的功率下依次以20、45、80、IOOkHz的頻率進行振蕩，所施加電壓相對於SCE為-O. 25V。
具體實施例方式實施例I :在修飾前，用砂布上覆蓋O. 05mm的氧化鋁糊漿對玻碳電極的表面進行打磨拋光，隨後分別用丙酮、50%硝酸、50% NaOH溶液、雙蒸水對玻碳電極進行超聲清洗，室溫乾燥。將2. 5mg 300U/mL兩個過氧化物酶和4mg牛血清白蛋白溶於O. 2mL的KH2PO4-Na2HPO4磷酸鹽緩衝液(PBS，O. 05mol/L, pH值7. O)中形成混合液。然後將20 μ L的混合液滴加到玻碳電極表面。再將電極置於一個含有25%戊二醛蒸汽的封閉的容器內進行交聯4h，室溫乾燥lh，在4°C下儲藏待用。以電化學工作站和三電極系統進行循環伏安實驗。其中，以辣根過氧化物酶修飾的玻碳電極作為工作電極；鉬絲作為對電極；飽和甘汞電極作為參比電極；PBS(0. 05mol/L，pH值7. O)作為支持電解液。在室溫下，循環伏安實驗的電勢掃描範圍(相對於SCE)為-O. 6 O. 2V,掃描速率100mV/s。實施例2 檢測超聲功率效應的電化學實驗在盛有20mL支持電解液的反應池中進行。電解液中加入lmmol/L氫醌和O. ImL O. lmol/L H2O2溶液。在-O. 25V電壓下記錄初始電流的基線。調節攪拌器轉速到400 600轉/min，直至還原電流不再上升。然後，將反應池置於5L超聲清洗器中，調節超聲頻率為45kHz，依次用功率為40、50、60、70、80、90和100W的超聲輻射進行處理，每個功率持續100s，得到一種逐漸上升的群峰形的電流-時間曲線。實施例3:檢測超聲頻率效應的電化學實驗在盛有20mL支持電解液的反應池中進行。電解液中加入lmmol/L氫醌和0. ImL 0. lmol/L H2O2溶液。在-0. 25V電壓下記錄初始電流的基線。調節攪拌器轉速到400 600轉/min，直至還原電流不再上升。然後，將反應池置於5L超聲清洗器中，調節超聲功率為100W，依次用頻率為20、45、80、IOOkHz的超聲輻射進行 處理，每個頻率持續100s，得到一種先上後降趨勢的群峰形電流-時間曲線。
權利要求
1.一種實時檢測超聲波對酶活性影響的工藝方法，其特徵在於通過電化學傳感器的電流-時間曲線持續跟蹤超聲輻射對固定化酶活性的影響。
2.根據權利要求I所述的一種實時檢測超聲波對酶活性影響的工藝方法，其特徵在於所利用的傳感器是基於辣根過氧化物酶催化H2O2與氫醌的氧化還原反應。
3.根據權利要求I所述的一種實時檢測超聲波對酶活性影響的工藝方法，其特徵在於辣根過氧化酶是通過戊二醛交聯的牛血清白蛋白固定在傳感器的玻碳電極上的。
4.根據權利要求I所述的一種實時檢測超聲波對酶活性影響的工藝方法，其特徵在於在超聲輻射頻率45kHz和功率範圍在40 100W下，通過檢測還原電流的變化對酶活性的變化進行測量。
5.根據權利要求I所述的一種實時檢測超聲波對酶活性影響的工藝方法，其特徵在於在超聲輻射頻率100W和頻率範圍在20 IOOkHz下，通過檢測還原電流的變化對酶活性的變化進行測量。
全文摘要
本發明公開了一種用電化學傳感器實時檢測超聲波對酶活性影響的工藝方法。所述的工藝方法是在固定化的過氧化物酶催化H2O2與氫醌的氧化還原反應體系中，利用反應過程中還原電流與反應速率存在的定量關係，通過還原電流的變化來實時檢測超聲輻射對酶活性的作用的效果。此技術不僅能夠檢測超聲波處理過酶的性質，而且可以對正在超聲作用下的酶進行表徵。不同的超聲功率下酶活性的增高說明此方法並沒有使酶失活；而不同的超聲頻率下酶活性所出現的峰值說明該方法可以偵測超聲輻射對酶分子本身的效應，可為細胞中酶的提取、食品加工，以及酶催化機制的研究提供一種檢測手段。
文檔編號G01N27/48GK102645480SQ20121014435
公開日2012年8月22日 申請日期2012年5月11日 優先權日2012年5月11日
發明者王緹緹, 邢達傑, 黃積濤, 黃薇 申請人:南開大學