食管癌相關肽和熱休克蛋白形成的複合物及其應用的製作方法

2023-09-16 06:05:15

食管癌相關肽和熱休克蛋白形成的複合物及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種食管癌相關的MAGE-A4和NY-ES0-1蛋白表達的長度為9個胺基酸的肽段，所述肽段的胺基酸序列見序列表中的序列1至序列6中的任意一個。本發明還提供了這些抗原肽與熱休克蛋白gp96和HSP78的複合物及其製備方法，複合物包括gp96和HSP78與抗原多肽以非共價鍵結合的複合體，和二者以共價鍵連接形成的融合蛋白。這些肽段單獨或形成的複合物可以誘導針對食管癌的特異性的CTL。這種複合物可用於製備治療食管癌的治療性疫苗。
【專利說明】食管癌相關肽和熱休克蛋白形成的複合物及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物【技術領域】，特別涉及食管癌抗原多肽與熱休克蛋白gp96和HSP78 的複合物以及它們抗食管癌的用途。

【背景技術】
[0002] 食管癌在我國每年發病和死亡人數都佔全球人數一半以上，是最具中國特色的惡 性腫瘤之一，年發病率超過22/10 5。在我國，食管癌以食管鱗癌為主，佔95%以上。由於食 管癌早期症狀不典型，50%的患者在診斷時已為晚期。食管癌手術後仍有近90%的患者術 後復發轉移，術後5年生存率僅維持在30%左右，年死亡率超過16/10 5。
[0003] 化療是常規治療手段,然而食管癌對目前的化療藥物多為中度或低度敏感,加之 食管癌多數為分化程度差異較大的鱗癌細胞，以及抗藥性存在等因素，使食管癌化療效果 較難提高。標準治療方案順鉬聯合5-FU的方案完全緩解也是很少見的，中位緩解時間通常 很短。
[0004] 近年來，靶向治療已成為腫瘤治療熱點。然而由於腫瘤差異性比較大，靶向藥物的 療效不均一，同時，靶向藥物還存在耐藥性的問題，且食管癌發生地多為貧窮地區，靶向藥 物的昂貴費用也讓患者望而卻步。
[0005] 近年來，免疫治療作為第四大腫瘤治療模式已成研究熱點。在臨床上食管鱗癌組 織中檢測到gp96的高表達，表達水平和腫瘤預後呈正相關。小鼠成瘤實驗中也證實在已成 形的鱗狀食管癌細胞系瘤體中注射自體gp96可以明顯減慢腫瘤的生長，gp96可以激起更 強的腫瘤特異性殺傷。我們的臨床試驗也表明食管癌患者皮下免疫自體腫瘤gp96複合物 可以增強患者腫瘤特異性的CTL反應。因此，熱休克蛋白gp96治療食管癌極有可能取得非 常好的療效。
[0006] gp96是熱休克蛋白HSP90家族中的重要成員，主要定位於內質網腔（Endoplasmic Reticulum)，在正常組織和腫瘤中均有廣泛表達。正常情況下gp96在細胞中呈低水平表 達，而熱休克、葡萄糖缺乏、細菌和病毒感染等均可增加其表達。在細胞內gp96作為分子 伴侶蛋白，可阻止蛋白質聚集，協助蛋白質摺疊、伸展、組裝和轉運，抑制錯摺疊蛋白質的分 泌。gp96分子具有多肽結合的能力，能結合5-25個胺基酸的多肽序列。熱休克蛋白HSP78 是細胞質中HSP70家族中的成員，分子量約78kDa。HSP78分子作為分子伴侶能與細胞中各 種短肽結合。
[0007] 在細胞外，gp96可作為呈遞分子將結合的短肽呈遞給I類MHC分子，激活特異性 和記憶性T細胞，引發機體細胞免疫反應。因此HSP本身不具備抗原性，所結合的短肽決定 了複合物的抗原性。gp96還可以活化樹突細胞（DC)促進MHC I類和MHC II類分子以及共 刺激因子的表達，從而提高免疫反應。
[0008] 目前已證實gp96和hsp78分子可以結合多種結合抗原多肽，包括泡狀口炎病毒 抗原區肽、小鼠H-2Kb限制的卵清蛋白抗原表位肽、H-2La限制的白血病表位肽、B肝病毒 抗原肽等。但目前為止未見從食管癌患者腫瘤組織中分離鑑定與HSP結合的抗原多肽。
[0009] 食管癌是嚴重的消化系統惡性腫瘤。前期的動物試驗和臨床試驗顯示，自體gp96 治療食管癌應該會有不錯的效果。然而，由於食管解剖結構的特殊性，組織大小是限於這種 治療方法應用的一個關鍵，同時疫苗製備具有一次性的特點，能夠完成有效療程的患者有 限，gp96免疫治療食管癌仍存在很多不足。


【發明內容】

[0010] 因此，本發明要解決的技術問題是篩選能激活食管癌特異性T細胞的肽段。克服 腫瘤細胞免疫編輯導致的低免疫原性，能夠在健康個體及食管癌患者中誘導產生特異性細 胞毒性T淋巴細胞（殺傷性T細胞，CTL)，而且CTL具有強大的抗食管癌作用，對正常細胞 及組織無破壞作用。
[0011] 本發明的一個目的是提供一種與gp96和HSP78結合的食管癌抗原的複合物。所述 的食管癌抗原可以分別是食管癌腫瘤抗原MAGE-A4蛋白上第49-57位的胺基酸序列，其序 列可以是GTLEEVPAA，或其變異序列；食管癌腫瘤抗原MAGE-A4蛋白上第24-32位的胺基酸 序列，其序列可以是GLVGAQAPT，或其變異序列；食管癌腫瘤抗原MAGE-A4蛋白上第202-210 位的胺基酸序列，其序列可以是LLIIVLGTI，或其變異序列；食管癌腫瘤抗原MAGE-A4蛋 白上第46-54位的胺基酸序列，其序列可以是LVPGTLEEV，或其變異序列；食管癌腫瘤抗原 NY-ES0-1蛋白上第71-79位的胺基酸序列，其序列可以是GLNGCCRCG，或其變異序列；食管 癌腫瘤抗原NY-ES0-1蛋白上第124-132位的胺基酸序列，其序列可以是KEFTVSGNI，或其變 異序列。
[0012] 本發明的複合物既包括熱休克蛋白以非共價鍵與多肽結合，又包括熱休克蛋白以 共價鍵與多肽結合。本發明提供了製備本發明的如上所述抗原多肽與熱休克蛋白gp96和 HSP78的複合物的方法。
[0013] 本發明所訴的表位肽可以單獨或以熱休克蛋白複合物形式在HLA-A2轉基因小鼠 中誘導形成特異性的CTL。
[0014] 本發明所訴的表位肽可以在體外單獨或以熱休克蛋白複合物形式刺激HLA-A2陽 性食管癌患者PBMC分泌IFN- γ，且這種作用在自體gp96免疫後顯著增強。
[0015] 本發明所訴的表位肽可以單獨或以熱休克蛋白複合物形式提高HLA-A2陽性食管 癌患者特異性T細胞反應。
[0016] 本發明所述的特異性CTL的誘導可以被Treg細胞的抑制劑增強。
[0017] 首次從五例食管癌腫瘤組織中與熱休克蛋白gp96結合的多肽中分離出一特異9 肽，經胺基酸序列分析為"GTLEEVPAA"，經查詢發現該序列位於食管癌特異性抗原MAGE-A4 的49-57位，人工合成該序列並與體外表達的gp96蛋白組裝，體外合成gp96-9肽複合物， 將該gp96-9肽複合物免疫HLA-A2轉基因小鼠，能刺激小鼠產生特異性細胞毒性T細胞 (CTL)，且應用調節性T細胞的抑制劑可以增強gp96-9肽複合物的免疫效果2倍以上。實 驗結果表明gp96-9肽複合物可開發成為一種新型食管癌的治療性藥物。
[0018] 附圖簡要說明 圖1.小鼠（BALB/CHLA42+)的特異性CTL反應。以9肽和gp96-9肽複合物按0、1、3周 的周期免疫小鼠，最後一次免疫3天後檢測特異性細胞裂解率。效應細胞CTL對特異性靶 細胞的裂解百分率以4小時標準51Cr釋放法測定，效應細胞與靶細胞之比分別是10、25、50 和100,圖中裂解率為10隻小鼠平均值。
[0019] 圖2. gp96_肽段1免疫的小鼠脾臟淋巴細胞可抑制裸鼠皮下接種的食管癌細胞的 生長。裸鼠皮下接種人食管癌細胞TE-1，荷瘤7天後轉輸不同來源的小鼠脾臟淋巴細胞。 抗原肽1組（n=20)的接受經過gp96-抗原肽1複合物免疫的BALB/c hl^2+小鼠的脾臟淋巴 細胞；無關肽對照組（n=20)接受經過gp96-無關肽（HBcAg 82_9CI)複合物免疫的Balb/c HLA_A2+ 小鼠的脾臟淋巴細胞。
[0020] 圖3.食管癌患者免疫自體腫瘤gp96複合物後9肽特異性T細胞的變化。以IFN- Y 的ELISP0T方法檢測患者外周血中9肽特異性T細胞。無關肽HBcAg82_9(l肽為陰性對照。
[0021]

【具體實施方式】： 下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明並不受其限制。下列實施例中未註明具 體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。
[0022] 實施例1.從食管組織中純化gp96蛋白 將五份食管癌組織和一份正常食管組織勻漿後離心，用30%/70%飽和度（NH4)2SO 3沉 澱，沉澱溶解後採用ConA Sepharose (GE公司）進行親和層析，用8%的α -甲基葡萄糖苷 洗脫結合的蛋白，糖苷洗脫液以Hitrap-Q (GE公司層析系統）進行陰離子層析，經過這三 步純化獲得>95%純度的gp96蛋白。gp96蛋白用gp96/grp94單克隆抗體（Santa Cruz公 司）進行Western鑑定。其純度用SDS-PAGE、銀染和反相HPLC鑑定。
[0023] 實施例2.從gp96蛋白釋放非共價結合的多肽 將純化的gp96蛋白加入三氟乙酸（TFA)使其終濃度達到0. 2% (pH約2. 0)，然後用超 濾法（分子截留為30 kDa，Millipore公司）分離多肽，將多肽混合物進行MALDI-T0F質 譜（ABI 4700)分析，多肽分子量大多在600-1200 Da之間。
[0024] 實施例3.反相HPLC分析多肽 多肽混合物凍幹後溶於溶液A(0. 065% TFA，2%乙腈)，反相層析柱C18上樣（S^hasil p印tideC18;5um粒度；4·6 X 250mm，GE公司），從0至65%溶液B(0·05%TFA，100%乙 腈）進行梯度洗脫，流速為I mL/min，用214nm波長檢測。比較腫瘤組織和正常組織HPLC 圖譜，發現一個五份食管癌組織共有而正常食管組織中沒有的肽峰。
[0025] 實施例4.多肽微量測序與序列分析 收集該特異肽峰用MALDI-T0F質譜（ABI公司4700系統）鑑定其純度，只發現分子量 為885 Da的單一峰。對該肽微量測序（Procise 491.蛋白測序儀，ABI公司），其胺基酸序 列為"GTLEEVPAA"，5份腫瘤組織得到的序列一致。在蛋白資料庫中查詢該序列（NCBI)，發 現它位於MAGE-A4蛋白的49-57位。
[0026] 實施例5. gp96蛋白與人工合成的多肽體外快速組裝 人工合成9肽"GTLEEVPAA"（委託吉爾生化有限公司合成），將gp96蛋白與多肽進行 體外組裝，體外結合反應體系： 2.7 mmol/L KC1,1. 47 mmol/L KH2PO4,8. I mmol/L Na2HPO4,138mmol/L NaCl, 10%(V/V) 甘油，3. 0 mmol/L 9肽，0. 421 mmol/L gp96蛋白，60°C反應10分鐘，超濾法（截留分子量 30 kDa，Millipore公司）去除未結合的多肽。
[0027] 實施例6表達食管癌抗原肽1和熱休克蛋白gp96的融合蛋白 本實例提供了食管癌抗原肽I (GTLEEVPAA)與熱休克蛋白gp96以共價鍵形成的融合 蛋白的方法。我們人工合成對應於該肽的核酸序列（GGT ACT CTT GAG GAG GTT CCA GCT GCT)，引入限制性酶切位點Bgl II將該9肽的核酸序列與gp96基因5'端用T4連接酶 連接，連接產物的5'和3'端引入2個限制性酶切位點EcoR I和Xho I，連接到表達載體 pPICZ a A中在畢赤酵母中分泌表達，表達產物是gp96與該9肽的融合蛋白。
[0028] 實施例7.免疫小鼠 選用生長8-10周的HLA-A2轉基因的BALB/c小鼠（HLA-A2+)用於本實驗。
[0029] 免疫方式採用將樣品溶於IOOuL的PBS中頸背皮下注射。皮下注射操作相對簡單， 要求免疫劑量適中，故採用該種免疫方式。同時在每次免疫前1天腹腔注射0.4 mg的環磷 醯胺。低劑量環磷醯胺可以抑制在gp96免疫中起抑制作用的Treg細胞從而能增強免疫效 果。
[0030] gp96蛋白-9肽複合物的最適免疫劑量為0. I nmol。
[0031] 免疫時間為〇、1、3周進行三次的強化免疫，優於免疫一次或二次的效果。
[0032] 因此採用皮下注射免疫，將9肽溶於緩衝液（90% PBS 10% DMSO 0. 1% TFA) gp96-9肽複合物溶於PBS中，注射前劇烈振蕩1分鐘，每隻小鼠免疫劑量9肽分別為0. 2 nmol，2 nmol和20 nmol，將肽與弗氏佐劑乳化後免疫小鼠。gp96-9肽複合物免疫劑量分 別是0. 01 nmol,0. 05 nmol, 0. 10 nmol和0. 50 nmol,米用頸背皮下注射，第一次免疫1周 後進行第二次免疫，2周後加強免疫，3天後進行細胞毒性分析。每一處理使用10隻小鼠。
[0033] 實施例8.細胞毒性（CTL)分析 小鼠加強免疫3天後，從每隻小鼠收穫得約3 X IO7脾細胞懸於含有10 mM HEPES緩衝 液，抗生素和10% (V/V) FCS培養液中，於培養瓶中與經幅射（4500 Rad)的T2細胞（3:1) 和lug/mL肽在完全培養基中37°C培養。6天後收集脾細胞進行4小時標準51Cr釋放實驗 (具體方法見Kuhrober, A, et al. 1997. Internationallmmunology, 9(8):1203-1212) 測定細胞毒性活性。簡而言之，靶細胞用10ug/mL抗原肽或無關肽於37°C致敏30分鐘後加 入不同數量的效應細胞，反應體系為100 uL的完全培養基。37°C共培養4小時後收集上清 測定特異裂解率。
[0034] 從51Cr釋放實驗可以看出gp96_9肽複合物可刺激小鼠產生特異性細胞毒性T細 胞，每隻小鼠免疫〇. I nmol (約IOug)的gp96-9肽複合物即能誘發機體產生強烈的細胞免 疫反應，細胞毒性測定靶細胞的裂解率在50%以上，通過注射環磷醯胺的預處理可以明顯 的提高gp96-9肽複合物的免疫效果，且這種細胞毒效應是表位肽特異性的（圖1)。實驗結 果表明gp96-9肽複合物可開發成為一種新型食管癌的治療藥物。
[0035] 實施例9細胞轉輸體內抑瘤實驗 以gp96-食管癌抗原肽1免疫HLA-A2轉基因小鼠獲得抗原肽1特異性的脾臟淋巴細 胞。將獲得的淋巴細胞轉輸TE-I皮下接種14天的裸鼠作為實驗組（?) (n=20);對照組的 裸鼠傳輸的是免疫gp96-無關肽的小鼠淋巴細胞（) (n=20)，每周轉輸一次，共3周。檢 測腫瘤大小，如圖所示轉輸gp96-食管癌抗原肽1複合物免疫小鼠的淋巴細胞可明顯抑制 人食管癌細胞的生長（圖2)。
[0036] 實施例10食管癌患者免疫自體gp96複合物治療腫瘤 該研究中入組的gp96免疫治療的食管癌患者需完成6個療程的治療。一周為一個療 程,每個療程注射一次。試驗組在術後8周內開始自體gp96免疫治療。
[0037] 操作流程 選取計劃行手術的II、III期食管癌患者或II、III A期肺癌患者； 獲得患者自願籤署的"知情同意書"以及"手術同意書"； 行術前全面檢查以明確根治性手術可行性； 手術切取腫瘤組織； a) 將組織存放於無菌管中； b) 存有腫瘤組織的無菌管在0°C條件下於2個小時內送至GMP製備車間。
[0038] 鑑定腫瘤組織質量，確認可以提取足量的熱休克蛋白gp96_多肽複合物； 熱休克蛋白gp96-多肽複合物提取及檢測； gp96治療及常規治療； 熱休克蛋白gp96-多肽複合物皮下注射流程： a)第1次注射前3天內需檢查血常規、血生化及心電圖。
[0039] b)注射預處理：每次gp96注射前1-3天給患者靜脈注射環磷醯胺。
[0040] C)由研究護士進行gp96蛋白注射，根據既往國外研究資料制定劑量，加入生理鹽 水混勻後上臂及大腿左右皮下注射，每周1次，共8次。
[0041] d)第1、2次免疫蛋白注射後，需留院觀察24小時，後幾次注射後需觀察1小時，無 不良反應後方可離開。
[0042] e)第2次及第8次注射後3天內需檢查血常規、血生化及心電圖。
[0043] f)免疫治療前及免疫結束後,採集IOml患者血液,進行免疫學指標的測定。
[0044] 若患者治療期間疾病復發，由研究者詳實記錄患者疾病復發情況，並按照臨床診 療規範給予相應治療； 隨訪； 術後2年內每3月訪視1次，2年後每6月訪視1次，直至患者疾病復發或死亡，具體訪 視內容如下： ①2年內每3個月複查1次： a)第3、9、15、21月複查內容： 腫瘤標誌物（CA19-9、CEA、P53、SCG); 食道X線鋇透； 胸部X線正側位片； 腹部B超。
[0045] b)第 6、12、18、24 月複查內容： 腫瘤標誌物（CA19-9、CEA、P53、SCG); 胸、腹部CT ; 胃鏡。
[0046] ②2年後每6個月複查1次，複查內容： 腫瘤標誌物（CA19-9、CEA、P53、SCG); 胸、腹部CT ; 胃鏡。
[0047] 若患者隨訪期間疾病復發，由研究者詳實記錄患者疾病復發情況，並按照臨床診 療規範(如NCCN指南等）給予相應治療。
[0048] 實施例11 ELISP0T法檢測特異性T細胞 ELISP0T檢測食管癌患者PBMC中表位特異性CTL。按照ELISP0T試劑盒的說明書操 作.先用含10%胎牛血清的PRMI 1640培養基封閉ELISP0T預包被板一小時，臨用前倒掉 封閉液，加入IOOuL含I X IO5的人的PBMC (直接用新鮮的PBMC或者將PBMC體外擴增培 養7天)。實驗組中加入10ug/mL的9肽、陽性對照加入4ug/mL的PHA進行刺激，陰性對照 加入無關肽。在細胞培養箱內培養26-36小時後，檢測特異性斑點的形成，並進行統計分 析。我們選取HLA-A2陽性的食管癌患者作為研究組，通過ELISP0T方法檢測患者新鮮血液 中表位特異性CTL，特異性CTL的頻率通過計數斑點數量來確定。在4例經自體gp96複合 物免疫的HLA-A2陽性食管癌患者中均檢測到高頻率的GTLEEVPAA特異性CTL，且比免疫前 有顯著的提高，同時並沒有檢測到無關肽HBcAg 82_9(l(陰性對照)特異性T細胞，說明ELISP0T 結果是表位特異的（圖3)。
[0049] 實施例12其它gp96_多肽複合物的免疫活性測定 除上述抗原9肽之外，我們又選取其它4個食管癌抗原多肽與gp96體外組裝並測定 其免疫活性，這4個抗原多肽分別是I) MAGE-A4抗原多肽"GLVGAQAPT"，2)MAGE-A4抗原多 肽"LLIIVLG?T'，3)MAGE-A4抗原多肽"LVPGTLEEV"，4)NY-ES0-1抗原多肽"GLNGCCRCG"，5) NY-ESO-I 抗原多肽 "KEFTVSGNI"。
[0050] 分別人工合成這5種多肽，採用實施例5中所述的反應體系在體外與gp96結合， 這5種多肽與gp96均有較高的親和力，通過測定結合反應平衡常數K，5種肽與gp96結合 反應中K值均在5. 5以上。採用實施例7中所述的方法用上述5種食管癌抗原多肽與gp96 形成的複合物，和上述gp96與5種食管癌抗原多肽的融合蛋白分別免疫小鼠，並採用實施 例7中所述的方法分別對這5種複合物進行CTL分析，從 51Cr釋放實驗可以看出這5種食 管癌抗原多肽與gp96形成的複合物均可刺激HLA-A2轉基因小鼠產生特異性細胞毒性T細 胞。每隻小鼠免疫劑量為0.1 nmol (約IOug)時即能誘發機體產生強烈的細胞免疫反應， 通過對這5種多肽與gp96形成的複合物的細胞毒性測定發現靶細胞的裂解率在60%-75% 之間。調節性T細胞抑制劑的應用可以增強複合物的免疫效果。採用實施例9的方法表明 這5種肽與gp96形成的複合物免疫在體內也可以抑制食管癌細胞的生長。
[0051] 以上實驗結果表明gp96與食管癌抗原多肽體外組裝合成的複合物可開發成為一 種新型食管癌的治療或預防藥物。由於實驗條件所限本發明專利不可能對每一種食管癌抗 原多肽進行體外組裝及免疫活性測定，但我們通過選取6種有代表性的腫瘤抗原肽作研究 對象，在體外與gp96結合併進行免疫活性測定，大量實驗表明gp96與這些抗原多肽形成的 複合物均能刺激小鼠產生強烈的免疫反應，可開發成為一種新型治療疫苗。因此，除上述6 種抗原多肽之外，其它任何食管癌抗原多肽與gp96結合作為新型疫苗也應當在本發明的 保護範圍之內。
[0052] 實施例13. HSP78-多肽免疫原性測定 將HSP78與6種多肽體外組裝形成的複合物，反應體系同gp96 (見實施例5)，將體外 合成的複合物和HSP78與6種多肽的融合蛋白（見實施例6)免疫小鼠。小鼠免疫方式、免 疫劑量以及免疫程序同gp96(見實施例7)細胞毒性（CTL)分析方法同gp96 (見實施例 8)。從51Cr釋放實驗可以看出HSP78-9肽複合物可刺激小鼠產生特異性細胞毒性T細胞， HSP78-9肽複合物的免疫原性為單獨9肽的120倍以上，每隻小鼠免疫0. I nmol (約IOug) 即能誘發機體產生強烈的細胞免疫反應，細胞毒性測定靶細胞的裂解率在50%以上。實驗 表明HSP78-9肽複合物可開發成為一種新型食管癌的治療藥物。
【權利要求】
1. 一種與熱休克蛋白結合的表位肽GTLEEVPAA，其特徵在於，其胺基酸序列如序列表 中 SEQ ID NO. 1 所示。
2. -種與熱休克蛋白結合的表位肽GLVGAQAPT，其特徵在於，其胺基酸序列如序列表 中 SEQ ID NO. 2 所示。
3. -種與熱休克蛋白結合的表位肽LLIIVLGTI，其特徵在於，其胺基酸序列如序列表 中 SEQ ID NO. 3 所示。
4. 一種與熱休克蛋白結合的表位肽LVPGTLEEV，其特徵在於，其胺基酸序列如序列表 中 SEQ ID NO. 4 所示。
5. -種與熱休克蛋白結合的表位肽GLNGCCRCG，其特徵在於，其胺基酸序列如序列表 中 SEQ ID NO. 5 所示。
6. -種與熱休克蛋白結合的表位肽KEFTVSGNI，其特徵在於，其胺基酸序列如序列表 中 SEQ ID NO. 6 所示。
7. 如權利要求1-6任一項所述的表位肽與gp96或HSP78的共價或非共價連接的複合 物。
8. 如權利要求1-6任一項所述的表位肽在體外單獨或與熱休克蛋白形成如權利要求7 所述的複合物單獨或共同免疫人體誘導生成殺傷性T細胞中的用途。
9. 如權利要8所述的免疫誘導殺傷性T細胞在預防或治療食管癌中的用途。
【文檔編號】C07K7/06GK104211773SQ201310694022
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年12月18日 優先權日:2013年12月18日
【發明者】黃錫堅, 張小俊 申請人:深圳市康爾諾生物技術有限公司