高表達水平的轉基因動物乳腺特異性載體的構建方法
2023-09-16 05:53:30 2
專利名稱:高表達水平的轉基因動物乳腺特異性載體的構建方法
技術領域:
本發明屬生物工程技術領域,該技術應用於製備轉基因動物乳腺生物反應器。
背景技術:
轉基因動物乳腺生物反應器是利用動物乳腺器官生產生物藥品或生物製品,具有很高的商業應用價值,但在乳腺生物反應器製備中效率較低,在轉基因動物乳腺中的表達率和表達水平是隨機和不確定的,大部分的表達水平低下。目前,通用的乳腺特異性表達基因是由乳蛋白調控元件和功能基因兩部分組成,這種基因構件雖然對啟動功能基因表達和表達的特異性有調控作用,但表達水平和表達率很低。其總體的基因結構是5』-端乳蛋白調控序列→功能基因→3』-端乳蛋白調控序列。這種構件雖然也有表達事例,但表達率僅1-10%;乳汁中表達產物含量在0.1-3mg/ml左右。表達率的低下增加了轉基因動物乳腺生物反應器的製備成本;表達水平過低又增加了後期開發的成本及降低了以乳腺生物反應器生產藥物的經濟效益。因此,國內外研究乳腺生物反應器的專家都在尋找提高表達水平的方法。
目前,動物乳腺特異性表達要解決的主要問題仍然是表達水平,構件中單純應用乳蛋白調控序列很難達到高水平。根據以往的報導,這種融合基因構件用於動物轉基因,在動物乳汁中的表達產物含量一般在2mg/ml以下。
發明內容
本發明目的是發明一種在動物乳腺中能提高表達水平的轉基因動物乳腺特異性表達載體的構建方法。
本發明以巨細胞病毒(CMV)非編碼序列為增強子序列,將巨細胞病毒增強子序列構建在動物乳蛋白調控序列和功能基因之間,組成乳腺特異性表達載體,從而可提高乳腺特異性表達水平和表達率。
本發明應用真核基因增強子序列為巨細胞病毒增強子序列(約500bp);動物乳蛋白調控序列可以是酪蛋白非編碼區或乳球蛋白非編碼區;功能基因可以是cDNA或基因組DNA,這些元件一起組成乳腺特異性表達載體,以提高轉基因動物乳腺生物反應器表達水平和表達率。
基因構建中的CMV序列的應用是關鍵,在國內外尚無類似應用先例。通過實驗證明本發明可提高乳腺特異性表達量1~10萬倍,提高表達率2~5倍。本發明能顯著提高轉基因動物乳腺生物器的產量,具有很大的應用價值,尤其是表達水平和表達特異性的提高可以減少後期開發利用的投入,提高經濟效益100-1000倍。
本發明所述動物乳蛋白調控序列可以包括羊β-酪蛋白上遊的4-10kb和下遊的2-12kb的調控序列;也可以包括山羊β-乳球蛋白上遊3-10kb和下遊2-10kb;這些調控序列都可與增強子序列合併應用,構建乳腺特異性表達載體。
所述的增強子序列是CMV的非編碼序列(約500bp)。發明了這些調控元件必須與CMV增強子序列共同使用,只要將增強子序列放在適當的位置,將提高乳腺表達的水平和表達率。
本發明包括以下具體步驟1)巨細胞病毒增強子序列來源於病毒或商業應用質粒載體(如pcDNA),取其中片段;2)將巨細胞病毒增強子序列基因片段構建在動物乳蛋白調控序列和功能基因之間,組成表達載體;3)將構建的表達載體在通用的質粒載體(如pBR-322)中擴增,並用相應的內切酶(根據質粒中的酶切位點而定)去除質粒載體部分,回收動物乳腺特異性表達載體片段。
將這些載體片斷通過顯微注射或其它轉基因方法製作轉基因動物,將在這些轉基因動物乳汁中獲得與功能基因相一致的表達產物。
另,上述步驟3)中,質粒載體可根據各個元件的大小來選擇不同的質粒載體。
本發明應用CMV增強子序列(519bp)來調控功能基因的表達水平,同時給合山羊乳蛋白調控序列包括β-酪蛋白上遊的4-10kb和下遊的3-12kb;β-乳球蛋白上遊3-10kb和下遊2-10kb。這些調控序列與CMV增強子序列合併應用,構建的乳腺特異性表達載體。
具體實施例方式
一、基因構建過程1、巨細胞病毒增強子序列來源於pcDNA載體,取其中片段,該基因片段具有以下序列特徵cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 480acggtgggag gtctatataa gcagagctct caattata2、將巨細胞病毒增強子序列構建在山羊β-酪蛋白上遊的4-10kb和下遊的3-12kb(非編碼區序列)和人乳鐵蛋白基因(cDNA)之間,組成乳腺特異性表達載體。
或將巨細胞病毒增強子序列構建在山羊β-乳球蛋白上遊3-10kb和下遊2-10kb(非編碼區序列)和人乳鐵蛋白基因(cDNA)之間,也可組成乳腺特異性表達載體。
3、構建的載體在質粒pBR-322中擴增,並用內切酶Sall和Notl切去質粒部分,回收載體片段。
二、驗證效果將這些DNA片段通地顯微注射的方法導入小鼠受精卵,獲得原代轉基因小鼠1隻(母),該小鼠成年生產後收集其乳汁,分離獲得乳清用這幾種元件構建的基因構件製備轉基因小鼠,獲得整合母鼠1隻,經ELISA表達檢測,其乳鐵蛋白含量達到20-50mg/ml(人初乳中含量是6-8mg/ml,後期乳中是2-4mg/ml),達到人初乳的5倍。
該轉基因小鼠繁殖的後代母鼠有部分也是轉基因小鼠,後代轉基因鼠乳中的表達水平與原代鼠基本一致。
權利要求
1.在動物乳腺中高表達水平的轉基因動物乳腺特異性載體的構建方法,其特徵在於以巨細胞病毒部分非編碼序列為增強子序列,將巨細胞病毒增強子序列構建在動物乳蛋白調控序列和功能基因之間,組成乳腺特異性表達載體。
2.根據權利要求1所述高表達水平的轉基因動物乳腺特異性載體的構建方法,其特徵在於所述動物乳蛋白調控序列包括山羊β-酪蛋白上遊的4-10kb和下遊的3-12kb。
3.根據權利要求1所述高表達水平的轉基因動物乳腺特異性載體的構建方法,其特徵在於所述動物乳蛋白調控序列包括山羊β-乳球蛋白上遊3-10kb和下遊2-10kb。
4.根據權利要求1或2或3所述高表達水平的轉基因動物乳腺特異性載體的構建方法,其特徵在於包括以下具體步驟1)從病毒基因序列或商業化質粒載體中截取巨細胞病毒增強子序列基因片段;2)將巨細胞病毒增強子序列基因片段構建在動物乳蛋白調控序列和功能基因之間,組成表達載體;3)將構建的表達載體在通用的質粒載體中擴增,並用相應的內切酶切去質粒部分,回收動物乳腺特異性表達載體片段。
全文摘要
高表達水平的轉基因動物乳腺特異性載體的構建方法,生物工程技術領域,該技術應用於製備轉基因動物乳腺生物反應器。以巨細胞病毒部分非編碼序列為增強子序列,將巨細胞病毒增強子序列構建在動物乳蛋白調控序列和功能基因之間,組成乳腺特異性表達載體。本發明應用真核基因增強子序列為巨細胞病毒增強子序列(約500bp);動物乳蛋白調控序列可以是酪蛋白非編碼區或乳球蛋白非編碼區;功能基因可以是cDNA或基因組DNA,這些元件一起組成乳腺特異性表達載體,以提高轉基因動物乳腺生物反應器表達水平和表達率。
文檔編號C12N15/33GK1873011SQ20061004043
公開日2006年12月6日 申請日期2006年5月10日 優先權日2006年5月10日
發明者成勇 申請人:揚州大學