可辨認感染性普立昂蛋白質的單株抗體及其用途

2023-09-16 06:05:50

可辨認感染性普立昂蛋白質的單株抗體及其用途
【專利摘要】本發明是關於可用於特異性辨認感染性普立昂蛋白(PrPSc)的單株抗體，本發明的單株抗體特徵在於不需要經過蛋白水解酶的反應，就能夠直接特異性地辨認PrPSc蛋白，可提供用來建立一種高特異性及高靈敏度的普立昂疾病檢測方法與套組。
【專利說明】可辨認感染性普立昂蛋白質的單株抗體及其用途
【技術領域】
[0001]本發明關於可專一性辨認感染性普立昂蛋白質(scrapie prion protein, PrPsc)的單株抗體，特別地，是關於可與普立昂蛋白質C端以β褶版(Psheet)為主的片段結合的單株抗體，及其用於檢測普立昂疾病的用途。
【背景技術】
[0002]普立昂疾病(prion diseases)又稱作傳染性海綿體腦部病變(Transmissiblespongiform encephalopathies,以下簡稱TSE),病理特徵是在腦部會出現海綿狀空洞、神經元細胞死亡、星狀細胞增生、組織染色出現澱粉斑塊(amyloid plaque);臨床特徵通常在長時間的潛伏下會出現漸進式的行為、運動失調、痴呆等(Ludlam, C.A.，Lancet351:1289-1290，1998; Soto, C.，Nature reviews Microbiology2:809-819，2004)，雖與其他神經性退化疾病如阿茲海默(Alzheimer disease)、帕金森氏症(Parkinson disease)相似,但是獨特的地方在於其具有傳染性，會嚴重影響動物如羊騷癢症(Scrapie)、狂牛症(bovinespongiform encephalopathy,以下簡稱 BSE),以及人類如庫賈氏症(Creutzfeldt-Jakobdisease, CJD)、Gerstmann-Straussler-Scheinker 氏症(GSS)、致死性家族失眠症(Fatalfamilial insomnia, FFI)等。人類的普立昂疾病的致病原因可分為遺傳性:GSS、FF1、fCJD ；後天獲得:Kuru、iCJD、vCJD ;未知:sCJD，動物則是因為有吃自己同類屍體的習慣，而有傳染性紹腦病變(Transmissible mink encephalopathy),及因牛誤食羊騷癢症(Scrapie)的羊製成的肉骨粉，而產生的狂牛症(BSE)。 [0003]在公元1986年，英國首次爆發從未出現過造成大量牛隻死亡的疾病，即為後來所知的狂牛症(Wells, G.A.，et al., The Veterinary recordl21:419-420，1987),接著幾年也開始在其他國家陸續出現案例，造成大規模流行。目前研究顯示，BSE的爆發可能是因為在作為牛飼料添加的肉骨粉中，含有大量的羊搔癢症病原所致，這也暗示TSE似乎會跨越種別差異，而造成另一物種的疾病發生，人類的庫賈氏病在1920年代初期被發現，為一種相當罕見的疾病，發生率約為每百萬人口 0.5~I名病例。此病的病理症狀與狂牛症類似。
[0004]過去幾年來各國已經確信BSE是嚴重的問題，目前在病原的鑑定上，主要的檢體來源都是「死後」的腦部組織，僅可由嚴重感染的牛隻腦部組織做成乳劑後，以人工接種感染小鼠來證實BSE的病原是可傳播感染的；但這類接種感染的方式卻最少須150幾天的感染期才能證實有無感染成立。而現今WHO及OIE所承認的診斷方法，是以死後檢查臨床疫情、症狀、顯微病理變化、免疫組織化學染色技術及西方免疫墨點轉潰法等，來作為普立昂疾病的診斷依據(Hardt, M., et al., Journal of comparative pathologyl22:43-53，2000;Ingrosso, L., et al., Trends in molecular medicine8, 273—280，2002)。以下將分別敘述現有常用的幾個TSE檢測方法:
[0005]1.西方免疫墨點轉潰法:原理是依據？衝&被蛋白酶K水解後會產生27~30kDa(PrPres)大小的訊號，將腦組織均質液與蛋白酶K反應後，接著利用單株抗體6H4(抗原決定位:DYEDRYYRE)偵測，此方法的好處是可以減少檢測上的錯誤率，因為相對於用酵素免疫分析法(ELISA)全長PrPG部分沒被水解掉進而幹擾PrP27_30訊號的現象，此外也可以發現新的PrPse種(strain)。
[0006]2.CEA/BioRad檢測:是將腦組織先經過一連串去活性(denaturation)及濃縮步驟後，進行利用兩種單株抗體三明治型的酵素免疫分析法。此方法較其他方法的偵測靈敏度高，可到0.5-2.0pmol，但是相對於其他方法，從純化到濃縮腦組織液需要耗費相對多的時間及人力，也同樣有會受到未完全被水解掉的PrPe片段幹擾的困擾。
[0007]3.結構依據(conformation dependent)免疫分析:是利用抗體對於原始及變性後的PrP有不同的鍵結能力，而建立的三明治酵素免疫分析法。抗體會辨認只在PrPse變性後才出現的結構依據抗原決定位(conformational epitope),特別是不用依賴蛋白水解酵素，故對於蛋白酶K敏感的PrPse株(strain)仍舊可以偵測的到，但缺點是相對於其他快速檢測方式，其需要較多的處理步驟。
[0008]上述方式都具有潛在性的問題，由於其偵測極限過高(目前具備最低偵測極限的檢測方法是CEA/Biorad檢測)，而使許多牛隻可能處於PrPse潛伏階段，還未出現任何臨床症狀，以致所獲得的化學檢測結果呈現偽陰性(false negative)。另外，類似的情況也會發生在人類，目前對於「活著」的CJD患者的症狀出現前(pre-symptom)檢測仍舊在發展中，所以同樣的問題在於，如果vCJD患者在未知的狀態下進行手術、捐贈器官、輸血等醫療行為，而鑑於PrPse耐高溫、不怕殺菌劑的特性，其一旦附著在手術器具上，便無法清除乾淨，接著就會發生傳染造成醫源性(iatrogenic) CJD案例的發生。另外，根據PrPse的特性,檢體取得後通常需要經過蛋白水解酶的處理，但是這樣的處理會使得原本存在少量的PrPse損失，逃過偵測極限而得到另外一種偽陰性的發生。總結上述，目前仍需要發展一種於臨床症狀發生前、活體狀態下，採取的檢體不需要經過蛋白水解酶的處理，而能夠直接特異性地辨認PrPsc,並且提升偵測極限的檢測方法。
[0009]發展專一結合PrPse結構的抗體，是一直以來研究普立昂疾病的重點，而普立昂蛋白的特點在於，它並不像其他感染性物質如病毒、細菌能夠引起強烈的免疫反應，在PrP蛋白正常表達的動物(Prnp+/+)於普立昂疾病發生的過程，因為正常B細胞、T細胞表面即有廣泛分布的PrPe,而PrPse的初級結構可能與PrPe相似，使得B細胞有免疫耐受性而沒有免疫反應(Bueler, H., et al., Cell73, 1339-1347, 1993;Kascsak, R.J., et al., Journalof virology61:3688, 1987;Prusinerj S.B.,et al., The Journal of infectiousdiseases167:602-613，1993) 0
[0010]這幾年來嘗試不同策略，但仍舊無法發展出專一性高的辨認PrPse抗體，最早在1997年，Korth的團隊利用重組牛蛋白製造出15B3，該抗體雖然可以免疫沉澱牛、小鼠、人類的PrPse而非PrPG，但是在實際應用上卻因為其對於普立昂蛋白質相對弱的結合能力，而使其無法實現於臨床診斷(Korth，C.，et al.，Nature390:74, 1999)。因此，開始修正採用全長片段(不包含N端)的免疫原策略，製造β褶版為主的重組蛋白、增加酪胺酸(tyrosine)殘基，根據不同的物種酪胺酸-酪胺酸-精胺酸(tyrosine-tyrosine-arginine)重複序列設計合成胜肽片段(Paramithiotis, et al.2003),使用羊搔癢症相關纖維絲(scrapie-associated fribril, SAF) (Morel, N., et al., The Journal of biologicalchemistry279:30143-30149, 2004)也生產出能夠辨認PrPse的抗體，但之後的實驗卻發現其仍舊能夠辨認PrPG。截至目前，雖然生產出許多的抗PrP抗體能夠辨認各種形式的PrP，但是對於純化原始狀態(native)PrPSc;的辨認，僅只剩下微弱的訊號。

【發明內容】

[0011]於是，本發明的一方面，是關於一種特異性辨認感染性普立昂蛋白(PrPSc)的單株抗體，其特徵在於與包含普立昂蛋白的胺基酸141-182(SEQ ID N0.1)的肽片段結合。
[0012]於本發明的一具體實施態樣，所述的單株抗體可辨識在結構上以β褶版為主的普立昂蛋白。於本發明的一具體實施態樣，所述的普立昂蛋白形成β寡聚體。
[0013]於本發明的一些具體實施態樣，所述的單株抗體與包含普立昂蛋白的胺基酸141-152 (SEQ ID N0.2)的肽片段結合。於本發明的一些具體實施態樣，所述的單株抗體與包含普立昂蛋白的胺基酸171-182 (SEQ ID N0.3)的肽片段結合。
[0014]本發明的另一方面，是關於一種特異性偵測感染性普立昂蛋白(PrPse)的抗體的製造方法，其包含製備一種在結構上以β褶版為主的重組型普立昂蛋白；將所得的重組型普立昂蛋白免疫小鼠產生抗體；及分離及純化出該抗體。所述的抗體包單株抗體及多株抗體。
[0015]於本發明的一具體實施態樣，所述的重組型普立昂蛋白在結構上會自動由α轉變成β褶版形式為主，且自動聚合成β寡聚體。於本發明的另一具體實施態樣，所述的重組型普立昂蛋白包含Ser-132、Asn-181、Cysl79、Cys-214四個位點的突變。
[0016]本發明的又一方面，是關於一種特異性偵測感染性普立昂蛋白(PrPse)的診斷套組，其特徵在於包含本 發明的單株抗體。
[0017]本發明的又另一方面，是關於一種普立昂疾病檢測方法，其包含取得腦部組織樣本；及利用本發明的單株抗體進行免疫分析，偵測樣本中是否存在感染性普立昂蛋白(PrPscO。於本發明的一些具體實施態樣，所述的腦部組織樣本為腦組織均質液。於本發明的其他具體實施態樣，所述的腦部組織樣本為腦部組織切片。
[0018]於本發明的一具體實施態樣，所述的感染性普立昂蛋白(PrPse)在結構上以β褶版為主的普立昂蛋白。於本發明的另一具體實施態樣，所述的感染性普立昂蛋白形成β寡聚體。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1顯示利用ELISA分析(A)及西方墨點法(western blot)分析(B),確認A2、A3、3B融合瘤細胞在HAT培養篩選下抗體的分泌情況。
[0020]圖2顯示抗-m β PrP單株抗體mAb_A2、A3及3B的抗體異構型分析結果。
[0021]圖3顯示利用點轉潰(dot plot)方式比較單株抗體A.A2、B.A3、C.3B對於不同量的小鼠β PrP和重組牛PrP的辨認差異。
[0022]圖4顯示以ELISA的方式比較Α2 (A)、A3 (B) R 3Β (C)對於小鼠β PrP及a PrP辨識的差異的結果。
[0023]圖5為用胜肽掃描(peptide scan)分析單株抗體抗體抗原決定位序列結果。其中A-C將93-230的小鼠PrP序列分成22段，並將這些胜肽片段覆蓋於96免疫酵素分析盤內，進行ELISA分析。D為藉由胜肽掃描所得到抗原決定位，相對抗體的示意圖。
[0024]圖6為以西方墨點轉潰法分析mAb_A2、A3、3B對正常小鼠腦組織均質液及感染性小鼠腦組織均質液的辨識。其中樣品包括，有(+)或無(-)經過50 μ g/mL蛋白酶K處理的正常小鼠腦組織均質液，NBH(lane3, 4，7，8，11，12，14，15)，及感染性PrPsc (10%22L)小鼠腦組織均質液(lanel, 2，5，6，9，10 及 13)。
[0025] 圖7顯示利用實驗室自製的三株可辨認PrP的單株抗體_A2、A3、3B對已感染22LPrPse病變的小鼠腦部切片和正常小鼠健康的腦部切片(normal control)進行免疫組織染色，所呈現的結果為小腦區域。免疫前(Pre-1mmune)組是利用BALB/c小鼠免疫前血清，在此作為陰性對照組(Negative control),左側標示為所使用的抗體,包括免疫前、A2、3B、A3 ;下方標示為顯微鏡放大倍率，前兩欄為感染性小鼠切片，第三欄是正常小鼠腦部切片。
【具體實施方式】
[0026]本發明的其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明的範圍。
[0027]根據本發明所呈現的各種實施例，下述各種儀器、裝置、方法和其相關結果者，實施例中為了方便讀者閱讀所使用的標題或副標題，並不被限制在本發明的範圍之內。
[0028]實施例1:單株抗體的製造及特性分析
[0029]單株抗體的製造
[0030]首先將小鼠普立昂蛋白的四個位點Ser-132、Asn-181、Cysl79、Cys-214作突變，得到重組小鼠普立昂蛋白，接著以電子順磁光譜(Electron paramagneticresonance, EPR)、旋光光譜儀(Circular dichroism)進行分析發現,該重組的小鼠普立昂蛋白在低鹽pH=7室溫的狀態下，會自動由α轉變成β褶版形式為主，且自動聚合成β寡聚體。因此將所製得會自發性結構轉變的小鼠普立昂蛋白，即小鼠PPrP(被認為結構近似於PrP」，做為免疫小鼠的免疫原，製造出獨特的單株抗體。
[0031 ] 每隻BALB/c小鼠以50 μ g的大腸桿菌生產的重組小鼠普立昂蛋白，結構以β褶版為主(mouse PPrP，簡稱πιβ PrP)加入IX PBS將體積帶大到250ul，並加入250ul完全Freund’s佐劑，在注射筒內混合均勻，以腹腔注射的方式將抗原打入小鼠的體內，接著2周後進行追加注射，每隻小鼠再以50 μ g的πιβ PrP加入IXPBS將體積帶大到250ul，並加入250ul不完全Freund’s佐劑(Incomplete Freund’s adjuvate)，在注射筒內混合均勻，以腹腔注射的方式將抗原打入小鼠的體內，之後每次追加注射後I周採集血液並分離血清進行酵素免疫分析法，於第5次追加注射後，抽血後分離出血清進行酵素免疫分析法，決定小鼠，準備進行細胞融合。
[0032]施打πιβ PrP重組蛋白過後，會促使脾臟內的B細胞產生特定抗體，與癌化細胞融合行成可在體外培養且具特定抗體的細胞株，本實驗利用抗原免疫的小鼠(BABL/c mice)的脾臟與骨髓瘤細胞株NS-1進行融合。接著將細胞培養於HAT培養基(HAT growthmedium)，分裝到6個96孔培養盤中，靜置7~14天觀察細胞生長狀況。以3種限制性稀釋(快速稀釋細胞法，慢速稀釋細胞法及細胞計數法)的方式，得到單一母細胞所產生的單株抗體，並以酵素免疫分析法及西方墨點法進行特異性確認。最後我們分別得到3株πιβ PrP單株抗體細胞，Α2、A3及3Β (圖1)。
[0033]接著將單株抗體細胞株殖入小鼠腹腔內生長，由腹水取得高濃度的單株抗體。由於單株抗體細胞培養液中的HAT培養基對於小鼠是具有毒性的，所以須將篩選出的單株抗體細胞更換成一般RPMI培養液，才能殖入小鼠體內得到高濃度的單株抗體。之後進行腹水中的單株抗體純化，將0.5ml蛋白G/A瓊脂糖(protein G plus protein A agarose)裝到管柱內，以ImllXPBS清洗瓊脂糖，將IXPBS等量混合均勻的腹水共6ml加到管柱內，重複流過管柱3~5次，加入5ml的IXPBS清洗瓊脂糖，再加入IOml0.5M NaOAC (pH=3)+0.01%迭氮化鈉(sodium azide)到管柱，純化出抗體，重複3-5次,加入2.5ml2M Tris base+0.01%迭氮化鈉到第一批純化抗體，平衡酸鹼值；加入5mll0mM甘胺酸(pH=3)+0.01%迭氮化鈉到管柱，純化出抗體，重複3-5次，加入1.25ml2MTris base+0.01%迭氮化鈉到第二批純化出的抗體，平衡酸鹼值。取出濃縮離心管，將二批抗體混合，使用濃縮管濃縮至Iml以下，濃度定量後，分裝每管100 μ g的量(用於嗜菌體呈現技術)，其餘存放在_20°C /_80°C。
[0034]抗-πιβ PrP單株抗體mAb_A2、A3、3B的異構型鑑定
[0035]將2.5μ g/ml免疫球蛋白覆蓋在96孔免疫酵素分析盤內，一抗用培養中的融合瘤細胞A2、A3、3B的培養上清液，二抗使用不同免疫球蛋白(結合HRP辨識重鏈的抗_IgA、IgM、IgGl、IgG2a、IgG2b及IgG3抗體；結合HRP辨識輕鏈的抗_ κ鏈及λ鏈抗體)，測讀490波長，可測得單株抗體的免疫球蛋白的重鏈與輕鏈。結果顯示，本發明所製得的三株mi3PrP單株抗體Α2、Α3及3Β的免疫球蛋白，其重鏈為IgM，輕鏈為κ鏈(參見圖2)。
[0036]使用點轉潰(dot plot)方法比較單株抗體A2、A3與3B對於不同量的ηιβ PrP和重組牛PrP的辨認差異 [0037]利用點轉潰(Dot blot)分析在原始的(native)結構狀態下，相同物種的PrP蛋白會以不同的立體結構存在型式，ma PrP是以單體(monomer)存在，mβ PrP則以寡聚合體(oligomer)存在。將 5 μ g、I μ g、0.5 μ g、及 0.I μ g 的 ηιβ PrP 及 m a PrP 點在 PVDF 轉潰膜上，接著加入5%牛奶阻斷(blocking),使用不同倍率稀釋的mAb A2、A3、3B單株抗體反應為一級抗體，以小鼠免疫前的血清作為負對照組，進行反應。結果參見圖3。
[0038]由圖3A顯示,A2單株抗體在10 μ g/ml到50 μ g/ml濃度之間對於ηιβ PrP辨認的極限較好，能夠偵測到0.1 μ g的蛋白，但是對於5m a PrP只偵測能到Iyg ;濃度I μ g/ml下的A2單株抗體對於10 μ g m a PrP有微弱的訊號，相對在πιβ PrP則沒有。圖3Β顯示，A3單株抗體在10 μ g/ml到50 μ g/ml濃度之間對於mβ PrP的辨識訊號較對於m a PrP好,尤以星號標示處更為顯著，但在抗體濃度I μ g/ml下，其對於該二蛋白的辨識度就無差異。圖3C則顯示，單株抗體3B在濃度I μ g/ml到20 μ g/ml濃度之間對於5 μ g ηιβ PrP的辨認情形較對於m a PrP的優,且3B單株抗體在濃度50 μ g/ml下,對於0.1 μ g ηιβ PrP的辨認情形比ma PrP好，其他則沒有太大的差異。綜合上述，mAb A2、A3、3B三個單株抗體對於ma PrP或mPPrP皆能夠辨認,而該等單株抗體在10 μ g/ml到50 μ g/ml之濃度間,對於mPPrP的偵測極限較對於m a PrP的好。
[0039]ELISA分析抗-PrP單株抗體A2、A3、3B對於m β PrP及a PrP辨識的差異
[0040]亦進行ELISA分析，將各單株抗體對於不同蛋白的辨認情形以數值方式呈現。將200ng/well的小鼠β PrP、a PrP蛋白各自覆蓋於免疫酵素分析盤的孔內，接著加入經不同倍率稀釋的mAbs A2、A3、3B單株抗體為第一抗體，二抗為抗-小鼠IgM(l:4000)，進行反應，接著以OPD成色。結果顯示，單株抗體A2、A3及3B在I μ g/ml到200 μ g/ml濃度之間，對於πιβ PrP的辨認較對於ma PrP的辨視能力好(參見圖4)。在重組蛋白辨識的結果統合包括圖1結果，可以知道在蛋白質存在自然(native)型式下，本發明的單株抗體可以辨認另外一個物種(牛)來源的PrP，並且對於單體及寡聚合體有不同的親和性。
[0041]實施例2:單株抗體的抗原決定位序列分析
[0042]胜肽掃描(peptidescan)分析
[0043]將93-230的mPrP序列分成22段，每段12個胺基酸組成，各有6個胺基酸重複，將這些胜肽片段覆蓋於96免疫酵素分析盤內，進行ELISA分析，一抗使用純化過的A2、A3、3B單株抗體，並利用抗-小鼠IgM結合HRP的多株抗體做為二次抗體。
[0044]利用胜肽掃描結果如圖5，發現單株抗體A3的胜肽抗原決定位在141-152GNDWEDRYYREN (SEQ ID N0.2)，而單株抗體A2與3B的抗原決定位則是位在同一位置，171-182QNNFVHDAVCIT(SEQ ID N0.3)。
[0045]嗜菌體呈現技術
[0046]隨機挑選經過四次篩選的嗜菌體群落並且抽取其DNA送定序整理結果如下，序列後的括號代表(出現次數/所挑選的全部序列數量)，粗體字代表交叉比對都有出現的序列，統整可能的序列於每個表格最下面一列，底線代表比對回去有的序列。
[0047]抗體:mAb-A2
[0048]
【權利要求】
1.一種特異性辨認感染性普立昂蛋白(PrPse)的單株抗體，其特徵在於與具有普立昂蛋白的胺基酸141-182 (SEQ ID N0.1)的肽片段結合。
2.根據權利要求1所述的單株抗體，其特徵在於，該單株抗體可辨識在結構上以β褶版為主的普立昂蛋白。
3.根據權利要求1或2所述的單株抗體，其特徵在於，該單株抗體可辨識形成β寡聚體的普立昂蛋白。
4.根據權利要求1所述的單株抗體，其特徵在於，該單株抗體的抗原決定位位於普立昂蛋白的胺基酸141-152 (SEQ ID N0.2)。
5.根據權利要求1所述的單株抗體，其特徵在於，該單株抗體的抗原決定位位於普立昂蛋白的胺基酸171-182 (SEQ ID N0.3)。
6.一種特異性偵測感染性普立昂蛋白(PrPse)的抗體的製造方法，其特徵在於，包含: (a)製備一種在結構上以β褶版為主的重組型普立昂蛋白； (b)將所得的重組型普立昂蛋白免疫小鼠產生抗體；及 (C)分離及純化出該抗體。
7.根據權利要求6所述的製造方法，其特徵在於，該抗體包括單株抗體及多株抗體。
8.根據權利要求6所述的製造方法，其特徵在於，該重組型普立昂蛋白在結構上會自動由α轉變成β褶版形式為主，且自動聚合成β寡聚體。
9.根據權利要求6所述的製造方法，其特徵在於，該重組型普立昂蛋白包含Ser-132、Asn-181、Cysl79、Cys-214 四個位點的突變。
10.一種特異性偵測感染性普立昂蛋白(PrPse)的診斷套組，其特徵在於包含根據權利要求I所述的單株抗體。
11.一種普立昂疾病檢測方法，其特徵在於，包含: (a)取得腦部組織樣本；及 (b)利用如權利要求1所述所述的單株抗體進行免疫分析，偵測樣本中是否存在感染性普立昂蛋白(PrPsc)。
12.根據權利要求11所述的普立昂疾病檢測方法，其特徵在於，該腦部組織樣本為腦組織均質液。
13.根據權利要求12所述的普立昂疾病檢測方法，其特徵在於，該免疫分析為西方墨點轉潰法。
14.根據權利要求11所述的普立昂疾病檢測方法，其特徵在於，該腦部組織樣本為腦部組織切片。
15.根據權利要求14所述的普立昂疾病檢測方法，其特徵在於，該免疫分析為免疫組織染色。
16.根據權利要求11所述的普立昂疾病檢測方法，其特徵在於，該感染性普立昂蛋白(PrPsc)在結構上以β褶版為主的普立昂蛋白。
17.根據權利要求16所述的普立昂疾病檢測方法，其特徵在於，該感染性普立昂蛋白形成β寡聚體。
【文檔編號】C07K16/18GK103897056SQ201310662163
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2013年12月9日 優先權日:2012年12月25日
【發明者】陳宜民, 黃思惟, 林盈妤 申請人:法瑪科技顧問股份有限公司